本發(fā)明屬于微生物次生代謝產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域，涉及原料藥品皂素的制備工藝優(yōu)化，具體涉及利用盾葉薯蕷內(nèi)生菌發(fā)酵制備薯蕷皂素的方法。

背景技術(shù)：

盾葉薯蕷(dioscoreazingiberensisc.h.wright)為我國(guó)特有的薯蕷品種，又稱為黃姜，是生產(chǎn)皂素的主要植物原料。薯蕷皂素被醫(yī)藥界稱為“藥用黃金”，其可以合成皮質(zhì)激素、蛋白同化激素、性激素等數(shù)千種甾體激素類藥物。盾葉薯蕷為獲取薯蕷皂素的重要原料之一。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)138種含薯蕷皂素的薯蕷屬植物，但是只有10％左右的薯蕷屬植物具有工業(yè)利用價(jià)值。隨著薯蕷皂素市場(chǎng)需求缺口的不斷增大，盾葉薯蕷已遭受掠奪式的采挖，使得這種珍貴的野生資源逐漸枯竭。長(zhǎng)期人工種植盾葉薯蕷已造成薯蕷種質(zhì)資源退化，使其皂素產(chǎn)量不斷降低，且對(duì)山區(qū)脆弱的生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞。

在傳統(tǒng)的皂素生產(chǎn)過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量廢水。這些廢水中有機(jī)污染物濃度高、色度高、酸度高，因此處理難度極大。盾葉薯蕷的主產(chǎn)區(qū)包括湖北、陜西、河南等省。陜西省常年大面積種植盾葉薯蕷，有80余家皂素生產(chǎn)企業(yè)，加工量約占全國(guó)的50％，其中，漢江流域的上游城市漢中市就有38家皂素生產(chǎn)企業(yè)，每年排放污水大約100多萬(wàn)噸。由于許多企業(yè)的皂素生產(chǎn)廢水直接排入漢江，對(duì)南水北調(diào)中線水源區(qū)水質(zhì)污染十分嚴(yán)重。受國(guó)家環(huán)保政策影響，全國(guó)一半以上的皂素提取企業(yè)停產(chǎn)，導(dǎo)致皂素價(jià)格不斷上升。

產(chǎn)需缺口大、野生盾葉薯蕷資源日益減少、人工種植質(zhì)量下降以及環(huán)境受到破壞等，已成為薯蕷皂素生產(chǎn)過(guò)程中的眾多難題，嚴(yán)重影響了我國(guó)醫(yī)藥工業(yè)對(duì)甾體激素類藥物的研發(fā)與應(yīng)用。為了尋求上述問(wèn)題的解決方案，需要改變薯蕷皂素的現(xiàn)有生產(chǎn)模式，這方面的改變主要體現(xiàn)為：一方面選育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的薯蕷新品種，采用科學(xué)的、規(guī)模化的種植方法；另一方面探索環(huán)保、高效的薯蕷皂素制備途徑。

針對(duì)困擾皂素生產(chǎn)企業(yè)的污染和原料匱乏等問(wèn)題，研究者開展了大量的研究并應(yīng)用于實(shí)踐。當(dāng)前的研究和應(yīng)用方向主要是利用分離菌株發(fā)酵或自然發(fā)酵盾葉薯蕷地下莖，再分離薯蕷皂素，與常規(guī)酸水解法相比，盡管能夠充分利用盾葉薯蕷的有效成分，明顯提高皂素的提取率，但生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生大量酸性廢水的問(wèn)題沒(méi)有得到根本解決。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是探索環(huán)保、高效的薯蕷皂素制備新工藝，克服采用現(xiàn)有技術(shù)制備薯蕷皂素的諸多技術(shù)問(wèn)題。植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與其宿主相同或相似的生理活性物質(zhì)。基于此，本專利的發(fā)明人將盾葉薯蕷內(nèi)生菌作為研發(fā)方向，探尋從盾葉薯蕷內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中提取薯蕷皂素的可能性。這將是解決工業(yè)污染和尋找新資源的可行途徑之一。

本專利的發(fā)明人于2006年從盾葉薯蕷的根狀莖中篩選出一株盾葉薯蕷內(nèi)生細(xì)菌。通過(guò)菌落特征、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性鑒定該菌株屬于芽孢桿菌屬。隨后用分子生物學(xué)的方法，對(duì)該菌株的its序列、16srdna序列進(jìn)行測(cè)定，并用blast進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與bacilluslicheniformisasc585的16srdna同源性為99％，從而確定其屬于地衣芽孢桿菌，并命名為endophyticbacilluslicheniformissyb06.11.1。有關(guān)該菌株的篩選方法以及菌株的鑒定和保藏信息，在專利zl200810150274.3中已有明確記載，在此不作贅述。在本專利中，上述地衣芽孢桿菌endophyticbacilluslicheniformissyb06.11.1簡(jiǎn)記為syt1，本專利中的syt1與專利zl200810150274.3中明確記載的菌株相同。通過(guò)對(duì)syt1的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行柱層析和結(jié)晶，得到結(jié)晶體，后經(jīng)nmr確定其結(jié)構(gòu)為甾體皂甙元，并對(duì)該皂甙元的熔點(diǎn)和旋光度進(jìn)行了測(cè)定，確定syt1菌株可以發(fā)酵生產(chǎn)薯蕷皂素。

基于上述研究，本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)對(duì)syt1的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速等因素進(jìn)行優(yōu)化，并利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了薯蕷皂素的分離工藝。

具體而言，本發(fā)明給出的盾葉薯蕷內(nèi)生菌發(fā)酵制備薯蕷皂素的方法，所述薯蕷皂素從盾葉薯蕷內(nèi)生菌的發(fā)酵液中分離獲得，其發(fā)酵方法包括下述步驟：

1)將所述盾葉薯蕷內(nèi)生菌接入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，得到發(fā)酵菌種。

2)將步驟1)所述發(fā)酵菌種接入盛裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，開啟攪拌，設(shè)定發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度24-32℃、發(fā)酵ph5.5-8.5、通氣量1.0-5.5l/min。

3)酸解步驟2)獲得的發(fā)酵液，中和后得到所述薯蕷皂素。

進(jìn)一步地。本發(fā)明所述盾葉薯蕷內(nèi)生菌為地衣芽孢桿菌syb06.11.1，菌株保存于cgmcc，保藏時(shí)間為2008年1月10日，保藏編號(hào)2334。

本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)發(fā)酵溫度的調(diào)控策略進(jìn)行了優(yōu)化。在所述發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵溫度的調(diào)控策略為0-21h控制發(fā)酵溫度為32℃，21-26h控制發(fā)酵溫度為31℃，26-32h控制發(fā)酵溫度為30℃，32-40h控制發(fā)酵溫度為29℃，40-48h控制發(fā)酵溫度為28℃，48-62h控制發(fā)酵溫度為27℃，62-79h控制發(fā)酵溫度為26℃，79-106h控制發(fā)酵溫度為25℃，106-160h控制發(fā)酵溫度為24℃。

同樣地。本發(fā)明的實(shí)施例也對(duì)發(fā)酵ph調(diào)控策略進(jìn)行了優(yōu)化。在所述發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵ph調(diào)控策略為0-17h控制發(fā)酵ph為5.5，17-30h控制發(fā)酵ph為6.0，30-43h控制發(fā)酵ph為6.5，43-56h控制發(fā)酵ph為7.0，56-75h控制發(fā)酵ph為7.5，75-107h控制發(fā)酵ph為8.0，107-168h控制發(fā)酵ph為8.5。

上述發(fā)酵方法，在其步驟3中，向發(fā)酵液中加入濃鹽酸，在沸水浴條件下酸水解發(fā)酵液，待水解液冷卻至室溫后，向水解液中加入堿溶液調(diào)節(jié)水解液ph至中性。

本發(fā)明的實(shí)施例建立了5l小罐發(fā)酵生產(chǎn)皂素的基本工藝，自然地，這種發(fā)酵罐的容積為5l。

作為一優(yōu)化的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵條件設(shè)定為發(fā)酵溫度26-30℃、發(fā)酵ph6-8、通氣量3.0-5.5l/min、發(fā)酵時(shí)間160-180h。

適用于本發(fā)明的發(fā)酵方法的所述種子培養(yǎng)基的組成為牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、水1000ml，種子培養(yǎng)基的ph7.0-7.2。

適用于本發(fā)明的發(fā)酵方法的所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為蔗糖100g、蛋白胨50g、酵母粉15g、氯化鈉7g、磷酸氫二鉀1g、玉米漿6g、糊精14g、碳酸鈣10g、水1000ml。

本發(fā)明所述盾葉薯蕷內(nèi)生菌發(fā)酵制備薯蕷皂素的方法，至少具有下述的有益效果或優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明以盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1作為薯蕷皂素?cái)U(kuò)大化制備的菌株，建立了5l小罐發(fā)酵生產(chǎn)薯蕷皂素的基本工藝。通過(guò)對(duì)syt1的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速等單因素進(jìn)行優(yōu)化，使得薯蕷皂素產(chǎn)量得以顯著提高，大幅縮短了發(fā)酵周期。本發(fā)明所述薯蕷皂素生產(chǎn)工藝，大大提高了薯蕷皂素的產(chǎn)量，克服現(xiàn)有薯蕷皂素生產(chǎn)方法的產(chǎn)量小、耗能高的技術(shù)缺陷。本發(fā)明為syt1菌株開發(fā)的前期應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是不同發(fā)酵溫度下，薯蕷皂素的產(chǎn)量變化趨勢(shì)圖。

圖2是發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵溫度的調(diào)控策略圖。

圖3是最優(yōu)溫度控制組與恒溫對(duì)照組的薯蕷皂素的產(chǎn)量變化對(duì)比圖。

圖4是不同ph下薯蕷皂素的產(chǎn)量變化趨勢(shì)圖。

圖5是發(fā)酵過(guò)程中的ph調(diào)控策略圖。

圖6是最優(yōu)ph控制組與對(duì)照組的薯蕷皂素的產(chǎn)量變化對(duì)比圖。

圖7是不同通氣量對(duì)薯蕷皂素產(chǎn)量的影響。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及其效果，現(xiàn)將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)闡述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種盾葉薯蕷內(nèi)生菌發(fā)酵制備薯蕷皂素的方法。這種制備薯蕷皂素的方法不同于現(xiàn)有從薯蕷中分離純化獲得薯蕷皂素的制備方法，其以盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1為出發(fā)菌株，通過(guò)特定的發(fā)酵工藝從其發(fā)酵液中分離獲得。本實(shí)施例采用的盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1為地衣芽胞桿菌syb06.11.1，菌株保存于cgmcc，保藏時(shí)間為2008年1月10日，保藏編號(hào)2334。有關(guān)該菌株的分離鑒定，以及其代謝產(chǎn)物盾葉薯蕷皂苷元的分離參見專利zl200810150274.3。

本實(shí)施例所述發(fā)酵制備薯蕷皂素的方法，包括下述步驟。

第一步，盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1的擴(kuò)大培養(yǎng)。

具體操作描述為：將純化的盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1接入種子培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，待其種群群落擴(kuò)展到一定數(shù)量后，即可作為下一步的發(fā)酵菌種。

涉及的種子培養(yǎng)基，其組成為牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、水1000ml，種子培養(yǎng)基的ph7.0-7.2。

第二步，接種發(fā)酵。

將第一步獲得的發(fā)酵菌種接入盛裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，開啟攪拌，設(shè)定發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。關(guān)于攪拌及其攪拌速度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用人工攪拌或是電機(jī)驅(qū)動(dòng)的方式，以電機(jī)驅(qū)動(dòng)攪拌為優(yōu)選，攪拌速度設(shè)定為100-500rpm，進(jìn)一步優(yōu)選地，經(jīng)多次的實(shí)踐嘗試，以400rpm的攪拌速度，可以獲得較為理想的發(fā)酵效果。其他的發(fā)酵條件還包括發(fā)酵溫度24-32℃、發(fā)酵ph5.5-8.5、通氣量1.0-5.5l/min。對(duì)于發(fā)酵時(shí)間，其應(yīng)具有一個(gè)合理的時(shí)間段，但生產(chǎn)實(shí)際中，向發(fā)酵罐中接入發(fā)酵菌種即說(shuō)明發(fā)酵的開始，也就有目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的生成，只不過(guò)在發(fā)酵初期，目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的量較少，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到一定程度后，發(fā)酵液中的目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物的量區(qū)域平穩(wěn)。在本實(shí)施例中，理論上而言，發(fā)酵時(shí)間可以設(shè)定為0-180h，或者可以將發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至210h，這也是本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本實(shí)施例可以直接獲知的。進(jìn)一步優(yōu)選地，發(fā)酵時(shí)間可以初步設(shè)定為160-180h。

涉及的發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為蔗糖100g、蛋白胨50g、酵母粉15g、氯化鈉7g、磷酸氫二鉀1g、玉米漿6g、糊精14g、碳酸鈣10g、水1000ml。

第三步，酸解發(fā)酵液。

要想從盾葉薯蕷內(nèi)生菌的發(fā)酵液中分離獲得薯蕷皂素，還需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酸解，經(jīng)中和后得到所述薯蕷皂素。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證盾葉薯蕷內(nèi)生菌發(fā)酵制備薯蕷皂素，本實(shí)施例還進(jìn)一步給出薯蕷皂素的檢測(cè)方法及定量方法。

向樣品發(fā)酵液中加入濃鹽酸，使發(fā)酵液中鹽酸濃度達(dá)到2mol/l。在沸水浴條件下酸水解4h，冷卻至室溫，向水解液中加入naoh溶液調(diào)節(jié)ph至中性，過(guò)濾后留濾渣。在90℃水浴條件下，使用250ml沸程為60-90℃的石油醚對(duì)濾渣進(jìn)行索氏提取4h，提取得到的皂素粗品用于發(fā)酵液中皂素濃度測(cè)定。

用氯仿將培養(yǎng)皿內(nèi)揮發(fā)至干的薯蕷皂素粗提物溶解，將溶解液轉(zhuǎn)入10ml磨口具塞試管中，再用少量氯仿將培養(yǎng)皿沖洗兩次，以保證粗提物中的薯蕷皂素完全被洗下，沖洗液同樣轉(zhuǎn)入磨口具塞試管中，用氯仿定容至10ml，取4ml已定容的皂素粗品溶液，然后加入4mlliebermann-barcharad試劑，用氯仿滴加至刻度，塞上磨口塞，搖勻，于50℃中恒溫水浴60min，取出冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為460nm處測(cè)定其吸光值。

實(shí)施例2

本實(shí)施例建立了5l小罐發(fā)酵生產(chǎn)皂素的基本工藝，即用容積為5l的發(fā)酵罐進(jìn)行盾葉薯蕷內(nèi)生菌發(fā)酵。本實(shí)施例對(duì)上述的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，尋求發(fā)酵法生產(chǎn)薯蕷皂素的工藝條件。

(1)溫度調(diào)控

圖1給出了不同發(fā)酵溫度下，發(fā)酵液中薯蕷皂素的產(chǎn)量變化趨勢(shì)圖。由圖1可知，分別設(shè)置發(fā)酵溫度為24℃、26℃、28℃、30℃和32℃，進(jìn)行盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1小型發(fā)酵罐(5l)分批發(fā)酵，以薯蕷皂素產(chǎn)量最大建立目標(biāo)函數(shù)，計(jì)算得到一個(gè)隨發(fā)酵時(shí)間變化的最適溫度軌跡。在上述數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，得到隨時(shí)間變化的最優(yōu)溫度控制策略，調(diào)控后的溫度策略如圖2所示，0-21h控制發(fā)酵溫度為32℃，21-26h控制發(fā)酵溫度為31℃，26-32h控制發(fā)酵溫度為30℃，32-40h控制發(fā)酵溫度為29℃，40-48h控制發(fā)酵溫度為28℃，48-62h控制發(fā)酵溫度為27℃，62-79h控制發(fā)酵溫度為26℃，79-106h控制發(fā)酵溫度為25℃，106-160h控制發(fā)酵溫度為24℃。圖3給出了最優(yōu)溫度控制組與恒溫對(duì)照組的薯蕷皂素的產(chǎn)量變化對(duì)比圖。由圖3可知，產(chǎn)物生成最優(yōu)控制試驗(yàn)組和恒溫對(duì)照組的產(chǎn)物濃度分別達(dá)到了72.34mg/l和58.16mg/l，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比產(chǎn)物產(chǎn)量增加了24.38％。

(2)ph調(diào)控

圖4給出了不同ph下薯蕷皂素的產(chǎn)量變化趨勢(shì)圖。由圖4可知，分別設(shè)置發(fā)酵ph為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，進(jìn)行盾葉薯蕷內(nèi)生菌syt1小型發(fā)酵罐(5l)分批發(fā)酵，以薯蕷皂素產(chǎn)量最大建立目標(biāo)函數(shù)，計(jì)算得到一個(gè)隨發(fā)酵時(shí)間變化的最適ph軌跡。在上述數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，得到隨時(shí)間變化的最優(yōu)ph控制策略，調(diào)控后的ph策略如圖5所示，0-17h控制發(fā)酵ph為5.5，17-30h控制發(fā)酵ph為6.0，30-43h控制發(fā)酵ph為6.5，43-56h控制發(fā)酵ph為7.0，56-75h控制發(fā)酵ph為7.5，75-107h控制發(fā)酵ph為8.0，107-168h控制發(fā)酵ph為8.5。圖6給出了最優(yōu)ph控制組與對(duì)照組的薯蕷皂素的產(chǎn)量變化對(duì)比圖。從圖6中可以看出，最優(yōu)ph控制試驗(yàn)組和對(duì)照組的產(chǎn)物濃度分別達(dá)到了85.06mg/l和70.49mg/l，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比產(chǎn)物產(chǎn)量增加了20.68％。

(3)通氣量?jī)?yōu)化

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行通氣量的優(yōu)化，涉及的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蔗糖100g、蛋白胨50g、酵母粉15g、氯化鈉7g、磷酸氫二鉀1g、玉米漿6g、糊精14g、碳酸鈣10g、水1000ml。圖7顯示了不同通氣量對(duì)薯蕷皂素產(chǎn)量的影響。由圖7可知，分別設(shè)置通氣量為1l/min、3l/min、4.5l/min、5.5l/min，進(jìn)行5l小罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定薯蕷皂素的產(chǎn)量。通氣量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵條件設(shè)定為發(fā)酵溫度28℃，攪拌速度400rpm，發(fā)酵時(shí)間168h。不同通氣量所對(duì)應(yīng)的薯蕷皂素產(chǎn)量見圖7，從圖7中可以看出，通氣量的增加能顯著提高薯蕷皂素的產(chǎn)量，最佳通氣量為5.5l/min，相應(yīng)的薯蕷皂素產(chǎn)量為437.36mg/l，是對(duì)照組(1l/min)產(chǎn)量69.59mg/l的6.28倍。

上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做了進(jìn)一步的敘述，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。