本發(fā)明涉及一種單克隆抗體的制備方法，特別涉及一種基于結(jié)構(gòu)類似物交叉反應性制備玉米赤霉醇高靈敏度單克隆抗體的方法。
背景技術：
：alpha-玉米赤霉醇，又稱玉米赤霉醇(zearalanol,zal)，化學名稱右環(huán)十四酮酚，是霉菌毒素玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)的還原產(chǎn)物，是一種植物性雌激素，能提高植物抗寒抗凍能力。上世紀60年代發(fā)現(xiàn)zal具有促進反芻動物體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積的功能，能夠明顯提高牛羊飼料轉(zhuǎn)化效率，縮短牛羊育肥周期，因此被當作反芻動物促生長劑廣泛應用，較為普遍的是采用埋置形式。隨后研究證明，zal對單胃動物如大鼠、狗及猴子是有害的，特別是對生殖方面有危害。雖然zal在體內(nèi)大部分會被代謝掉，但仍有一部分會殘留在埋置部位。如果食用含有zal殘留的牛羊肉，會導致食用者促性腺激素水平降低、內(nèi)分泌失調(diào)、生長發(fā)育障礙和人體第二性征發(fā)育不良，而且還具有潛在的致癌性。1996年，歐盟明確禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用zal，要求向歐盟各國輸入的畜牧產(chǎn)品不得檢出其殘留物。2002，我國農(nóng)業(yè)部第193號公告中明確禁止zal作為增重劑用于任何食源性動物，并切在食源性動物的任何可食組織中均不得檢測到。但是由于zal作為牛羊增重劑增重效果好、經(jīng)濟回報高等特點，仍被非法使用。為了減少zal危害，專家學者建立了很多種zal檢測方法。目前常用的檢測方法包括理化法如hplc，gc/ms，lc/ms等，免疫學檢測方法如放射免疫分析法(ria)、elisa、熒光免疫分析(fia)、化學發(fā)光免疫分析(clia)及免疫傳感器(immunosensor)。理化檢測方法雖然準確、靈敏度高，但耗時長，費用高。而免疫學檢測方法簡單，靈敏度高，特異性強，耗時短，費用低，使用便捷，可進行大批量篩檢，因而近些年免疫學檢測方法得到快速發(fā)展。決定免疫學檢測方法靈敏度的關鍵是抗體的質(zhì)量，目前有關報道zal免疫學檢測抗體靈敏度均是ng級，有的甚至是更高，主要是因為zal人工抗原的質(zhì)量不確定。在制備人工抗原過程中完全或部分改變了zal物質(zhì)的抗原決定簇，因此導致制備的抗體靈敏度不高，甚至不能刺激機體產(chǎn)生抗zal抗體。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有的zal抗體制備存在的不足，本發(fā)明從抗原制備源頭開始，通過抗體的非特異性反應(交叉反應性)，利用zal結(jié)構(gòu)類似物抗原制備，zal阻斷elisa篩選，建立一種zal抗體制備新方法，為研發(fā)高靈敏的zal免疫學檢測方法奠定了基礎。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種玉米赤霉酮人工抗原的制備方法，包括以下步驟：(1)稱取2mgzan溶解于2ml無水吡啶中，然后加入4mg的cmo，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上115℃控溫回流2h，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥；用甲醇洗滌制備的干燥物2次，每次1ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥；用1ml雙蒸水重新溶解所得干燥物，2m的naoh調(diào)節(jié)溶液ph值到8.0；用等體積甲苯抽提3次，棄甲苯層，留水相層；最后把所得水相用等體積乙酸乙酯萃取3次，棄水相，留乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到zan-o；(2)用1mldmf溶解zan-o，磁力攪拌，攪拌的同時加入2mgedc和1.2mgnhs，繼續(xù)攪拌2h，記為a液；(3)稱取5mgbsa加入500μl質(zhì)量分數(shù)0.3％nahco3溶液中，記為b液；(4)將b液進行磁力攪拌，邊攪拌邊緩慢滴加入a液，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌2h；(5)取出步驟(4)的a和b混合液，裝入制備好的透析袋內(nèi)，對pbs透析3天，第一天換透析液8次，第二天換透析液6次，第三天換透析液4次，得到zan-o-bsa。采用同樣的方法，用ova替代bsa，制備得到zan-o-ova。一種基于結(jié)構(gòu)類似物交叉反應性制備玉米赤霉醇高靈敏度單克隆抗體的方法，包括以下步驟：(1)動物免疫選取健康的spf級6周齡雌性balb/c小鼠6只，利用zan-o-bsa進行免疫，免疫劑量每次50μgzan-o-bsa/只；采用背部皮下的免疫方式，4-6個點注射，共免疫四次，免疫間隔3-4周；第一次免疫時把zan-o-bsa用pbs稀釋成100μgzan-o-bsa/200μl，然后加入等量的fca乳化，充分乳化后，注入balb/c小鼠皮下200μl；后續(xù)三次強化免疫時，用fia替換fca進行乳化；(2)免疫效果測定四免10天后，將免疫balb/c小鼠斷尾采血10μl，加入到990μlpbs中，5000rpm離心10min，棄沉淀留上清用于血清效價和抑制效價的測定；(3)陽性雜交瘤篩選選取血清效價高，抑制效價好的balb/c小鼠作為細胞融合用小鼠；用高壓無菌處理的pbs稀釋zan-o-bsa至50μgzan-o-bsa/200μl，直接注射到融合用小鼠腹腔進行超強免疫；3天后，摘取眼球放血，完畢后抻頸處死小鼠，小鼠尸體置于75％酒精中浸泡5min；超凈臺上無菌取小鼠脾臟與ns0細胞進行融合，小鼠脾臟細胞與ns0細胞融合后，均勻的融合細胞懸液按100μl/孔分別加入到96孔酶標板上，共鋪板10塊酶標板，960個孔，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中；再篩選能分泌抗zal單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞；(4)單克隆抗體的制備向balb/c小鼠體內(nèi)注入石蠟400μl/只以誘發(fā)炎癥，7-10天后注入制備好的能分泌抗zal單克隆抗體的雜交瘤細胞，觀察小鼠腹部變化，當小鼠腹部出現(xiàn)明顯腫大且腹部皮膚緊繃時采集腹水，然后3000r/min離心5min，去細胞及雜質(zhì)留上清，得到玉米赤霉醇單克隆抗體。一種基于玉米赤霉酮人工抗原制備的玉米赤霉醇高靈敏度單克隆抗體建立的玉米赤霉醇酶聯(lián)免疫、化學發(fā)光、時間分辨、熒光偏振檢測方法。一種基于玉米赤霉酮人工抗原制備的玉米赤霉醇高靈敏度單克隆抗體在制備玉米赤霉醇膠體金試紙條及拉曼增強膠體金試紙條方面的應用。一種基于玉米赤霉酮人工抗原制備的玉米赤霉醇高靈敏度單克隆抗體在制備玉米赤霉醇試劑盒方面的應用。半抗原、抗原和抗體之間的特異性結(jié)合，其分子機制是抗原分子表面存在著能與抗體相互作用的部位即抗原決定簇，是抗原表位的空間結(jié)構(gòu)與抗體分子超變區(qū)互補以及氫鍵、疏水性、靜電作用等形成的低能勢共同作用的結(jié)果，也即抗體是從抗原決定簇的立體結(jié)構(gòu)而不是從抗原的全面分子排列來“認識”抗原的，因此，半抗原分子的空間構(gòu)象對抗體免疫學特性有決定性影響，半抗原分子改造或偶聯(lián)過程中如果空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，則很可能制備不出所需要的抗體。zan的分子量為320.38，屬于小分子半抗原物質(zhì)，由于其自身結(jié)構(gòu)簡單，只具有免疫反應性，可以與相應的抗體結(jié)合；但不具有免疫原性，因此不能直接刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，必須與大分子的載體物質(zhì)如bsa，ova，匙孔血藍蛋白(klh,keyholelimpethemocyanin)或非抗原性的多聚賴氨酸等偶聯(lián)后，才能具有免疫原性，通過刺激動物機體產(chǎn)生針對zan的抗體。小分子與載體蛋白偶聯(lián)是否成功需要進行質(zhì)量鑒定，鑒定方法一般包括紫外掃描鑒定、凝膠電泳鑒定、紅外光譜法(ir)鑒定、質(zhì)譜鑒定及動物免疫鑒定。紫外掃描、凝膠電泳、紅外光譜及質(zhì)譜鑒定只是根據(jù)物質(zhì)特征吸收峰有無變化、載體蛋白分子質(zhì)量變化情況來初步判定半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)在一起，但不能確定偶聯(lián)方式是否正確，即偶聯(lián)過程中是否對半抗原的特征結(jié)構(gòu)(半抗原的抗原決定簇)產(chǎn)生影響，如果偶聯(lián)過程中半抗原的抗原決定簇被破壞，則即使半抗原與載體蛋白偶聯(lián)在一起，能刺激動物機體產(chǎn)生抗體，但所產(chǎn)生的抗體并不是針對半抗原的抗體。因此，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)是否成功，是否能刺激機體產(chǎn)生針對半抗原的抗體，最好的方法是通過免疫動物來確定，或者用已知的半抗原的抗體來確定。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)制備的玉米赤霉烯酮抗體與玉米赤霉酮有交叉反應性，但和bsa及ova沒有交叉反應性，因此，本發(fā)明用制備的zan-o-bsa及zan-o-ova包板測定zen抗體效價，以確定是否偶聯(lián)正確，結(jié)果兩個人工抗原均能測定到zen抗體效價，說明本發(fā)明的偶聯(lián)方法正確，且制備的人工抗原是成功的，制備過程并沒有改變zan的抗原決定簇，為后面抗體的制備奠定了良好的基礎。zal及zan均屬于小分子化合物，根據(jù)分子抗原決定簇數(shù)目計算公式，分子量小于1萬，抗原決定簇只有1個。zan和zal二者只是在七位碳原子上結(jié)構(gòu)有所不同，zal的c7位碳原子為羥基，而zan為酮基，二者的抗原決定簇可能有一定的交叉重合，因此產(chǎn)生交叉反應性。以前的研究證明zen抗體與zan及zal有一定的交叉反應，說明三者的抗原決定簇至少有部分是重疊的。從zen結(jié)構(gòu)上分析可以看出zen中c11-c12位點雙鍵肯定是抗原決定簇的一部分，同時c7位點的結(jié)構(gòu)也應該抗原決定簇一部分，正是由于這兩個部位結(jié)構(gòu)的不同，導致zen單克隆抗體與zan及zal交叉反應率的不同，也導致本發(fā)明中制備的zal單克隆抗體與zen及zal交叉反應率的不同。以往在對zal苯環(huán)上的羥基時改造制備人工抗原時，由于破壞了或至少是部分破壞了抗原決定簇，因此導致制備的抗體靈敏性不高，甚至制備的抗體不是真正的zal抗體，因此用zal阻斷zal-o-ova與zal-o-bsa免疫動物產(chǎn)生的抗體反應時，并沒有見到阻斷作用或阻斷效果不好。而用zan肟化改造c7位的酮基時，改造后其結(jié)構(gòu)與zal結(jié)構(gòu)比較相似，抗原決定簇比較吻合，因此zan-o-bsa免疫動物產(chǎn)生的抗體，可以與zal反應，而且反應靈敏度比較高。本發(fā)明利用制備的人工抗原zan-o-bsa免疫動物產(chǎn)生抗血清，zal作為檢測靶標物，通過阻斷elisa篩選，篩選出分泌抗zal單克隆抗體的雜交瘤細胞，并制備出zal單克隆抗體，該抗體靈敏度高ic50為577pg/ml，親和力強?；诒景l(fā)明所制備的單克隆抗體，可以建立玉米赤霉醇酶聯(lián)免疫、化學發(fā)光、時間分辨、熒光偏振等免疫學檢測方法，并可制備玉米赤霉醇膠體金試紙條及拉曼增強膠體金試紙條等快速檢測產(chǎn)品。本發(fā)明制備的zal抗體與其結(jié)構(gòu)類似物(β-zal、α-zel、β-zel、zan、zen)有或多或少的交叉反應性，用此抗體建立zal免疫學檢測方法進行樣品檢測時，可以進行zal及結(jié)構(gòu)類似物的多殘留檢測。附圖說明圖1為6號免疫小鼠血清抑制曲線圖。圖2為zal單克隆抗體腹水的抑制曲線圖。圖3為zal單克隆抗體腹水親和力測定圖。具體實施方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為本領域的常規(guī)方法，或按照制造廠商所建議的條件與實施步驟。本發(fā)明所用實驗材料主要為：1、試劑α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,zal)、β-玉米赤霉醇(β-zal)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-zel)、β-玉米赤霉烯醇(β-zel)、玉米赤霉酮(zearalanone,zan)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)及黃曲霉毒素b1(afb1)等毒素標準品、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)、牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)購自于sigma-aldrich公司。赭曲霉毒素a(ota)、伏馬菌素b1(fb1)、t-2毒素及嘔吐毒素(don)等毒素標準品、edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)由thermoscientific公司生產(chǎn)；弗氏完全佐劑(fca)及弗氏不完全佐劑(fia)購自于pierce公司；羧甲基羥胺半鹽酸鹽(cmo)購自日本東京化成工業(yè)株式會社；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)等其他試劑均購自于市售，均為國產(chǎn)分析純或更高級別試劑。2、溶液0.01m，ph7.4磷酸鹽緩沖液(pbs)，室溫保存(注：用于動物免疫時必須經(jīng)高壓滅菌處理)。0.05m，ph9.6碳酸鹽緩沖液(cbs)，室溫保存。elisa實驗洗液pbst，pbs+5％tween-20，室溫保存。顯色液a，含有濃度5.315mm的過氧化脲及濃度0.446mm的非那西丁的ph5.0乙酸鈉-檸檬酸緩沖液(0.1m乙酸鈉溶液：0.1m檸檬酸溶液＝3:17，v/v)，冷藏避光保存；顯色液b，含有濃度6.639mm的tmb的甲醇與甘油等量混合溶液；使用時顯色液a和顯色液b等量混合均勻。終止液：2m硫酸溶液。3、實驗動物及細胞系spf級6周齡雌性balb/c小鼠，由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室實驗動物中心繁殖飼養(yǎng)。細胞融合所用ns0細胞系，英國動物健康研究院惠贈，河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室實傳代培養(yǎng)。實施例1、zan人工抗原1、zan人工抗原的制備(1)稱取2mgzan溶解于2ml無水吡啶中，然后加入4mg的cmo，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上115℃控溫回流2h，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥；用甲醇洗滌制備的干燥物2次，每次1ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥；再用1ml雙蒸水重新溶解所得干燥物(甲醇洗滌后的旋干物)，2m的naoh調(diào)節(jié)溶液ph值到8.0；用等體積甲苯抽提3次，棄甲苯層，留水相層；最后把所得水相用等體積乙酸乙酯萃取3次，棄水相，留乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到zan-o；(2)用1mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解zan-o，磁力攪拌，攪拌的同時加入2mgedc和1.2mgnhs，繼續(xù)攪拌2h，記為a液；(3)稱取5mgbsa加入500μl質(zhì)量分數(shù)0.3％nahco3溶液中，記為b液；(4)將b液進行磁力攪拌，邊攪拌邊緩慢滴加入a液，滴加結(jié)束后繼續(xù)攪拌2h；(5)取出步驟(4)的a和b混合液，裝入制備好的透析袋內(nèi)，對pbs透析3天，第一天換透析液8次，第二天換透析液6次，第三天換透析液4次，得到zan-o-bsa。采用同樣的方法，用ova(提前一天把ova溶解于質(zhì)量分數(shù)0.3％nahco3溶液)替代bsa，制得zan-o-ova。2、zan人工抗原的質(zhì)量鑒定采用zen單克隆抗體對所制備的人工抗原進行了鑒定，通過紫外掃描測定出制備的人工抗原zan-o-bsa及zan-o-ova的濃度分別為5.78mg/ml和8.9mg/ml。把制備的人工抗原zan-o-bsa及zan-o-ova分別用cbs稀釋到4μg/ml，然后分別包被酶標板，50μl/孔，4℃孵育過夜，或37℃孵育2h，pbst洗滌酶標板4-6次，拍干后每孔加入230mlpbst+5％豬血清封閉酶標板，37℃孵育1h，pbst洗滌酶標板4-6次，拍干，制備出zan-o-bsa及zan-o-ova包被的酶標板。用間接elisa測定zen單克隆抗體效價，根據(jù)效價的有無確定抗原制備是否成功。間接elisa測定zen單克隆抗體效價步驟：(1)取包被好的酶標板，酶標板所有孔先用pbs50μl/孔鋪板，然后第一孔加入用pbs1:5000(v/v)稀釋的zen單克隆抗體50μl，移液槍吹打混勻后，取出50μl加入到第二孔，吹打混勻，取出50μl加入到第三孔，同樣的方法，一直倍比稀釋到第七孔，混勻后，取出50μl棄掉，第八孔作空白對照孔，37℃恒溫箱孵育15min，pbst溶液洗板4-6次，拍干；(2)加入pbs稀釋的1:1000(v/v)的酶標二抗50μl/孔，37℃恒溫箱孵育30min，pbst溶液洗板4-6次，拍干；(3)取等量的顯色液a、b，混合均勻，每孔加入50μl，室溫顯色5-10min，此時孔中溶液顯色深淺不一的藍色，空白孔無色；(4)每孔直接加入終止液50μl；(5)酶標儀450nm處，讀取od450值。測定zen單克隆抗體的效價結(jié)果見表1。從表1的結(jié)果可以看出，使用制備的人工抗原包板后，測定zen單克隆抗體的效價時，顯示zan-o-bsa及zan-o-ova包被的酶標板均能測定出zen單克隆抗體的效價，說明制備的人工抗原是成功的。表1、制備的zan-o-bsa及zan-o-ova包板測定zen單克隆抗體效價的結(jié)果zen單抗稀釋倍數(shù)1×1042×1044×1048×10416×10432×10464×104空白zan-o-bsa＞3.53.0441.8471.0280.5790.3430.2430.064zan-o-ova1.1820.8690.6530.3870.2890.1960.1630.042實施例2、單克隆抗體1、動物免疫及免疫效果測定1.1、動物免疫選取健康的spf級6周齡雌性balb/c小鼠6只，利用zan-o-bsa進行免疫，免疫劑量每次50μg蛋白(zan-o-bsa)/只；采用背部皮下的免疫方式，4-6個點注射，共免疫四次，免疫間隔3-4周。第一次免疫時把zan-o-bsa用pbs稀釋成100μg蛋白/200μl，然后加入等量的fca，充分乳化后(取乳化好的乳液一滴，置于水面上，乳滴浮在水面上，且不發(fā)生擴散，證明乳化完全)，注入balb/c小鼠皮下200μl。后續(xù)三次強化免疫時，用fia替換fca進行乳化即可，其他試劑及程序不變。1.2、免疫效果測定四免10天后，將免疫balb/c小鼠斷尾采血10μl，加入到990μlpbs中，5000rpm離心10min，棄沉淀留上清用于血清抗體效價和血清抗體抑制效價(靈敏性ic50)的測定。2μg/mlzan-o-ova包被酶標板，50μl/孔，4℃孵育過夜，或37℃孵育2h，pbst洗滌酶標板4-6次，拍干后加入230μl/孔pbst+5％豬血清封閉酶標板。間接elisa測定血清抗體效價(測定步驟同zen單克隆抗體效價測定，只是把zen單克隆抗體換成小鼠血清)，p/n≥2.1(待測孔od450/ncod450≥2.1)且待測孔od450≥0.2，則判定為陽性孔(表2)。表2說明zan-o-bsa免疫小鼠后能產(chǎn)生抗體。表2、zan-o-bsa免疫小鼠后血清抗體效價間接競爭(阻斷)elisa測定血清抗體抑制效價測定時，用zal替代zan作為競爭物與酶標板上包被的zan-o-ova競爭結(jié)合血清抗體(表3)。間接競爭(阻斷)elisa測定血清抗體抑制效價步驟為：取包被好的酶標板，第一孔至第六孔分別加入500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.62ng/ml的zal標準液50μl，第七孔和第八孔分別加入50μlpbs，然后第一至第七孔分別加入50μl測定的血清(血清最終稀釋倍數(shù)是抗體效價測定時，od值最為接近于1.0時對應的稀釋值)，37℃恒溫箱孵育15min，pbst溶液洗板4-6次，拍干；后面的步驟與抗體效價測定完全一致。從表3可以看出，500ng/ml以下濃度的zal可以或強或弱地抑制zan-o-ova與血清抗體的結(jié)合。其中6號小鼠抑制效果最好，通過擬合標準曲線(圖1)，可以計算得出ic50為40.04ng/ml，因此選擇6號小鼠作為融合小鼠。表3、zan-o-bsa免疫小鼠后血清抗體抑制效價2、zal單克隆抗體制備及免疫學性能鑒定2.1、陽性雜交瘤篩選選取6號小鼠作為細胞融合用小鼠。用高壓無菌處理的pbs稀釋50μgzan-o-bsa至200μl，不加佐劑，直接注射到融合用小鼠腹腔進行超強免疫。3天后，摘取眼球放血，完畢后抻頸處死小鼠，小鼠尸體置于75％酒精中浸泡5min。超凈臺上無菌取小鼠脾臟與ns0細胞進行融合。小鼠脾臟細胞與ns0細胞融合后，均勻的融合細胞懸液按100μl/孔分別加入到96孔酶標板上，共鋪板10塊酶標板，960個孔，放于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中；再進行陽性雜交瘤細胞篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，融合細胞鋪板3天后，960孔中898孔有細胞生長，而其余62個孔沒有看見細胞生長，即93.54％細胞孔有細胞生長，說明細胞融合率比較高。待融合細胞生長至覆蓋培養(yǎng)孔1/3孔底面積時，將培養(yǎng)細胞板各孔的細胞上清取出25μl，加入到每孔含有25μlpbs的由2μg/mlzan-o-ova包被的酶標板孔中，間接elisa測定細胞上清od450值(步驟同zen單克隆抗體效價測定，但第一步中只加入細胞上清，不用倍比稀釋)，od450值在1.0以上的認為是陽性孔，共有44孔，陽性孔率為4.58％，以5ng/ml、2ng/ml兩個濃度zal測定44陽性孔的抑制效價，其中2孔細胞上清ic50在2ng/ml以下。將這2孔細胞轉(zhuǎn)至24孔酶標板擴大培養(yǎng)亞克隆，用1ng/mlzal測定抑制效價，選擇ic50在1ng/ml以下陽性孔，最終得到一株能分泌抗zal單克隆抗體的雜交瘤細胞株12b10a7。2.2、腹水制備體內(nèi)誘生腹水法批量制備抗體。向balb/c小鼠體內(nèi)注入石蠟400μl/只以誘發(fā)炎癥，7-10天后注入制備好的能分泌抗zal單克隆抗體的雜交瘤細胞株12b10a7，觀察小鼠腹部變化，一般小鼠在注射10天左右，小鼠腹腔變大，小鼠腹腔皮膚緊繃時，用消毒的大號針頭刺破腹腔，收集腹腔液體即為腹水。將腹水3000r/min離心5min，去細胞及雜質(zhì)留上清，得到玉米赤霉醇單克隆抗體。2.3、免疫學性能鑒定2.3.1、濃度測定采用onedroptm光譜儀測定單克隆抗體蛋白濃度。通過光譜儀測定，所制備的單克隆抗體蛋白濃度約為20.29mg/ml。2.3.2、單克隆抗體腹水效價測定間接elisa測定單克隆抗體腹水效價，步驟同實施例2中1.2免疫效果測定的血清抗體效價測定(表4)。表4結(jié)果表明，間接elisa測定單克隆抗體腹水效價為2.56×105。表4、zal單克隆抗體腹水效價2.3.3、單克隆抗體腹水抑制效價測定間接競爭elisa測定單克隆抗體腹水抑制效價，步驟同實施例2中1.2免疫效果測定的血清抗體抑制效價測定，其抑制曲線見圖2。線性方程為y＝-0.5483x+0.3691，相關系數(shù)r2＝0.9666，通過公式計算ic50為0.577ng/ml。2.3.4、單克隆抗體特異性鑒定同樣采用間接競爭elisa測定單克隆抗體特異性，把競爭物從zal替換為其他zal結(jié)構(gòu)類似物、其他毒素以及人工抗原制備時所用的載體蛋白bsa和ova，單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果見表5。表5結(jié)果可以看出，所制備的單克隆抗體除了與α-zal反應外，與zan有77.65％的交叉反應率，與β-zal有43.06％的交叉反應率，與α-zel和β-zel分別有15％左右的交叉反應率，與zen有近10％的交叉反應率，與其他霉菌毒素如afb1、ota、fb1、t-2毒素、don以及載體蛋白bsa、ova交叉反應率均小于0.1％。表5、zal單克隆抗體特異性2.3.5、單克隆抗體親和力測定pbs稀釋zan-o-ova成0.5μg/ml和1μg/ml兩個濃度進行包板。pbs把單克隆抗體稀釋至8μg/ml。在兩個zan-o-ova濃度包被的酶標板上，分別加入倍比稀釋上述已知質(zhì)量濃度的單克隆抗體，測定od450值。根據(jù)親和力常數(shù)計算公式，計算親和力常數(shù)ka值。親和力測定曲線如圖3。zal單克隆抗體與抗原結(jié)合達半飽和時對應zal單克隆抗體的濃度分別是0.8095μg/ml和0.4898μg/ml，將所得的值換算成摩爾濃度值帶進公式得ka為4.7×1011l/mol。而一般認為，親和常數(shù)為107-1012l/mol時表明抗體具有高親和力，由此可知本發(fā)明獲得了高親和力的zal單克隆抗體。以上所述僅為本發(fā)明最佳的實施例，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12