本發(fā)明屬于圖案化細(xì)胞培養(yǎng)基底制造領(lǐng)域，具體涉及一種可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞與材料相互作用是生物材料領(lǐng)域的重大基本科學(xué)問題。20世紀(jì)70年代，用于生物分子和細(xì)胞的圖案化技術(shù)已開始出現(xiàn)。人們發(fā)現(xiàn)基底的形貌和物理性質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生很大的影響，例如周期型結(jié)構(gòu)圖案可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)基底的粘附性。而且大部分高等動(dòng)物細(xì)胞(除血球細(xì)胞等少數(shù)幾種細(xì)胞)都是貼壁生長(zhǎng)的，這為圖案化技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。隨著原子力顯微鏡的發(fā)展，人們對(duì)細(xì)胞操縱的技術(shù)越來越成熟，圖案化能將細(xì)胞精確定位在表面，進(jìn)行更精準(zhǔn)的測(cè)量。而且這也在很大程度上促進(jìn)細(xì)胞傳感器和分子傳感器的發(fā)展。

金的單質(zhì)在室溫下為固體，密度高、柔軟、光亮、抗腐蝕。常溫下金有十分高的電傳導(dǎo)性，所以被用作含高電流的電線(雖然以相同容量計(jì)算銀比金有更高的電傳導(dǎo)性，但金有抗侵蝕的優(yōu)點(diǎn))。金屬狀態(tài)的金對(duì)所有體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)呈現(xiàn)惰性反應(yīng)，因此金也是良好的生物相容性材料，細(xì)胞可以在金上面生長(zhǎng)。金是常用作細(xì)胞電信號(hào)測(cè)量的傳導(dǎo)材料，它能準(zhǔn)確傳輸受刺激細(xì)胞膜電位的變化并且沒有毒性，如應(yīng)用于微電極陣列，膜片鉗等。

目前，制備功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底方法主要有表面修飾方法、電化學(xué)法、自組裝法、激光干涉光刻法等。表面修飾方法雖然應(yīng)用比較廣泛，但設(shè)備比較昂貴。電化學(xué)法和自組裝法雖然價(jià)格相對(duì)有優(yōu)勢(shì)，但工藝復(fù)雜，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術(shù)解決問題：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底及制備方法和應(yīng)用，具有可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底，且工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，靈活性高，制備單個(gè)基底的耗時(shí)短，利用激光干涉光刻方法制備的基底適合產(chǎn)業(yè)化。

本發(fā)明技術(shù)解決方案：一種可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底，所述基底表面是多周期性孔型團(tuán)簇圖案，團(tuán)簇圖案為微米級(jí)周期性孔陣結(jié)構(gòu)，即一級(jí)孔陣，團(tuán)簇中存在納米級(jí)周期性孔陣結(jié)構(gòu)，即二級(jí)孔陣，該圖案結(jié)構(gòu)由六光束激光干涉系統(tǒng)制備獲得。一級(jí)孔陣和二級(jí)孔陣周期性結(jié)構(gòu)之間互不相接；一級(jí)孔陣中每個(gè)團(tuán)簇直徑為3μm至20μm，根據(jù)細(xì)胞具體尺寸確定團(tuán)簇直徑，即大于一個(gè)待測(cè)細(xì)胞的直徑大小，小于兩個(gè)待測(cè)細(xì)胞直徑的大小，保證每個(gè)團(tuán)簇中只生長(zhǎng)一個(gè)細(xì)胞。

應(yīng)用時(shí)，可定位操控與電位測(cè)量方法為：在一級(jí)孔陣中滴入表面修飾材料，并將其置于含有細(xì)胞的培養(yǎng)液中，表面修飾材料將引導(dǎo)細(xì)胞在一級(jí)孔陣中定位生長(zhǎng)；二級(jí)孔陣中金膜和石英基底的交替結(jié)構(gòu)以及孔陣間的凸起能夠改變細(xì)胞在該培養(yǎng)基底上的形貌，即改變細(xì)胞與基底接觸面積，從而實(shí)現(xiàn)基底對(duì)細(xì)胞的粘附性的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)操縱細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)、平移；利用afm(原子力顯微鏡)探針在該可定位操控與電位測(cè)量功能化培養(yǎng)基底上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定位操控，全面觀察細(xì)胞在外界不同刺激時(shí)的形貌變化；當(dāng)可興奮細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，產(chǎn)生的電位可由團(tuán)簇及孔陣間連接的金膜作為導(dǎo)電電極導(dǎo)出，實(shí)現(xiàn)探測(cè)單個(gè)可興奮細(xì)胞受不同種刺激時(shí)產(chǎn)生的電流大小。

利用六光束激光干涉光刻方法制備該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底時(shí)，采用短波長(zhǎng)、能量調(diào)控的曝光方式對(duì)鍍過膜后的基底進(jìn)行直接激光干涉光刻以達(dá)到減小二級(jí)孔陣中納米孔的直徑目的，保證二級(jí)孔陣中納米孔之間彼此分離，實(shí)現(xiàn)二級(jí)孔陣對(duì)細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)的功能。

在絕緣的石英片上鍍10nm的鈦膜作為粘合層，在鈦膜上鍍50nm-200nm的金膜，鈦膜和金膜同時(shí)被打穿，露出石英基底，二級(jí)孔陣之間仍然由鈦膜上面鍍金膜的雙層金屬膜連接，一級(jí)孔陣之間也由鈦膜上面鍍金膜的雙層金屬膜連接。

該可定位操控與電位測(cè)量功能化培養(yǎng)基底制備工藝如下：

(1)基底清洗與鍍膜

將表面積為1cm²的石英片依次置入丙酮、酒精、去離子水中各超聲清洗5min，將清洗過的石英片放入等離子體濺射鍍膜機(jī)中，依次鍍鈦膜和金膜，并將基底放于熱板上熱烘堅(jiān)膜。

(2)激光干涉光刻法制備多周期性孔型團(tuán)簇圖案

利用波長(zhǎng)為1064nm的大功率固體激光器作為相干光源，搭建六光束干涉系統(tǒng)。六光束干涉系統(tǒng)由分光系統(tǒng)和光束整形系統(tǒng)組成。六束相干光中三束光為一組，分布在兩個(gè)互相垂直的入射面內(nèi)，讓這六束光以一定的入射角(四束相同入射角光束的入射角為7°，兩束相同入射角光束的入射角為9°)，一定的方位角(兩個(gè)互相垂直的入射面的空間角分別為0°和90°)同時(shí)照射到樣品基底上，在樣品基底表面的中心重合(制備基底時(shí)，六束光在基底表面的中心重合)。兩個(gè)入射面內(nèi)的光束偏振角分別為60°和90°。采用短波長(zhǎng)即波長(zhǎng)在355nm-1064nm范圍，能量調(diào)控的方式即在激光器控制軟件中調(diào)整激光器出光能量，并利用偏振片改變干涉光能量，可以改變曝光時(shí)的能量閾值，從而調(diào)控二級(jí)孔陣深度和二級(jí)孔陣占空比，進(jìn)行對(duì)基底進(jìn)行直接干涉光刻。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明的可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞沿其表面的周期性孔型團(tuán)簇圖案化生長(zhǎng)，且二級(jí)孔陣結(jié)構(gòu)能夠調(diào)節(jié)基底對(duì)細(xì)胞的粘附性，利用afm(原子力顯微鏡)探針可在該可定位操控與電位測(cè)量功能化培養(yǎng)基底上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定位操控，能夠全面觀察細(xì)胞在外界不同刺激時(shí)的形貌變化；當(dāng)可興奮細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，產(chǎn)生的電位可由團(tuán)簇及孔陣間連接的金膜作為導(dǎo)電電極導(dǎo)出，實(shí)現(xiàn)探測(cè)單個(gè)可興奮細(xì)胞受不同種刺激時(shí)產(chǎn)生的電流大小。

(2)由于金-鈦，鈦-石英的結(jié)合能力大于金-石英結(jié)合能力，在金膜與石英基底之間鍍一層鈦膜作為粘合層會(huì)提高金膜與基底的結(jié)合能力，使金膜在制備該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底的過程中不易脫落；且10nm的鈦膜會(huì)隨著金膜一起圖案化，不會(huì)殘留在團(tuán)簇與二級(jí)孔陣底部。

(3)調(diào)整入射角，方位角可以獲得不同團(tuán)簇周期和二級(jí)孔陣周期；調(diào)整曝光能量可以控制結(jié)構(gòu)深度。使得該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底從圖案尺寸到圖案深度皆可調(diào)節(jié)。采用能量調(diào)控的曝光方式可以讓團(tuán)簇中納米級(jí)孔陣直徑減小，實(shí)現(xiàn)孔陣基底對(duì)細(xì)胞的粘附調(diào)節(jié)；兩個(gè)面內(nèi)的光束偏振角分別為60°和90°可以使兩個(gè)團(tuán)簇間互不相接，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞定位生長(zhǎng)。

(4)制備工藝簡(jiǎn)單，制作一個(gè)功能化培養(yǎng)基底的時(shí)間短，調(diào)整好直接激光干涉光刻方法的曝光參數(shù)，可以控制在1s左右即可制備一片有多周期性孔型團(tuán)簇圖案的功能化培養(yǎng)基底，其制備方法具有工藝簡(jiǎn)單、操作方便、制造單個(gè)基底耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，適合于規(guī)?；a(chǎn)。

(5)本發(fā)明可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底在細(xì)胞電特性測(cè)量、細(xì)胞操縱、細(xì)胞定位生長(zhǎng)等方面有重要應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中六光束干涉的光路示意圖，圖中m1-m5為高反射鏡，b1-b5為分光鏡，h為半波片，p為偏振片，l為樣品臺(tái)，c為半波片與偏振片的中心，o為基底中心即六束光相交位置；

圖2為本發(fā)明基底中的多周期性孔型團(tuán)簇圖案，圖2中a區(qū)域，為金膜上孔型團(tuán)簇形貌；二級(jí)孔陣如圖2中b位置，為團(tuán)簇中周期性孔陣結(jié)構(gòu)，孔的中心露出石英基底；

圖3為本發(fā)明的可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底截面示意圖；

圖4為細(xì)胞在本發(fā)明的可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底上的圖案化生長(zhǎng)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步說明本發(fā)明。

本發(fā)明一種可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底，團(tuán)簇圖案為微米級(jí)周期性孔陣結(jié)構(gòu)，即一級(jí)孔陣，團(tuán)簇中存在納米級(jí)周期性孔陣結(jié)構(gòu)，即二級(jí)孔陣；在一級(jí)孔陣團(tuán)簇中滴入表面修飾材料，并將其置于含有細(xì)胞的培養(yǎng)液中，表面修飾材料將引導(dǎo)細(xì)胞在一級(jí)孔陣中定位生長(zhǎng)；二級(jí)孔陣中金膜和石英基底的交替結(jié)構(gòu)以及孔陣間的凸起能夠改變細(xì)胞在該培養(yǎng)基底上的形貌，即改變細(xì)胞與基底接觸面積，從而實(shí)現(xiàn)基底對(duì)細(xì)胞的粘附性的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)操縱細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)、平移。

下面進(jìn)行詳細(xì)說明。

(1)基底的清洗與鍍膜

將表面積為1cm²的石英片依次置于丙酮、酒精、去離子水中超聲清洗各5min，取出并用氮?dú)獯蹈伞⑶逑催^的石英片放入等離子體濺射鍍膜機(jī)中，依次鍍10nm的鈦膜和80nm的金膜(根據(jù)需要選擇厚度)，后將底膜后的基底置于溫度為100℃的熱板上，鍍膜一面向上，熱烘60min堅(jiān)膜。

(2)直接激光干涉光刻法制備多周期性孔型團(tuán)簇圖案

按照實(shí)際需要確定多周期性孔型團(tuán)簇圖案的團(tuán)簇周期、二級(jí)孔陣深度、二級(jí)孔陣周期，根據(jù)多光束干涉原理設(shè)計(jì)好光路入射角、空間角，然后進(jìn)行光路搭建。

如圖1所示，六光束干涉系統(tǒng)由分光系統(tǒng)和光束整形系統(tǒng)組成。五個(gè)分光鏡m1-m5組成分光系統(tǒng)，將波長(zhǎng)為1064nm的固體激光器發(fā)出的一束光分成六束相干光束，并將其中一束光3以設(shè)計(jì)好的入射角和空間角直接投射到樣品臺(tái)l的中心；接著用b1-b5五個(gè)高反射鏡將其余五束相干光以設(shè)計(jì)好的入射角和空間角投射到樣品臺(tái)中心，使六束光在樣品臺(tái)中心重合如圖1中o點(diǎn)。圖1中光束2、4、6在同一個(gè)入射面內(nèi)，光束1、3、5在同一個(gè)入射面內(nèi)，兩個(gè)入射面互相垂直。光束2與光束4有相同的空間角為90°，不同的入射角，光束4和光束6有相同的入射角，空間角相差180°；光束1與光束3有相同的空間角為0°，不同的入射角，光束3和光束5有相同的入射角，空間角相差180°。光束3、光束4、光束5和光束6有相同的入射角為7°；光束1和光束2有相同的入射角為9°。按照上述關(guān)系搭好光路后，調(diào)整光路準(zhǔn)直，將6組組合到一起的半波片h與偏振片p安裝到距離樣品臺(tái)相同距離的光路上，光路通過半波片和偏振片的中心，如圖1中c點(diǎn)，兩個(gè)面內(nèi)的光束偏振角分別為60°和90°即光束1、3、5的偏振角為60°，光束2、4、6的偏振角為90°。搭建好光路后，根據(jù)所需結(jié)構(gòu)深度和占空比在激光器軟件中調(diào)整激光器出光能量、出光脈沖數(shù)，采用短波長(zhǎng)1064nm，能量調(diào)控的方式進(jìn)行曝光，即在激光器控制軟件中調(diào)整激光器出光能量并利用偏振片改變干涉光能量可以改變曝光時(shí)的能量閾值，從而調(diào)控結(jié)構(gòu)深度制備周期性孔陣團(tuán)簇圖案，多周期性孔型團(tuán)簇圖案如圖2所示，一級(jí)孔陣如圖2中a區(qū)域，為金膜上周期性孔型團(tuán)簇形貌；二級(jí)孔陣如圖2中b位置，為團(tuán)簇中周期性孔陣結(jié)構(gòu)，孔的中心露出石英基底。制備得到的可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底如圖3所示。

利用定位系統(tǒng)與位移平臺(tái)，可將表面修飾材料滴入團(tuán)簇中，后將該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底置于含有細(xì)胞的培養(yǎng)液中。表面修飾材料將引導(dǎo)細(xì)胞按照?qǐng)F(tuán)簇的分布形成周期性圖案，如圖4所示。多周期性孔型團(tuán)簇圖案如圖2所示，一級(jí)孔陣如圖2中a區(qū)域，為金膜上孔型團(tuán)簇形貌；二級(jí)孔陣如圖2中b位置，為團(tuán)簇中周期性孔陣結(jié)構(gòu)，孔的中心露出石英基底，每個(gè)團(tuán)簇內(nèi)只生長(zhǎng)一個(gè)細(xì)胞，且團(tuán)簇中的二級(jí)孔陣會(huì)使細(xì)胞與基底接觸面積和粘附力可調(diào)，更易于探針操縱細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)與平移。將表面長(zhǎng)有細(xì)胞的該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底置于afm(原子力顯微鏡)下，給細(xì)胞一定刺激，操縱探針可將該定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底上的細(xì)胞轉(zhuǎn)動(dòng)，并推動(dòng)至其他位置并且避免細(xì)胞膜受損，全面觀察細(xì)胞受刺激后的形貌變化。當(dāng)待測(cè)細(xì)胞為可興奮細(xì)胞時(shí)，可以用探針給細(xì)胞施予力的刺激或者給細(xì)胞添加藥物刺激，可興奮細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生的電信號(hào)將由該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底表面的金膜導(dǎo)出，由探測(cè)器接收。

產(chǎn)品特性：產(chǎn)品制造工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，用途廣泛?？啥ㄎ徊倏嘏c電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底由六光束直接激光干涉光刻技術(shù)制備一次成型，具有良好的生物相容性。在團(tuán)簇內(nèi)滴入表面修飾材料后，細(xì)胞可以按照?qǐng)F(tuán)簇周期性排列，便于實(shí)驗(yàn)觀察和分區(qū)培養(yǎng)不同細(xì)胞。二級(jí)孔陣能改變細(xì)胞在基底上的形貌，改變細(xì)胞膜與基底接觸面積，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)基底對(duì)細(xì)胞粘附性的調(diào)節(jié)，易于afm(原子力顯微鏡)探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操縱。良導(dǎo)體金膜還可傳輸可興奮細(xì)胞受外界刺激產(chǎn)生的電信號(hào)，因此該可定位操控與電位測(cè)量功能化細(xì)胞培養(yǎng)基底可用于細(xì)胞圖案化定位生長(zhǎng)、全面形貌觀測(cè)、電信號(hào)的測(cè)量、藥物篩選與細(xì)胞損傷判定等方面。

上述描述的實(shí)施例并非限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可做各種更動(dòng)和潤(rùn)色，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍視權(quán)利要求范圍所界定。