本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株籃狀菌及利用該籃狀菌液體菌膜發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷的方法。
背景技術(shù)：
色素分為人工合成色素和天然色素兩類，在食品、釀造及化妝品等行業(yè)中應(yīng)用廣泛。研究表明幾乎所有的合成色素均不能向人體提供營養(yǎng)物質(zhì)，反而大多數(shù)合成色素對人體有不同程度的傷害如致癌、致畸、致突變等（downhama,collinsp.colouringourfoodsinthelastandnextmillennium[j].internationaljournaloffoodscience&technology,2000,35:5–22）。與合成色素相比，天然色素具備低毒、安全等優(yōu)點(diǎn)，正逐步受到人們的青睞。紅色是喜慶、浪漫、熱情的顏色，因此，紅色素是目前食品工業(yè)應(yīng)用最廣泛的色素之一。國內(nèi)外市場上對天然紅色素的需求量很大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，從1998年開始，僅國內(nèi)天然紅色素年需求量就達(dá)1.5萬噸，且年增長率一直保持在10%以上。天然紅色素的生產(chǎn)方法主要有兩種：一是從天然動(dòng)植物材料中提取，這種方法的缺點(diǎn)是成本高、產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性差；二是利用微生物法生產(chǎn)，這種方法不但安全性高、工藝性能好，而且生產(chǎn)不受場地、季節(jié)限制，設(shè)備簡單，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。
甜菜紅色素是一種水溶性的含氮色素，屬吡啶衍生物，因最早發(fā)現(xiàn)于甜菜根中而得名。甜菜紅色素包括甜菜苷（betanin）、異甜菜苷（isobetanin）、甜菜素（betanidin）以及異甜菜素（isobetanidin）等。天然甜菜紅色素是一種具有藥用價(jià)值的色素，其具有抗癌、抗氧化性、降血脂等作用。研究表明，甜菜紅色素作為抗氧化劑，可以通過抑制氧化反應(yīng)來控制人類的多種退化性疾?。╧annerj,harels,granitr.betalains--anewclassofdietarycationizedantioxidants[j].journalofagricultural&foodchemistry,2001,49:5178-5185）。murthy等發(fā)現(xiàn)甜菜色素具有清除自由基的功能，并且能夠降低糖尿病病人的血糖以及血脂（murthyknc,manchalis.anti-diabeticpotentialsofredbeetpigmentsandotherconstituents.redbeetbiotechnology:springer,2012.p:155-174）。1998年，甜菜紅色素正式列入國家批準(zhǔn)允許使用的食用天然色素名錄（食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，gb2760-1996）。甜菜紅色素存在于石竹目植物中，包括藜科、莧科及仙人掌科等（吳則東,胡曉航,吳玉梅,等.甜菜紅色素提取工藝研究進(jìn)展[j].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2015,31:254-258）。自然界的微生物中，只有極少數(shù)高等真菌中積累甜菜紅色素,如毒蠅鵝膏菌（amanitamuscaria)(girodpa,zrydjp.biogenesisofbetalains:purificationandpartialcharacterizationofdopa4,5-dioxygenasefromamanitamuscaria[j].phytochemistry,1991,30:169-174），但這些真菌因產(chǎn)生毒素，且色素只在菌傘上出現(xiàn)等原因，不適于用來發(fā)酵生產(chǎn)甜菜紅色素。故目前甜菜紅色素主要從植物中提取獲得，如史淑芝等利用水萃取法和鹽酸浸提法提取紅甜菜中的甜菜紅色素（史淑芝,程大友,高興武,等.不同品系食用紅甜菜的紅色素提取[j].食品工業(yè)科技,2007,28:174-175）。sanchez-gonzalez等從一種稱作opuntidajoconostle的墨西哥梨果仙人掌果實(shí)中提取甜菜色素和甜菜苷（sanchez-gonzalezn,jaime-fonsecamr,sanme,etal.extraction,stability,andseparationofbetalainsfromopuntiajoconostlecv.usingresponsesurfacemethodology[j].journalofagricultural&foodchemistry,2013,61:11995-12004）。castellanos-santiago等利用水和緩沖溶液從仙人掌和紅甜菜中提取甜菜紅色素（castellarr,obónjm,mercedesaa,etal.colorpropertiesandstabilityofbetacyaninsfromopuntiafruits[j].journalofagricultural&foodchemistry,2003,51:2772-2776）。
盡管目前國內(nèi)外主要利用植物提取獲得甜菜紅色素，但提取工藝繁雜、取材易受季節(jié)限制以及環(huán)境污染等問題限制了甜菜紅色素的應(yīng)用。因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)甜菜紅色素?zé)o疑更具應(yīng)用潛力。但迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)甜菜紅色素的案例，也沒有利用籃狀菌液體菌膜發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供了一株籃狀菌及利用該籃狀菌液體菌膜發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷的方法。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案，一株籃狀菌，其特征在于所述籃狀菌的分類命名為talaromycessp.wlp，于2017年4月19日保藏于中國武漢，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2017199。
本發(fā)明所述的利用籃狀菌液體菌膜發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷的方法，其特征在于具體過程為：將籃狀菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通過液體培養(yǎng)形成菌膜后靜置培養(yǎng)產(chǎn)生甜菜苷，其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成：馬鈴薯200g/l、葡萄糖15.0g/l、feso42.0g/l、cuso40.5g/l、k2hpo41.0g/l和kh2po41.0g/l，ph7.0。
進(jìn)一步優(yōu)選，利用籃狀菌液體菌膜發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷的方法，其特征在于具體步驟為：
（1）培養(yǎng)基的配制
斜面培養(yǎng)基的配制：馬鈴薯200g/l、葡萄糖15.0g/l、feso42.0g/l、cuso40.5g/l、k2hpo41.0g/l、kh2po41.0g/l和瓊脂20g/l，ph自然；
液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將200g去皮馬鈴薯切成小塊，加水煮沸30min，用8層紗布過濾，加葡萄糖15.0g/l、feso42.0g/l、cuso40.5g/l、k2hpo41.0g/l和kh2po41.0g/l，蒸餾水補(bǔ)足至總體積1000ml，調(diào)節(jié)ph值至7.0；
（2）色素發(fā)酵
將籃狀菌接種至斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株活化，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，將活化后的斜面分生孢子用無菌水制成濃度為4×1010個(gè)/ml的分生孢子懸液，再將分生孢子懸液接入到1000ml三角瓶中，該三角瓶內(nèi)裝有600ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分生孢子的接種量為5ml，將三角瓶置于恒溫?fù)u床中在32℃、150rpm的條件下培養(yǎng)40h，待菌絲球大量形成時(shí)，轉(zhuǎn)為靜置培養(yǎng)，1天后液體發(fā)酵培養(yǎng)基表面菌膜形成，此時(shí)甜菜苷開始產(chǎn)生，然后再靜置培養(yǎng)6-7天；
（3）甜菜苷的制備
籃狀菌液體菌膜發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液抽濾去除菌體，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，溫度控制在50℃以下，濃縮至原體積的一半后加入兩倍濃縮液體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，放置過夜后再用布氏漏斗真空抽濾去除生物大分子，上清液繼續(xù)進(jìn)行真空濃縮脫醇至半固體，而后于-20℃冷凍過夜，將結(jié)冰的色素固體置于真空冷凍干燥機(jī)中，控制真空度為50pa，溫度為-35℃，冷凍時(shí)間為18h，得到干燥好的甜菜苷粗品，再將甜菜苷粗品進(jìn)行分離純化得到甜菜苷純品。
進(jìn)一步優(yōu)選，步驟（2）中所述甜菜苷的產(chǎn)量最高達(dá)到7.2g/l。
本發(fā)明首次利用籃狀菌發(fā)酵生產(chǎn)甜菜苷，工藝簡單且成本低廉，具有較好的市場應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
甜菜苷是通過籃狀菌t.sp.wlp液體菌膜發(fā)酵獲得，其發(fā)酵及制備流程如下：
1、培養(yǎng)基的配制
斜面培養(yǎng)基的配制：馬鈴薯200g/l、葡萄糖15.0g/l、feso42.0g/l、cuso40.5g/l、k2hpo41.0g/l、kh2po41.0g/l和瓊脂20g/l，ph自然；
液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：將200g去皮馬鈴薯切成小塊，加水煮沸30min，用8層紗布過濾，加葡萄糖15.0g/l、feso42.0g/l、cuso40.5g/l、k2hpo41.0g/l和kh2po41.0g/l，蒸餾水補(bǔ)足至總體積1000ml，調(diào)節(jié)ph值至7.0。
2、色素發(fā)酵
菌株活化：將籃狀菌t.sp.wlp接種至斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化處理，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
孢子懸液的制備：將活化后的斜面分生孢子用適量的無菌水制成濃度為4×1010個(gè)/ml的分生孢子懸液。
液體發(fā)酵：將分生孢子懸液接入1000ml三角瓶中，三角瓶內(nèi)裝有600ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分生孢子接種量為5ml，將三角瓶置于恒溫?fù)u床（32℃，150rpm）培養(yǎng)40h，待菌絲球大量形成時(shí)，轉(zhuǎn)為靜置培養(yǎng)，1天后液體培養(yǎng)基表面菌膜形成，此時(shí)甜菜苷開始產(chǎn)生，然后再靜置培養(yǎng)6-7天。
甜菜苷濃度的測定：
采用液相色譜法對甜菜苷含量進(jìn)行測定，單位g/l。色譜柱采用zorbaxeclipsexdb-c18柱（4.6mm×150mm，5μm），流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)20%甲醇-體積分?jǐn)?shù)80%冰醋酸緩沖液；流速：0.8ml/min；柱溫：25℃；檢測波長535nm；進(jìn)樣量：20μm。
分別配制10-70mmol/l濃度梯度的甜菜苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋200倍后進(jìn)行高效液相色譜檢測。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程：c=65.32x+190.1（r2=0.995），其中c為甜菜苷濃度，x為峰面積。取發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，在4℃、1000rpm離心10min，上清液稀釋200倍后進(jìn)行高效液相色譜測定。將所得峰面積數(shù)值帶入回歸方程計(jì)算發(fā)酵液中甜菜苷的濃度。經(jīng)測定，甜菜苷產(chǎn)量最高達(dá)到7.2g/l。
3、甜菜苷粗品的制備
籃狀菌t.sp.wlp液體菌膜發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液抽濾去除菌體，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，溫度控制在50℃以下，濃縮至原體積的一半后加入兩倍濃縮液體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，放置過夜后再用布氏漏斗真空抽濾去除生物大分子，上清液繼續(xù)進(jìn)行真空濃縮脫醇至半固體，而后于-20℃冷凍過夜，將結(jié)冰的色素固體置于真空冷凍干燥機(jī)中，控制真空度為50pa，溫度為-35℃，冷凍時(shí)間為18h，得到干燥好的甜菜苷粗品。
4、甜菜苷的分離、純化及鑒定
將甜菜苷粗品用蒸餾水溶解，利用大孔樹脂ab-8進(jìn)行分離。經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為30%和體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇洗脫后，將含有紅色素洗脫液合并。此時(shí)色素溶液中含有兩種組分：組分1和2，其中組分2為主要成分。利用硅膠薄層層析（流動(dòng)相：正丁醇/乙醇/水=7:3:1，v/v/v）對組分2進(jìn)一步純化，將硅膠板上分開的紅色條帶（組分2）刮下，乙醇溶解后離心（5000rpm、10min），上清液用0.22μm有機(jī)濾膜過濾，干燥后即可得到甜菜苷純品。經(jīng)紅外光譜、質(zhì)譜等技術(shù)鑒定，發(fā)現(xiàn)組分2的紅外光譜，分子量均與甜菜苷一致，因此確定其為甜菜苷，分子結(jié)構(gòu)為：
實(shí)施例
方案一：將孢子懸液以5ml的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，1000ml三角瓶裝液量為600ml，置于恒溫?fù)u床（32℃、150rpm）培養(yǎng)40h后，待菌絲球大量形成后，轉(zhuǎn)為靜置培養(yǎng)，1天后液體培養(yǎng)基表面菌膜形成，甜菜苷開始產(chǎn)生，然后靜置培養(yǎng)6-7天。
方案二：將孢子懸液以5ml的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，1000ml三角瓶裝液量為600ml，置于恒溫?fù)u床（32℃、150rpm）一直震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵周期為10天。
甜菜苷濃度的測定
采用液相色譜法對發(fā)酵液中的甜菜苷含量進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1不同發(fā)酵方式對甜菜苷產(chǎn)量的影響
以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。