本發(fā)明涉及一種提高光滑球擬酵母酸耐受能力的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

中介體復(fù)合物(mediatorcomplex)是多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，是轉(zhuǎn)錄因子與rna聚合酶ii之間信息傳遞的橋梁。細(xì)胞中不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過激發(fā)其控制的特異轉(zhuǎn)錄因子與中介體特定的亞基發(fā)生相互作用，調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長及各種生理功能。

光滑球擬酵母(candidaglabrata)可以用于生產(chǎn)丙酮酸、富馬酸和蘋果酸等多種有機(jī)酸。在有機(jī)酸發(fā)酵過程中，c.glabrata會(huì)面臨低ph脅迫。低ph環(huán)境對(duì)使微生物的胞內(nèi)環(huán)境酸化，致使菌體生長受損、發(fā)酵產(chǎn)物的積累減緩甚至停止。目前主要通過外源添加輔助底物、誘變育種、基因工程和適應(yīng)性進(jìn)化等策略提高菌體的酸耐受性和有機(jī)酸產(chǎn)量。但這些策略存在增大產(chǎn)物提純復(fù)雜度、工作量大和周期長等問題。通過中介體調(diào)控作用進(jìn)行耐酸機(jī)制的研究是從基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的研究，可從根本上指導(dǎo)解決這一問題，但此機(jī)制尚不清楚。因此，探索一種提高c.glabrata酸耐受機(jī)制的方法對(duì)提高有機(jī)酸產(chǎn)量具有指導(dǎo)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種基因工程菌，是以光滑球擬酵母為宿主，過表達(dá)seqidno.1所示的蛋白亞基。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以py26為載體過表達(dá)所述蛋白亞基。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述光滑球擬酵母是光滑球擬酵母atcc55。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述基因工程菌的構(gòu)建方法，所述方法是擴(kuò)展seqidno.1所示蛋白亞基的基因序列，與載體連接，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因序列如seqidno.2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法包括以下步驟：

(1)擴(kuò)增seqidno.2所示cgmed15b基因序列，(2)通過t4連接酶將cgmed15b基因經(jīng)酶切位點(diǎn)noti和sacii克隆到質(zhì)粒py26上(3)將重組質(zhì)粒py26-cgmed15b電擊轉(zhuǎn)化到c.glabrataatcc55。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種提高c.glabrata酸耐受能力的方法，所述方法是在光滑球擬酵母中過表達(dá)中介體亞基med15b。

本發(fā)明還提供所述基因工程菌在有機(jī)酸生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括以過表達(dá)seqidno.1所示中介體亞基的光滑球擬酵母為發(fā)酵微生物，發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將所述光滑球擬酵母接種至添加40g/l的caco3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28～30℃，200～250rpm，培養(yǎng)40～72h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述接種是接種經(jīng)富集培養(yǎng)的種子液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基富集培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接至添加40g/l的caco3ph緩沖液的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm，培養(yǎng)52h。

有益效果：本發(fā)明利用過表達(dá)中介體亞基med15b，使光滑球擬酵母在ph2.0條件下最終生物量提高59.2％，在ph2.0條件下，12h時(shí)細(xì)胞生長量較出發(fā)菌株增加73.8％，細(xì)胞膜酵母甾醇、糞甾醇和麥角甾醇的含量分別提高了970％、16.6％和94.5％，細(xì)胞膜完整性和流動(dòng)性增強(qiáng)，并使丙酮酸發(fā)酵能力提高100％。

附圖說明

圖1為基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證，其中，a為目的基因的擴(kuò)增結(jié)果，1～3表示cgmed15b基因擴(kuò)增序列，m2表示dl10000dnamarker；b為過表達(dá)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，1～3表示過表達(dá)質(zhì)粒，m2表示dl10000dnamarker；c為基因過表達(dá)菌株的驗(yàn)證，+表示質(zhì)粒py26-cgmed15b為模板的陽性對(duì)照，-表示未轉(zhuǎn)化入質(zhì)粒py26-cgmed15b的c.glabrataatcc55菌落做模板的陰性對(duì)照，1表示以轉(zhuǎn)化入質(zhì)粒py26-cgmed15b的c.glabrataatcc55菌落做模板的過表達(dá)轉(zhuǎn)化子；

圖2為基因缺失菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證，a為敲除框的構(gòu)建，b為基因缺失菌株的驗(yàn)證；其中，l表示目的基因的上游500bp的左臂，m表示敲除標(biāo)記基因his3，r表示目的基因下游500bp的右臂，lm表示左臂和his3的融合片段，rm表示右臂和his3的融合片段，lmr表示左臂和右臂中間融合入his3的敲除框片段；-表示未加入dna模板的陰性對(duì)照；+表示加入c.glabrata野生型基因組為模板的陽性對(duì)照，1和2表示c.glabrata野生型基因組，3、4分別表示cgmed15b基因沒有被敲除的菌株、cgmed15b基因成功被敲除的菌株。

圖3為c.glabrata生長性能的測定，a不同ph下的平板生長實(shí)驗(yàn)，b不同ph下生長曲線測定，c細(xì)胞生長活性的測定；

圖4為細(xì)胞膜性能測定結(jié)果，a細(xì)胞膜甾醇含量測定，b細(xì)胞膜完整性測定，c細(xì)胞膜流動(dòng)性測定。

圖5丙酮酸發(fā)酵能力測定結(jié)果；

圖6為對(duì)照例實(shí)施方式下的基因工程菌生長性能。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式中涉及的測定方法：

(1)菌體平板生長情況記錄：將待測菌株的單菌落接種于20ml的ynb(0.67％酵母提取物無氨基酸的基本氮源，2％葡萄糖，ph6.0)液體培養(yǎng)基中，將對(duì)數(shù)生長期的菌體經(jīng)適當(dāng)梯度稀釋點(diǎn)種在ynb固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)并觀察菌體的生長情況并拍照，具體方法參見2016年公開的《crz1pregulatesphhomeostasisincandidaglabratabyalteringmembranelipidcomposition》。

(2)生長曲線測定：將對(duì)數(shù)期的待測菌株接種于ph6.0和ph2.0的ynb液體培養(yǎng)基，初始o(jì)d660＝0.1，30℃搖床培養(yǎng)，每隔一定的時(shí)間取菌液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，660nm測定od值，繪制生長曲線；

(3)生長活性測定：將活化后的菌株接種于ph2.0的ynb液體培養(yǎng)基，初始o(jì)d660＝0.1，30℃搖床培養(yǎng)，每隔一定的時(shí)間取菌液，測定細(xì)胞的生長活性，方法參見2015年公開的《transcriptionfactorsasg1pandhal9pregulatephhomeostasisincandidaglabrata》。

(4)細(xì)胞膜甾醇含量測定：分別收集ynb培養(yǎng)基，ph6.0和ph2.0，30℃，200rpm，培養(yǎng)8h的酵母細(xì)胞。用pbs緩沖液洗滌三遍，然后冷凍干燥后備用。稱取30mg冷凍干燥的酵母細(xì)胞，用于細(xì)胞膜甾醇提取，方法參見2016年公開的《轉(zhuǎn)錄因子crz1p調(diào)控光滑球擬酵母應(yīng)答酸脅迫的生理機(jī)制》。

甾醇含量質(zhì)譜分析方法：氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜(tof)聯(lián)用儀(waters，usa)。固定相：硅膠毛細(xì)管柱(30m×0.25mm，0.25μmdb-5msstationaryphase,j&wscientific,folsom,ca)。具體條件參見2009年公開的《單雙倍體酵母細(xì)胞對(duì)乙醇響應(yīng)的比較脂組學(xué)研究》。

(5)細(xì)胞膜完整性檢測：分別收集ynb培養(yǎng)基，ph6.0和ph2.0，30℃，200rpm，培養(yǎng)8h的酵母細(xì)胞，pbs緩沖液洗滌細(xì)胞并調(diào)節(jié)菌體濃度至od660＝0.5，pi標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜的完整性，方法參見2015年公開的《twonon-exclusivestrategiesemployedtoprotecttorulopsisglabrataagainsthyperosmoticstress》。

(6)細(xì)胞膜流動(dòng)性檢測：分別收集ynb培養(yǎng)基，ph6.0和ph2.0，30℃，200rpm，培養(yǎng)8h的酵母細(xì)胞，磷酸鉀緩沖液洗滌并調(diào)節(jié)菌體濃度至od660＝0.5，以tma-dph為熒光探針，采用熒光分光光度計(jì)檢測細(xì)胞膜的流動(dòng)性，方法參見2012年公開的《lactobacilluscaseicombatsacidstressbymaintainingcellmembranefunctionality》。

(7)丙酮酸發(fā)酵能力檢測：將各菌株經(jīng)種子培養(yǎng)基富集培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接至添加40g/l的caco3ph緩沖液的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，200rpm，培養(yǎng)52h，利用高效液相色譜法檢測丙酮酸的發(fā)酵能力，方法參見2016年公開的《crz1pregulatesphhomeostasisincandidaglabratabyalteringmembranelipidcomposition》。

實(shí)施例1：過表達(dá)菌株的構(gòu)建

以c.glabrataatcc2001(以下簡寫為wt)基因組為模板，以p1/p2為引物，將擴(kuò)增出的帶有酶切位點(diǎn)noti和sacii的片段cgmed15b(圖1a，3.3kb)。經(jīng)雙酶切后連接到質(zhì)粒py26上，構(gòu)建重組質(zhì)粒py26-cgmed15b，雙酶切驗(yàn)證py26質(zhì)粒(7.2kb)、cgmed15b(3.3kb)這兩個(gè)片段(圖1b)。以c.glabrataatcc55(后文簡寫做htuδ)為出發(fā)菌株，將重組質(zhì)粒py26-cgmed15b導(dǎo)入其感受態(tài)細(xì)胞，涂布mm篩選培養(yǎng)基，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。出發(fā)菌株因缺失ura3基因不能在mm篩選培養(yǎng)基上生長，而質(zhì)粒py26上的ura3基因可使過表達(dá)菌株獲得這一生長能力。以p3/p4為引物，通過菌落pcr篩選驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，作為對(duì)照的出發(fā)菌株htuδ無條帶產(chǎn)生，而陽性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增得到特異性片段(圖1c，3.3kb)，將此菌株命名為htuδ/cgmed15b。

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實(shí)施例2：敲除菌株的構(gòu)建

以wt基因組為模板，分別以p5/p6、p7/p8、p9/p10、為引物，擴(kuò)增出cgmed15b的左臂(以l表示)、右臂(以r表示)和his3基因(以m表示)，經(jīng)融合pcr構(gòu)建敲除框cgmed15b-lmr(圖2a)。將敲除框?qū)氤霭l(fā)菌株htuδ，經(jīng)同源重組獲得標(biāo)記基因his3替換掉目的基因cgmed15b的突變菌株。出發(fā)菌株htuδ因缺失his3基因不能在篩選培養(yǎng)基上生長，而突變菌株因標(biāo)記基因his3表達(dá)而能在mm培養(yǎng)基上生長。以p11/p12為引物，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落和基因組pcr驗(yàn)證，如圖1b所示，發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株htuδ產(chǎn)生4.0kb左右基因片段，而轉(zhuǎn)化子獲得1.7kb左右的基因his3及基因cgmed15b的左右臂。將驗(yàn)證正確的突變菌株命名為med15bδ。

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實(shí)施例3：突變菌的生長性能測定

通過平板生長情況記錄、生長曲線和生長活性測定對(duì)med15b提高c.glabrata酸耐受性的功能進(jìn)行評(píng)定：

平板生長實(shí)驗(yàn)分析不同ph條件對(duì)出發(fā)菌株htuδ、過表達(dá)菌株htuδ/cgmed15b和敲除菌株med15bδ酸耐受性能的影響，如圖3a，發(fā)現(xiàn)以ph6.0為對(duì)照，ph值由6.0上升到8.0，c.glabrata的生長都會(huì)受到抑制，但相同ph條件下三株菌的生長情況大致相同；但隨著ph由6.0降低到2.0，過表達(dá)med15b會(huì)小幅度促進(jìn)菌株的生長，缺失med15b會(huì)顯著抑制菌株的生長。進(jìn)一步對(duì)菌體在ph2.0條件下的生長曲線進(jìn)行測定，如圖3b，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)菌株的最終生物量較出發(fā)菌株提高59.2％，敲除菌株的最終生物量較出發(fā)菌株降低30.4％。ph2.0條件下，12h時(shí)三株菌之間的細(xì)胞活性測定如圖3c，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)菌株的細(xì)胞生長量較出發(fā)菌株增加73.8％，敲除菌株的細(xì)胞生長量較出發(fā)菌株降低55.9％。以上結(jié)果表明，缺失med15b會(huì)降低c.glabrata的生長能力和對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力，過表達(dá)med15b能夠提高c.glabrata的生長能力和對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力。

實(shí)施例4：突變菌的細(xì)胞膜性能測定

通過測定細(xì)胞膜甾醇含量和細(xì)胞膜完整性、流動(dòng)性，對(duì)c.glabrata細(xì)胞膜性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

ph2.0時(shí)出發(fā)菌株htuδ、過表達(dá)菌株htuδ/cgmed15b和敲除菌株med15bδ細(xì)胞膜含量測定結(jié)果如圖4a，與出發(fā)菌株htuδ相比，過表達(dá)菌株htuδ/cgmed15b細(xì)胞膜酵母甾醇、糞甾醇和麥角甾醇的含量分別提高了970％、16.6％和94.5％，敲除菌株med15bδ中酵母甾醇含量大量積累比出發(fā)菌株提高60.3倍，但是無法合成糞甾醇和麥角甾醇。對(duì)三株菌的細(xì)胞膜完整性測定結(jié)果如圖4b，發(fā)現(xiàn)在ph2.0條件下，過表達(dá)med15b的菌株能夠增強(qiáng)膜完整性，pi染色的過表達(dá)菌株細(xì)胞數(shù)比出發(fā)菌株降低30.2％，缺失med15b導(dǎo)致膜完整性損壞，pi染色的敲除菌株細(xì)胞數(shù)比出發(fā)菌株增多69.2％。對(duì)三株菌的細(xì)胞膜流動(dòng)性測定結(jié)果如圖4c，發(fā)現(xiàn)在ph2.0條件下，過表達(dá)med15b能夠增強(qiáng)膜流動(dòng)性，過表達(dá)菌株細(xì)胞膜流動(dòng)性比出發(fā)菌株提高6.9％，缺失med15b使敲除菌株細(xì)胞膜流動(dòng)性降低了11.6％。

實(shí)施例5：突變菌的丙酮酸發(fā)酵能力測定

通過測定丙酮酸含量，對(duì)c.glabrata丙酮酸發(fā)酵能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)出發(fā)菌株htuδ、過表達(dá)菌株htuδ/cgmed15b和敲除菌株med15bδ發(fā)酵52h時(shí)丙酮酸含量測定結(jié)果如圖5，與出發(fā)菌株htuδ相比，過表達(dá)菌株htuδ/cgmed15b丙酮酸含量提高了100％，敲除菌株med15bδ中丙酮酸含量比出發(fā)菌株下降了39.7％。上述結(jié)果表明過表達(dá)med15b能夠提高c.glabrata的丙酮酸發(fā)酵能力。

對(duì)照例1

采用實(shí)施例1-2相同的策略，區(qū)別在于，將seqidno.1所示序列替換為中介體亞基med3a(序列如seqidno.15)、med3b(序列如seqidno.16)。過表達(dá)med3a的菌株表示為htuδ/cgmed3a，缺失的菌株表示為med3aδ；過表達(dá)med3b的菌株表示為htuδ/cgmed3b，缺失的菌株表示為med3bδ；對(duì)相應(yīng)的過表達(dá)和缺失突變株在酸性條件下的生長性能進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示如圖6，發(fā)現(xiàn)亞基med3a、med3b的過表達(dá)和缺失對(duì)細(xì)胞在酸性條件下的耐受能力無明顯影響。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>江南大學(xué)

<120>一種提高光滑球擬酵母酸耐受能力的方法

<160>16

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1095

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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