本發(fā)明涉及生物技術(shù)及食品化工領(lǐng)域，尤其涉及蔗糖合成酶基因表達(dá)的畢赤酵母工程菌以及重組畢赤酵母在催化合成萊鮑迪苷a中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甜菊糖(steviolglycoside)是一種具有很多優(yōu)良特性的高甜度天然甜味劑，在食品、飲料、釀酒、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域均有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。甜菊糖帶有后苦味和甘草異味，混合物組分復(fù)雜，難以對其質(zhì)量規(guī)格進(jìn)行統(tǒng)一，限制其應(yīng)用。甜菊苷(stevioside)和萊鮑迪苷a(rebaudiosidea)是甜菊糖中含量最豐富的兩種成分，分別占干葉重的5-10％和2-4％。萊鮑迪苷a(ra)是一種無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜昧劑，其甜度是蔗糖的150-300倍，熱值僅為蔗糖的1/300，而且口味純正，沒有后苦味；因而具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。目前制備高純度萊鮑迪苷a產(chǎn)品的方法有：培育高產(chǎn)萊鮑迪苷a的甜葉菊品種、樹脂吸附或重結(jié)晶提純?nèi)R鮑迪苷a、環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶等酶對甜菊糖進(jìn)行改性。但都存在工藝繁瑣、成本高、效果不佳等缺點(diǎn)。因此，建立一種高效合成萊胞迪苷a的方法十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中不足，提供一種表達(dá)蔗糖合成酶sus1的重組畢赤酵母工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題還在于將共表達(dá)蔗糖合成酶sus1的重組畢赤酵母工程菌作為全細(xì)胞催化劑用于合成萊鮑迪苷a。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種重組畢赤酵母工程菌，所述重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源dna序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母而獲得：

所述外源dna為編碼蔗糖合成酶sus1的dna序列，所述蔗糖合成酶sus1的氨基酸序列如seqno.1所示。所述外源dna序列如seqno.2所示。

其中，所述表達(dá)載體為將所述外源dna克隆至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體ppicza，得到的胞內(nèi)表達(dá)載體ppicza-sus1。

優(yōu)選地，所述重組畢赤酵母工程菌是所述胞內(nèi)表達(dá)載體ppicza-sus1線性化后轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母而得。

另外，本發(fā)明還提供了一種全細(xì)胞催化劑，包含本發(fā)明的重組畢赤酵母工程菌。

優(yōu)選地，所述全細(xì)胞催化劑是通過如下步驟制備而成：

所述全細(xì)胞催化劑是通過如下步驟制備而成：

挑取重組畢赤酵母工程菌接種到bmgy培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)至od600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞重懸到bmmy培養(yǎng)基至起始o(jì)d600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加終濃度1％甲醇；發(fā)酵3天后在6000rpm，4℃離心5min回收菌體；凍干后即為重組畢赤酵母全細(xì)胞催化劑。

另外，本發(fā)明還提供了一種萊鮑迪苷a的合成方法，該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以上述方案中的全細(xì)胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷a。

優(yōu)選地，該方法包括如下步驟：

包括如下步驟：

(1)按如下組分及其濃度制備反應(yīng)體系；

50mmpbs緩沖液，

3mmmgcl2，

50mm蔗糖，

1mmudp，

10mg/ml甜菊苷；

(2)加入菌體量為30od重組畢赤酵母與30od菌體量的全細(xì)胞催化劑，于37℃進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)12h后停止反應(yīng)；

(3)將反應(yīng)液稀釋5倍后，用0.2um水系尼龍膜過濾后用液相色譜檢測ra的合成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：構(gòu)建得到的重組畢赤酵母工程菌能實(shí)現(xiàn)sus1的胞內(nèi)表達(dá)；發(fā)酵獲得的全細(xì)胞催化劑可與表面展示ugt76g1菌株聯(lián)合催化合成ra，ra產(chǎn)量達(dá)到2.2mg/ml。不僅提高了萊鮑迪苷a(ra)的合成效率和原料使用率、節(jié)約生產(chǎn)成本，并為萊鮑迪苷a(ra)的生產(chǎn)加工開辟新的工業(yè)化途徑。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施方式，任何在本發(fā)明基本精神上的改進(jìn)或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書中所要求保護(hù)的范圍。

附圖說明

圖1為重組畢赤酵母全細(xì)胞催化劑合成ra。a、b分別為反應(yīng)前后的液相色譜檢測結(jié)果。st和ra的出峰時間分別為10.1min和10.8min左右。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

基因sus1的合成

以ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的氨基酸序列為基礎(chǔ)，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的sus1基因，其序列分別如seqno.2示，通過生物技術(shù)公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)進(jìn)行全基因合成，合成的基因克隆在puc57質(zhì)粒(購自金斯瑞生物科技公司)上，得到質(zhì)粒puc57-sus1。

實(shí)施例2

胞內(nèi)表達(dá)載體ppicza-sus1的構(gòu)建

根據(jù)sus1基因序列設(shè)計(jì)正向引物sf(含ecori酶切位點(diǎn))和反向引物sr(含noti酶切位點(diǎn))。以實(shí)施例1中的質(zhì)粒puc57-sus1為模板，sf和sr為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。將膠回收純化后的pcr產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ecori和noti進(jìn)行雙酶切，與同樣經(jīng)過ecori和noti雙酶切的質(zhì)粒ppicza用t4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化e.colitop10(購自美國invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司)，經(jīng)博萊霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)ecori和noti雙酶切鑒定正確后，得到胞內(nèi)表達(dá)載體ppicza-sus1。含有重組質(zhì)粒ppicza-sus1的克隆菌株e.colitop10/ppicza-sus1加15％甘油于-80℃保存。

實(shí)施例3

重組畢赤酵母工程菌gs115/9k/ppicza-sus1的構(gòu)建及全細(xì)胞催化劑的獲得

將空載體ppic9k經(jīng)mssi單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化并純化后電轉(zhuǎn)化pichiapastorisgs115(購自美國invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司)感受態(tài)細(xì)胞，并在卡那霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；將胞內(nèi)表達(dá)載體ppicza-sus1經(jīng)mssi單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化并純化后電轉(zhuǎn)化上述重組畢赤酵母，并在博來霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子；進(jìn)而得到重組畢赤酵母工程菌gs115/9k/ppicza-sus1。

挑取上述重組畢赤酵母工程菌gs115/9k/ppicza-sus1接種至bmgy培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)至od600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞重懸到bmmy培養(yǎng)基至起始o(jì)d600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加終濃度1％甲醇。發(fā)酵3天后在6000rpm，4℃離心5min回收菌體；菌體凍干后即得到重組畢赤酵母全細(xì)胞催化劑。

實(shí)施例4

重組畢赤酵母全細(xì)胞催化劑合成萊胞迪苷a

200ul反應(yīng)體系包含以下成分：50mmpbs緩沖液，3mmmgcl2，50mm蔗糖，1mmudp，10mg/mlst(甜菊苷)。加入菌體量為30od重組畢赤酵母與30od菌體量的全細(xì)胞催化劑，于37℃進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)12h后停止反應(yīng)。將反應(yīng)液稀釋5倍后，用0.2um水系尼龍膜過濾后用液相色譜檢測ra的合成。

甜菊苷(st)和萊鮑迪苷a(ra)的出峰時間為10.1min和10.8min左右。由圖1可知，反應(yīng)12h后st被消耗，同時生成ra。實(shí)驗(yàn)表明sus1在重組酵母胞內(nèi)活性表達(dá)，反應(yīng)物蔗糖和udp進(jìn)入細(xì)胞后在sus1的作用下生成udpg和果糖。生成的udpg從胞內(nèi)運(yùn)出，在表面展示ugt76g1的畢赤酵母催化下與st反應(yīng)生成產(chǎn)物ra。ra產(chǎn)量達(dá)到2.2mg/ml。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>廣州康琳奈生物科技有限公司

<120>一種重組畢赤酵母工程菌、全細(xì)胞催化劑及萊鮑迪苷a的合成方法

<160>2

<210>1

<211>808

<212>prt

<400>1

manaermitrvhsqrerlnetlvsernevlallsrveakgkgilqqnqiiaefealpeqtrkkleggpffdllkstqeaivlppwvalavrprpgvweylrvnlhalvveelqpaeflhfkeelvdgvkngnftleldfepfnasiprptlhkyigngvdflnrhlsaklfhdkesllpllkflrlhshqgknlmlsekiqnlntlqhtlrkaeeylaelksetlyeefeakfeeiglergwgdnaervldmirllldlleapdpctletflgrvpmvfnvvilsphgyfaqdnvlgypdtggqvvyildqvraleiemlqrikqqglnikprililtrllpdavgttcgerlervydseycdilrvpfrtekgivrkwisrfevwpyletytedaavelskelngkpdliignysdgnlvasllahklgvtqctiahalektkypdsdiywkklddkyhfscqftadifamnhtdfiitstfqeiagsketvgqyeshtaftlpglyrvvhgidvfdpkfnivspgadmsiyfpyteekrrltkfhseieellysdvenkehlcvlkdkkkpilftmarldrvknlsglvewygkntrlrelanlvvvggdrrkeskdneekaemkkmydlieeyklngqfrwissqmdrvrngelyryicdtkgafvqpalyeafgltvveamtcglptfatckggpaeiivhgksgfhidpyhgdqaadtladfftkckedpshwdeiskgglqrieekytwqiysqrlltltgvygfwkhvsnldrlearrylemfyalkyrplaqavplaqdd

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