本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于重組蛋白促進(jìn)淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)的一種重組融合蛋白v12-cd137l的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

cd137l蛋白屬腫瘤壞死因子超家族成員(tnfsf9)，其一級結(jié)構(gòu)有254個(gè)氨基酸殘基,其中0-25位氨基酸殘基為胞質(zhì)區(qū),26-48位氨基酸殘基為連接段,是疏水區(qū)域，可形成跨膜區(qū),其余部分為胞外段的功能區(qū)，cd137l主要表達(dá)于活化的t細(xì)胞和b細(xì)胞，為淋巴細(xì)胞協(xié)同刺激因子，與其受體4-1bb結(jié)合，可啟動雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：正向信號可刺激t細(xì)胞活化和增殖；反向信號可刺激b細(xì)胞增殖。因此，cd137l可以有效促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化、增殖、分化，進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。許多研究表明，cd137l可以作為腫瘤相關(guān)抗原（taa）的免疫增強(qiáng)劑。

為了大量獲得cd137l，重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)（原核/真核）是一種有效、可行的技術(shù)手段。但是，天然的4-1bbl蛋白在體內(nèi)以三聚體的形式存在，呈三葉螺旋槳結(jié)構(gòu)，而通過表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的蛋白，受蛋白結(jié)構(gòu)以及與細(xì)胞表面分子的親和力等因素的影響，往往使得表達(dá)的cd137l蛋白生物活性較低、甚至不具有生物活性，從而給cd137l蛋白的人工制備帶來了極大的挑戰(zhàn)。因此，研究一種有效方法來提高cd137l的生物學(xué)功能，具有極大的醫(yī)學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。通過改造cd137l蛋白結(jié)構(gòu)，提高其與淋巴細(xì)胞的親和力，有可能提高cd137l體外表達(dá)重組蛋白的生物活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過基因工程技術(shù)人工設(shè)計(jì)一種重組融合蛋白v12-cd137l，并提供其制備方法及應(yīng)用。該重組蛋白可以有效提高淋巴細(xì)胞在體外的增殖，分化水平，同時(shí)還可以增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，并通過大腸桿菌表達(dá)，提高制備效率，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明是將艾滋病病毒gp120蛋白中的與淋巴細(xì)胞具有親和功能的v1v2區(qū)與cd137l的功能區(qū)結(jié)合，形成一種新的重組融合蛋白,命名為v12-cd137l，v12-cd137l蛋白的氨基酸序列為seqidno.1，其中第1-76位為艾滋病病毒gp120中的v1v2區(qū)，第77-283位為cd137l的功能區(qū)。v12-cd137l重組融合蛋白可以將cd137l蛋白的功能區(qū)靶向定位到淋巴細(xì)胞上，有效提高cd137l的生物活性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的體外增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫水平。

本發(fā)明為人工設(shè)計(jì)一種重組融合蛋白v12-cd137l，該蛋白由艾滋病病毒gp120中的v1v2區(qū)與cd137l的功能區(qū)結(jié)合而成，兼具靶向定位淋巴細(xì)胞的功能和cd137l蛋白功能。v12-cd137l通過大腸桿菌表達(dá)，層析柱分離、純化，最終得到高純度、高活性的重組蛋白。該重組蛋白促進(jìn)淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的增殖水平，且效果優(yōu)于單純的cd137l重組蛋白，同時(shí)該重組融合蛋白還能增強(qiáng)體內(nèi)的細(xì)胞免疫水平。

本發(fā)明所述重組融合蛋白v12-cd137l的制備方法為：以seqidno.1所述氨基酸序列為模板，設(shè)計(jì)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的能夠表達(dá)v12-cd137l蛋白的基因序列并在基因的5’端引入組氨酸標(biāo)簽序列，最終得到表達(dá)基因seqidno.2，所得seqidno.2基因序列插入表達(dá)系統(tǒng)中，通過表達(dá)得到重組的v12-cd137l融合蛋白。

本發(fā)明涉及一種重組融合蛋白v12-cd137l的制備方法及應(yīng)用，所述重組融合蛋白v12-cd137l是由艾滋病病毒gp120蛋白中的與淋巴細(xì)胞具有親和功能的v1v2區(qū)與cd137l的功能區(qū)結(jié)合而成，其氨基酸序列為seqidno.1所示，表達(dá)重組融合蛋白v12-cd137l的核苷酸序列為seqidno.2所示；seqidno.2基因序列通過以下步驟得到v12-cd137l重組融合蛋白；

本發(fā)明所述重組融合蛋白v12-cd137l具體步驟如下：

(1)人工合成seqidno.2基因，將融合基因插入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得表達(dá)v12-cd137l重組蛋白的重組大腸桿菌；

(2)將步驟(1)所得重組大腸桿菌進(jìn)行37℃培養(yǎng)，20-25℃誘導(dǎo)其表達(dá)重組蛋白v12-cd137l，獲得誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌；

(3)將步驟(2)所得誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌進(jìn)行細(xì)胞破碎，通過離心獲得重組大腸桿菌破碎上清液；

(4)將步驟(3)所得重組大腸桿菌破碎上清液通過層析柱進(jìn)行分離純化，得到v12-cd137l重組蛋白純化液；

(5)將步驟(4)所得v12-cd137l重組蛋白純化液置于透析袋中，用透析液進(jìn)行透析，獲得穩(wěn)定的v12-cd137l重組蛋白。

本發(fā)明所述seqidno.1氨基酸序列為：

mctdlntnnttnttelsiivvweqrgkgemrncsfnittsirdkvqreyalfykldvepiddnknttnntkyrlinclacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse

所述seqidno.2基因序列為：

atgcatcaccatcatcaccactgtactgacctgaacaccaacaatactactaacaccactgaactgagcattattgttgtatgggagcagcgtggtaagggtgaaatgcgcaattgtagcttcaacattaccacctccattcgcgataaagtacagcgtgaatacgctctgttctacaaactggatgttgaaccaattgacgataacaagaacaccaccaacaacaccaaatatcgtctgattaactgtctggcgtgtccgtgggcagtgtccggtgctcgcgcttctccgggtagcgcagcatctccacgtctgcgtgaaggcccagaactgtctccggacgatccggcaggcctgctggatctgcgtcagggcatgttcgcgcaactggtggcacagaacgttctgctgattgatggcccactgtcctggtacagcgatccgggtctggcaggtgtttctctgactggtggcctgtcttacaaagaggacactaaggagctggtagtggcgaaagctggtgtatactacgtattcttccaactggagctgcgtcgtgtggttgctggcgaaggctctggtagcgtgtccctggcgctgcatctgcaaccgctgcgtagcgcagcgggtgcagcggctctggcgctgaccgtggatctgccaccggcatctagcgaggcacgtaacagcgctttcggtttccagggtcgtctgctgcacctgtctgccggtcagcgtctgggcgttcacctgcacaccgaggcacgtgcacgtcacgcttggcaactgactcagggtgcaactgtactgggcctgttccgtgtaactccggagattccggcaggtctgccgtctccgcgttccgaataactcgag

本發(fā)明所述氨基酸序列seqidno.1中，第1-76位為艾滋病病毒gp120中的v1v2區(qū)，第77-283位為cd137l的功能區(qū)，所得重組融合蛋白兼具靶向定位淋巴細(xì)胞的功能和cd137l蛋白功能。

本發(fā)明所述透析液配方為：甘氨酸1-3克，二硫蘇糖醇0.1-0.3克，吐溫200.5-1克加水溶解定容至1升，調(diào)節(jié)ph值至7.0-9.0。

本發(fā)明所述的v12-cd137l重組融合蛋白能促進(jìn)淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的增殖水平，且效果優(yōu)于單純的cd137l重組蛋白。

本發(fā)明所述v12-cd137l重組融合蛋白能有效促進(jìn)體內(nèi)的細(xì)胞免疫水平。

本發(fā)明有益效果為：提供了一種改良的具有活化、促進(jìn)淋巴細(xì)胞功能的

cd137l重組蛋白——v12-cd137l。該蛋白在cd137l蛋白的功能區(qū)的n端加上艾滋病病毒gp120蛋白中的v1v2區(qū)，使得cd137l蛋白可以靶向定位到淋巴細(xì)胞上，從而提高cd137l蛋白的生物活性。該重組蛋白可通過大腸桿菌表達(dá)，大大提高

了制備效率，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。通過本發(fā)明所述方法制備的v12-cd137l重組蛋白能有效提高淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)的增殖、分化水平，同時(shí)還可以增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。

附圖說明

圖1.為v12-cd137l重組蛋白的表達(dá)純化電泳圖譜

m：蛋白分子量marker；

1：誘導(dǎo)表達(dá)前；

2：誘導(dǎo)表達(dá)后；

3：誘導(dǎo)后破菌液；

4：破菌液上清；

5：柱層析上樣；

6：柱層析流穿；

7：柱層析洗脫。

圖2.為v12-cd137l重組蛋白純化樣品分析

m：蛋白分子量marker；

1、2：純化的v12-cd137l重組蛋白樣品

圖3.v12-cd137l蛋白對小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的體外增殖作用

a：v12-cd137l蛋白5ug/ml處理淋巴細(xì)胞

b：v12-cd137l蛋白1ug/ml處理淋巴細(xì)胞

c:單獨(dú)cd137l蛋白重組5ug/ml處理淋巴細(xì)胞

d:單獨(dú)cd137l蛋白重組1ug/ml處理淋巴細(xì)胞

e:透析緩沖液處理淋巴細(xì)胞

f：細(xì)胞空白組

圖4.v12-cd137l蛋白對艾滋病病毒gp120蛋白小鼠體內(nèi)免疫的增強(qiáng)作用（酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法）

a:單獨(dú)的v12-cd137l蛋白免疫

b:單獨(dú)的艾滋病病毒gp120蛋白免疫

c:v12-cd137l蛋白和艾滋病病毒gp120蛋白共同免疫。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，但不是限制本發(fā)明，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1v12-cd137l重組蛋白的制備

(1)以seqidno.1所述氨基酸序列為模板，利用密碼子兼并原則以及大腸桿菌對密碼子的使用頻率，設(shè)計(jì)出表達(dá)v12-cd137l重組蛋白的核苷酸序列，并在該核苷酸序列5’端引入組氨酸標(biāo)簽catcaccatcatcaccac，最終設(shè)計(jì)獲得seqidno.2基因序列。通過人工基因合成技術(shù)合成seqidno.2基因序列，并通過ndeⅰ和xbaⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)將seqidno.2基因插入pet28a大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒seqidno.2-pet28a。

(2)取含有大腸桿菌bl21（de3）感受態(tài)細(xì)胞50微升的1.5毫升離心管一個(gè)，管置于冰上放置5分鐘，加入10納克seqidno.2-pet28a重組質(zhì)粒，輕輕混勻，并于冰上孵育30分鐘；將離心管置于42℃水浴鍋中放置90秒，迅速取出置于冰上放置5分鐘；向離心管中加入900微升lb液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45分鐘，取培養(yǎng)產(chǎn)物200微升涂布于直徑10厘米的lb固體培養(yǎng)基平皿中，37℃培養(yǎng)過夜。最終得到表達(dá)seqidno.2基因序列的重組大腸桿菌單克隆菌落。

(3)挑取重組大腸桿菌單克隆菌落，置于100毫升lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜活化；將活化后的菌液按1：100的比例接種于新鮮的lb液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)菌體od600至0.6，然后加誘導(dǎo)劑（iptg）至1毫摩爾/毫升進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為20℃，連續(xù)誘導(dǎo)18小時(shí)，誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后樣品取樣進(jìn)行電泳分析（見圖1所示）。

(4)8000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌落，棄上清，所得沉淀用破菌緩沖液以1：10的質(zhì)量體積比（g/v）重懸，并用超音儀超聲破菌，超聲后菌液用離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集沉淀。

(5)將破菌離心后沉淀用平衡液溶解，15000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集上清。所得上清液用1毫升柱體積的鎳離子親和層析柱進(jìn)行層析純化，層析條件如下：先用10毫升破菌緩沖液平衡層析柱，然后取10毫升破菌離心上清液以1毫升/分鐘的流速上樣至層析柱中，再用10毫升破菌緩沖液平衡層析柱，最后用洗脫液洗脫得到v12-cd137l重組蛋白純化液（圖1所示）。

(6)將所得v12-cd137l重組蛋白純化液進(jìn)行還原性蛋白電泳，結(jié)果顯示（見圖2所示）所得v12-cd137l重組蛋白單體分子量為32千道爾頓（kd）左右。

(7)將所得v12-cd137l重組蛋白純化液置于8000道爾頓透析袋中，用透析液進(jìn)行透析，獲得透析后的v12-cd137l重組蛋白。

(8)透析后的v12-cd137l重組蛋白用細(xì)菌內(nèi)毒素去除試劑去除內(nèi)毒素，并用0.22微米過濾器過濾除菌，即得所需的v12-cd137l重組蛋白。

所用溶液如下：

lb液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，加水溶解定容至1升。

lb固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，瓊脂粉15克，加水定容至1升。

破菌緩沖液：三羥甲基氨基甲烷2.4克,氯化鈉29.22克，加水溶解定容至1升，調(diào)節(jié)ph值至8.0。

平衡液：甘氨酸1.5克,氯化鈉29.22克，尿素480g，咪唑3.4克，加水溶解定容至1升，調(diào)節(jié)ph值至9.0。

洗脫液：甘氨酸1.5克,氯化鈉29.22克，尿素480g，咪唑34克，加水溶解定容至1升，調(diào)節(jié)ph值至9.0。

透析液：甘氨酸1.5克，二硫蘇糖醇0.15克，吐溫200.6克加水溶解定容至1升，調(diào)節(jié)ph值至8.0。

實(shí)施例2v12-cd137l蛋白對小鼠淋巴細(xì)胞的體外增殖作用

（1）取babl/c小鼠處死，在無菌條件下取脾臟輕輕碾壓，獲得脾臟細(xì)胞懸液。

（2）所得脾臟細(xì)胞懸液用紅細(xì)胞裂解液作用5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄上清，再用無血清rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌兩次，最后將細(xì)胞沉淀重懸于一定量的血清rpmi-1640培養(yǎng)基中，獲得小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。

（3）將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液稀釋至5×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100微升。

（4）同時(shí)cd137l重組蛋白和所得v12-cd137l蛋白細(xì)胞培養(yǎng)液分別稀釋成系列濃度5毫克/毫升、1毫克/毫升，分別取各個(gè)濃度的蛋白1微升加至步驟（3）所述的含有淋巴細(xì)胞的孔板中，每個(gè)濃度的蛋白做三個(gè)細(xì)胞復(fù)孔，以蛋白的透析緩沖液作為陰性對照，以不做任何處理的細(xì)胞作為空白組。

（5）將用v12-cd137l蛋白刺激的淋巴細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

（6）在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入10微升cck-8細(xì)胞增殖檢測試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在酶標(biāo)儀中用以630納米為參比波長讀取各孔的od450（450納米波長下的吸光度值），結(jié)果見圖3所示。

（7）加入v12-cd137l蛋白的淋巴細(xì)胞其od450要明顯高于加入單純cd137l重組蛋白，說明加入v12-cd137l蛋白的淋巴細(xì)胞其體外增殖水平要明顯高于單獨(dú)cd137l重組蛋白。

實(shí)施例3酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法檢測v12-cd137l蛋白對艾滋病病毒gp120蛋白的體內(nèi)免疫增強(qiáng)作用

（1）實(shí)驗(yàn)動物每組設(shè)三只babl/c小鼠，分為三個(gè)組：v12-cd137l蛋白組、艾滋病病毒gp120蛋白組以及艾滋病病毒gp120蛋白和v12-cd137l蛋白共同免疫組。其中，艾滋病病毒gp120蛋白組接種量為10微克，v12-cd137l蛋白接種量為5微克，每只小鼠間隔兩天加強(qiáng)免疫，共接種三次。

（2）在初次免疫第7天處死小鼠，在無菌條件下取脾臟輕輕碾壓，獲得脾臟細(xì)胞懸液。

（3）所得脾臟細(xì)胞懸液用紅細(xì)胞裂解液作用5分鐘，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄上清，再用無血清rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌兩次，最后將細(xì)胞沉淀重懸于一定量的血清rpmi-1640培養(yǎng)基中，獲得小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。

（4）將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液稀釋至1×10⁶個(gè)細(xì)胞/毫升，按照酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫檢測說明書進(jìn)行操作。

（5）結(jié)果顯示：v12-cd137l蛋白自身不會引起小鼠產(chǎn)生特異性γ干擾素表達(dá)水平，但是v12-cd137l蛋白與艾滋病病毒gp120蛋白聯(lián)合免疫可以有效提高小鼠特異性γ干擾素的表達(dá)水平（見圖4所示）。

sequencelisting

<110>浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院

<120>一種v12-cd137l重組蛋白及其制備和應(yīng)用

<130>一種v12-cd137l重組蛋白及其制備和應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>283

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

metcysthraspleuasnthrasnasnthrthrasnthrthrgluleu

151015

serileilevalvaltrpgluglnargglylysglyglumetargasn

202530

cysserpheasnilethrthrserileargasplysvalglnargglu

354045

tyralaleuphetyrlysleuaspvalgluproileaspaspasnlys

505560

asnthrthrasnasnthrlystyrargleuileasncysleualacys

65707580

protrpalavalserglyalaargalaserproglyseralaalaser

859095

proargleuarggluglyprogluleuserproaspaspproalagly

100105110

leuleuaspleuargglnglymetphealaglnleuvalalaglnasn

115120125

valleuleuileaspglyproleusertrptyrseraspproglyleu

130135140

alaglyvalserleuthrglyglyleusertyrlysgluaspthrlys

145150155160

gluleuvalvalalalysalaglyvaltyrtyrvalphepheglnleu

165170175

gluleuargargvalvalalaglygluglyserglyservalserleu

180185190

alaleuhisleuglnproleuargseralaalaglyalaalaalaleu

195200205

alaleuthrvalaspleuproproalaserserglualaargasnser

210215220

alapheglypheglnglyargleuleuhisleuseralaglyglnarg

225230235240

leuglyvalhisleuhisthrglualaargalaarghisalatrpgln

245250255

leuthrglnglyalathrvalleuglyleupheargvalthrproglu

260265270

ileproalaglyleuproserproargserglu

275280

<210>2

<211>876

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atgcatcaccatcatcaccactgtactgacctgaacaccaacaatactactaacaccact60

gaactgagcattattgttgtatgggagcagcgtggtaagggtgaaatgcgcaattgtagc120

ttcaacattaccacctccattcgcgataaagtacagcgtgaatacgctctgttctacaaa180

ctggatgttgaaccaattgacgataacaagaacaccaccaacaacaccaaatatcgtctg240

attaactgtctggcgtgtccgtgggcagtgtccggtgctcgcgcttctccgggtagcgca300

gcatctccacgtctgcgtgaaggcccagaactgtctccggacgatccggcaggcctgctg360

gatctgcgtcagggcatgttcgcgcaactggtggcacagaacgttctgctgattgatggc420

ccactgtcctggtacagcgatccgggtctggcaggtgtttctctgactggtggcctgtct480

tacaaagaggacactaaggagctggtagtggcgaaagctggtgtatactacgtattcttc540

caactggagctgcgtcgtgtggttgctggcgaaggctctggtagcgtgtccctggcgctg600

catctgcaaccgctgcgtagcgcagcgggtgcagcggctctggcgctgaccgtggatctg660

ccaccggcatctagcgaggcacgtaacagcgctttcggtttccagggtcgtctgctgcac720

ctgtctgccggtcagcgtctgggcgttcacctgcacaccgaggcacgtgcacgtcacgct780

tggcaactgactcagggtgcaactgtactgggcctgttccgtgtaactccggagattccg840

gcaggtctgccgtctccgcgttccgaataactcgag876