本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及木霉菌株。

背景技術(shù)：

互葉白千層枝葉提煉的茶樹精油(以下簡稱：精油)是一種廣譜的殺菌劑，具有抑菌、環(huán)保、溫和天然清香、無污染無腐蝕、滲透性和生物降解力強等特性，被廣泛應(yīng)用化妝、醫(yī)藥、食品等行業(yè)，具有較高經(jīng)濟價值。從互葉白千層中篩選耐受內(nèi)生真菌后，通過與精油敏感型菌株進行比較基因組學(xué)研究，有助于揭示精油殺菌機理，有望今后對內(nèi)生抗性菌株進行基因挖掘與改造，從而提高殺菌效果和產(chǎn)精油量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高耐受茶樹精油的康寧木霉tk13。

本發(fā)明康寧木霉tk13(trichodermakonigiitk13)，屬于半知菌門，絲孢目，木霉屬。于2016年10月8日保藏于中國武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：cctccm2016544。

本發(fā)明菌株在pda平板上生長迅速，在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d即產(chǎn)孢，3d菌落直徑能夠達到8cm。(詳見圖1：菌株ml10在pda平板形態(tài)與分生孢子形態(tài))。

(1lpda培養(yǎng)基配制方法：稱取去皮土豆200g，切成小塊放到800ml水中煮30min,3層紗布過濾，取液體，加入20g葡萄糖，溶解，加入瓊脂粉14g，定容至1l。)

本發(fā)明菌株對茶樹精油有明顯抗性：(1)能夠在含0.2％茶樹精油的pda平板上生長。對精油耐受的ic50達到3μl/ml。(2)在含有0.1％茶樹精油的培養(yǎng)基上生長速度，能夠達到對照的90％(對照為空白對照，即未加精油)。這一發(fā)現(xiàn)對進一步研究茶樹精油的抑菌機理有重要參考價值。該菌株具有非常好的進一步開發(fā)利用前景。

附圖說明

圖1康寧木霉tk13在pda平板形態(tài)(a)與分生孢子形態(tài)(b)(b中標尺為5μm)

圖2康寧木霉tk13對不同濃度的精油耐受的能力

注：ck為對照組，即未加精油組，1為0.55ul/ml，2為1.10ul/ml，3為1.65ul/ml，4為2.20ul/ml

圖3碳源對康寧木霉tk13耐受精油能力的影響

圖4氮源對康寧木霉tk13耐受精油能力的影響

圖5ph對康寧木霉tk13耐受精油能力的影響

圖6自提精油與市售精油對內(nèi)生真菌耐受能力的影響

具體實施方式

實施例1：互葉白千層內(nèi)生真菌康寧木霉tk13分離純化與鑒定

分別取互葉白千層(采自江西省撫州市)的根、莖、葉部位，用清水洗凈后置于紗布上晾干；在無菌操作臺上，將根、莖、葉浸沒于裝有20％次氯酸鈉的培養(yǎng)皿中2min，然后轉(zhuǎn)移至無菌水中漂洗1min，再轉(zhuǎn)至70％酒精30s，最后無菌水漂洗1min；表面消毒處理后的樣品轉(zhuǎn)至無菌濾紙，吸干水分后剪成1立方厘米大小的組織塊，接種于含抗生素的孟加拉紅培養(yǎng)基上，每皿間隔放置10個樣品，28℃倒置培養(yǎng)，及時將生長的菌轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基。

孟加拉紅培養(yǎng)基：1l體系，蛋白胨5.0g，kh2po4·3h2o1.0g，mgso4·7h2o0.5g，葡萄糖10.0g，瓊脂粉15g，濃度1％的孟加拉紅溶液3.3ml。

實施例2：互葉白千層內(nèi)生真菌中耐精油菌株的篩選

茶樹精油用乙醇稀釋到0.1％(v/v)的濃度后，取200μl涂布于pda平板(直徑8.5cm)，晾干10min后，接種內(nèi)生真菌菌餅(直徑0.5cm)，每皿接5個，重復(fù)三次，28℃倒置培養(yǎng)，及時測量菌落直徑，以甲醇作為空白對照。結(jié)果表明(表1)：康寧木霉tk13抗性最強。生長4d后可以達到5.3cm，明顯高于pda平板上生長的其它4株常規(guī)菌株(p<0.05)。經(jīng)測定，抗性比常規(guī)木霉有顯著優(yōu)勢。

表1互葉白千層內(nèi)生真菌耐精油菌株篩選

可見本發(fā)明tk13相比常規(guī)木霉具有很強的抗茶樹精油能力。

實施例3：tk13菌株測序與比對

tk13經(jīng)測序，its序列：

tgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagccccggaccaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggttttttactatctgagccatctcggcgcccctcgtgggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggccctttacggggccggccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccgttaaacaccccaaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcata

通過ncbi比對后，發(fā)現(xiàn)tk13菌株與ncbi庫存中現(xiàn)有康寧木霉序列99％高度同源。通過測序與比對發(fā)現(xiàn)，本研究自松油醇-4型互葉白千層根部分離純化出的內(nèi)生真菌(康寧木霉tk13)，屬于半知菌門-絲孢目-木霉屬的康寧木霉的一個新菌株，展示出了非常強的精油耐受能力。

實施例4：康寧木霉tk13對精油耐受能力測定

分別設(shè)置精油的終濃度從0.55、1.10、1.65、2.20、2.75μl/ml，以空白乙醇為對照，測定菌對精油的耐受能力。結(jié)果表明(見圖2)：本發(fā)明康寧木霉tk13菌株對精油的耐受的ic50可達到0.6μl/ml。

后期實驗將選用0.6μl/ml(ic50)精油濃度展開。

實施例5：不同培養(yǎng)基對康寧木霉tk13耐受精油的影響分析

1)碳源優(yōu)化對康寧木霉tk13耐受精油的影響

分別測定了9種碳源對菌株耐受精油的影響，結(jié)果表明，蔗糖為碳源時，菌株在不含精油的培養(yǎng)基上生長較快，而且對精油的抗性最好。故選擇蔗糖為碳源(見圖3)。

2)氮源優(yōu)化對康寧木霉tk13耐受精油的影響

分別測定了6種氮源對菌株耐受精油的影響，結(jié)果表明，酪蛋白為最佳氮源(見圖4)。

3)ph值對康寧木霉tk13耐受精油的影響(見圖5)

隨著ph增大，對耐受精油康寧木霉tk13的影響不明顯，但對非耐受精油菌株的影響明顯。

實施例6：兩種精油的成份分析及其對木霉菌株耐受能力的影響分析

首先，以市售“thebodyshop茶樹精油”(購于英國,由thebodyshopinternationalpic生產(chǎn)的)(以下簡稱：新精油)為參照，對比分析本研究自己提取的精油成份(以下簡稱：原精油)。

分析：1)本研究采用蒸餾法提取互葉白千層茶樹精油；

2)本研究采用agilent6890n/5973i型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gaschromatograph-massspectrometer,gc-ms)分別對兩種精油進行化學(xué)成分分析，并進行比較。

結(jié)論：1)4-松油醇和桉葉油素是茶樹精油的主要成分；

2)自提精油的4-松油醇含量是25.46％(符合標準)，比市售精油少40.67％；自提精油的桉葉油素的含量是11.24％(符合標準)，比市售精油少488.48％。

其次，兩種精油對木霉菌株耐受能力的影響分析(見圖6)：

以兩種耐受精油的木霉菌株w003和93-3為研究對象，結(jié)果表明：我們自提精油雖然在主要成分4-松油醇含量上沒有市售產(chǎn)品高，但是抑菌效果明顯高于它，具體機理有待于進一步研究。

sequencelisting

<110>南昌師范學(xué)院

<120>一株高耐受茶樹精油的康寧木霉tk13

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>585

<212>dna

<213>trichodermakoningii

<400>1

tgcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactg60

ttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagccccggaccaaggcgcccgccgg120

aggaccaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggttttttactatctgagccatc180

tcggcgcccctcgtgggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttgg240

ttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcag300

tgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgt360

ccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggcccttt420

acggggccggccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagttt480

gcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccgttaaacaccccaaacttctgaaa540

tgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcata585