本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類萘醌二聚體，以及其作為nf-κb信號通路抑制劑或抗腫瘤藥物的應(yīng)用，以及以其作為有效成分的藥物組合物，其制備方法及在制備治療與預(yù)防nf-κb信號通路相關(guān)的炎癥疾病與癌癥的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1986年，sen和baltimore在成熟b細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子nf-κb，其為能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κb序列特異性結(jié)合的蛋白因子。nf-κb廣泛參與多種生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及腫瘤發(fā)生發(fā)展等重要的生理病理過程，是高等生物細(xì)胞中最重要的信號通路之一，其在細(xì)胞中的活動(dòng)受到嚴(yán)格的調(diào)控。研究表明，在哺乳動(dòng)物中，nf-κb家族成員主要有五種，分別是rela(p65)、relb、c-rel、p50/p105(nf-κb1)和p52/p100(nf-κb2)，且能形成同或異二聚體，其中p65/p50是最主要的形式。nf-κb信號通路的激活主要分為兩類：經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，ikk的激活及iκbα的降解是該通路激活的關(guān)鍵。經(jīng)典途徑中，tnf-α與tnfr1結(jié)合后，sodd(silencerofdeathdomain)從受體中釋放出來，使信號蛋白tradd(tnfr1-associateddeathdomain)、traf2、traf5及rip1(receptor-interactingprotein1)等連續(xù)募集到胞膜的tnfr1受體上，隨后traf招募ubc13和uev1a，使rip1發(fā)生泛素化，繼而使其與tab2相互作用，募集tak1激酶復(fù)合體。另一方面，rip1通過泛素化與nemo結(jié)合，達(dá)到對ikk復(fù)合體的募集，最終實(shí)現(xiàn)tak1對ikkβ的磷酸化激活。激活的ikk使iκbα在特殊位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，隨后泛素化并被26s蛋白酶降解。p105亞基在gsk3β和tpl2的作用下發(fā)生磷酸化，并隨后降解，形成自由的p65/p50復(fù)合體。p65/p50入核后經(jīng)過一系列的入核后修飾過程(磷酸化、乙?；?、甲基化等)后，結(jié)合相應(yīng)的κb位點(diǎn)，并激活nf-κb靶基因。非經(jīng)典途徑中，nemo是非必需的，受胞外刺激后，如cd40，ltβr，baff等，結(jié)合相應(yīng)受體，導(dǎo)致traf相關(guān)蛋白的募集及隨后的nik和ikkα的激活。激活的ikkα導(dǎo)致抑制蛋白p100發(fā)生蛋白水解過程，形成p52，relb/p52入核，結(jié)合相應(yīng)的κb位點(diǎn)，并激活nf-κb靶基因。此途徑中，上游激酶主要為nik，它受到一個(gè)復(fù)雜的蛋白連接酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)。在正常的靜息細(xì)胞中，nik被泛素化，并經(jīng)蛋白酶體降解，不能表達(dá)發(fā)揮作用。當(dāng)受到胞外刺激，阻止nik泛素化，故其被激活。

許多研究表明，在慢性炎癥導(dǎo)致癌癥的過程中，nf-κb信號通路有著非常重要的作用，能作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)。該通路能調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，涉及到免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生存、炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。許多疾病的發(fā)生都和該通路異常有關(guān)，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中nf-κb常處于異常激活狀態(tài)?；诖耍l(fā)現(xiàn)、設(shè)計(jì)或合成該通路的抑制劑成為熱點(diǎn)。有多種方式能抑制該通路活性，如抑制ikk激酶活力，抑制蛋白iκbα泛素化，抑制nf-κb核轉(zhuǎn)位等。目前，有多于700種nf-κb信號通路抑制劑，其種類有：抗氧化劑、肽類、小分子dna/rna、細(xì)菌及病毒蛋白、小分子化合物等，在這些抑制劑中，僅硼替佐米作為唯一一個(gè)被美國fda批準(zhǔn)的靶向nf-κb的小分子藥物。因此，發(fā)展結(jié)構(gòu)新穎、特異性強(qiáng)的nf-κb信號通路抑制劑，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

現(xiàn)有技術(shù)中未見有茜草科植物來源的萘醌二聚體rubioncolinc(1)作為nf-κb信號通路抑制劑和抗腫瘤藥物的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的空白，本發(fā)明的目的在于提供一類萘醌二聚體類化合物；提供該類化合物的制備方法；還提供了該類化合物的醫(yī)藥應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

一種如下述結(jié)構(gòu)式所示的萘醌二聚體rubioncolinc(1)或其藥用鹽，

一種以所述的rubioncolinc(1)或其藥用鹽為有效成分的nf-κb信號通路抑制劑。

一種以所述的rubioncolinc(1)或其藥用鹽為有效成分的抗腫瘤藥物。

一種藥物組合物，其中含有治療有效量的萘醌二聚體rubioncolinc(1)或其藥用鹽和藥學(xué)上可接受的載體。

所述的萘醌二聚體rubioncolinc(1)或其藥用鹽在制備治療與預(yù)防nf-κb信號通路異常激活的相關(guān)炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。

所述的萘醌二聚體rubioncolinc(1)或其藥用鹽在制備治療與預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。

如所述的萘醌二聚體rubioncolinc(1)或其藥用鹽在制備治療與預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用，其中所述的癌癥為基底細(xì)胞癌、髓母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、痣樣基底細(xì)胞癌綜合征、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、胰腺癌、軟骨肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、膽管癌、肝癌、膀胱癌、血管瘤、慢性髓細(xì)胞性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

本發(fā)明還提供了制備所述的萘醌二聚體rubioncolinc(1)的方法，包括以下步驟：取茜草屬植物的根及根莖，經(jīng)干燥、粉碎，通過甲醇回流充分提取后，得甲醇總浸膏；利用硅膠和sephadexlh-20分離材料和技術(shù)對低極性部位進(jìn)行分離純化，即得到萘醌二聚體。

更具體地，制備所述的萘醌二聚體rubioncolinc(1)的方法，包括以下步驟：取茜草屬植物柄花茜草(rubiapodanthad.)的根及根莖，經(jīng)干燥、粉碎后，利用甲醇回流提取2-5次，每次時(shí)間為3-4小時(shí)，提取液經(jīng)減壓濃縮得甲醇總浸膏；總浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/甲醇(100:0，9:1，8:2，7:3，1:1，0:100)梯度洗脫，得六個(gè)組分fr.1-fr.6；其中低極性部位fr.1再經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚/丙酮(30:1，15:1，5:1，1:1)梯度洗脫，得4個(gè)亞組分fr.1-1-fr.1-4；fr.1-3亞組分經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，得3個(gè)亞組分fr.1-3-1-fr.1-3-3；fr.1-3-2經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚/丙酮(7:1)為洗脫劑，得到化合物rubioncolinc(1)。

本發(fā)明對茜草科植物柄花茜草進(jìn)行了萘醌二聚體化學(xué)成分研究，利用硅膠和sephadexlh-20分離材料和技術(shù)，從中獲得了萘醌二聚體rubioncolinc(1)。之后利用11種腫瘤細(xì)胞株模型及人肝癌hepg2裸鼠移植瘤模型評價(jià)萘醌二聚體rubioncolinc(1)體內(nèi)外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示該萘醌二聚體具有體內(nèi)外抗腫瘤活性；利用熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)，在hek293t細(xì)胞中評價(jià)該萘醌二聚體對nf-κb信號通路的影響，結(jié)果顯示該萘醌二聚體具有抑制該通路的活性，為一類新型的抑制劑。

本發(fā)明的所述的萘醌二聚體或其藥理學(xué)上容許的鹽，可以列舉例如鹽酸、硝酸、硫酸、磷酸、氫溴酸等無機(jī)酸，或者馬來酸、富馬酸、酒石酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、甲磺酸、對苯甲磺酸、己二酸、棕櫚酸、單寧酸等有機(jī)酸，鋰，鈉、鉀等堿金屬，鈣、鎂等堿土金屬，賴氨酸等堿性氨基酸成的鹽。

本發(fā)明所述的治療炎癥相關(guān)疾病和癌癥的藥物組合物，由萘醌二聚體化合物與藥學(xué)上可接受的載體制備的藥物劑型包括片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等。由于萘醌二聚體可從柄花茜草以及同屬植物中提取分離，而片劑、膠囊、口服液、針劑、注射用凍干劑或粉針劑等藥物劑型的制備也是本領(lǐng)域的常規(guī)知識。因此，由萘醌二聚體化合物與相應(yīng)載體制備的各種藥物劑型也能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)。

上文中所述的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如：稀釋劑、賦形劑如水等，填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和硬脂酸鎂、以及聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

本發(fā)明化合物可以以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其他液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。

本發(fā)明所述的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1％～99.5％的活性成分萘醌二聚體rubioncolinc(1)，最優(yōu)選含有重量比為0.5％～95％的活性成分萘醌二聚體rubioncolinc(1)。

本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是0.01～10mg/kg體重，優(yōu)選0.1～5mg/kg體重。可以一次或多次施用。

有益效果：本發(fā)明的rubioncolinc(1)為從柄花茜草(rubiapodanthad.)分離得到的萘醌二聚體，具有體內(nèi)外抗腫瘤和nf-κb信號通路抑制活性；所述萘醌二聚體的制備方法能快速分離純化目標(biāo)化合物rubioncolinc(1)，效率高，目的性強(qiáng)，操作方便，可控性和重現(xiàn)性好，溶劑可以反復(fù)回收利用，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)；所述研究對后續(xù)相關(guān)藥物的優(yōu)化和開發(fā)具有重要的價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的萘醌二聚體rubioncolinc(1)的制備方法流程圖；

圖2為本發(fā)明的萘醌二聚體rubioncolinc(1)的體內(nèi)抗腫瘤活性；

圖3為本發(fā)明的萘醌二聚體rubioncolinc(1)的nf-κb信號通路抑制活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，用具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的改進(jìn)都屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

萘醌二聚體rubioncolinc(1)的制備方法(流程見圖1)，包括以下步驟：

取柄花茜草的根及根莖10kg，經(jīng)干燥、粉碎后，甲醇回流提取3次(20l×3)，時(shí)間為4h、3h和3h，提取液經(jīng)減壓濃縮后的甲醇總浸膏1.42kg。總浸膏經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿/甲醇(100:0，9:1，8:2，7:3，1:1，0:100)梯度洗脫，得六個(gè)組分fr.1-fr.6；其中低極性部位fr.1(53g)再經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚/丙酮(30:1，15:1，5:1，1:1)梯度洗脫，得4個(gè)亞組分fr.1-1-fr.1-4；fr.1-3(17g)亞組分經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，1:1的氯仿/甲醇為洗脫劑，得3個(gè)亞組分fr.1-3-1-fr.1-3-3；fr.1-3-2(5.2g)反復(fù)經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚/丙酮(7:1)為洗脫劑，得到化合物rubioncolinc(1)(31mg)。

實(shí)施例2

本發(fā)明萘醌二聚體rubioncolinc(1)利用srb比色法評價(jià)其對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(a549)、人肝癌細(xì)胞株(bel-7402、hepg2和smmc-7721)、人胃腺癌細(xì)胞株(bgc-823和sgc-7901)、人前列腺癌細(xì)胞株(du145)、人宮頸癌細(xì)胞株(hela)、人乳腺癌細(xì)胞株(mda-mb-231和mcf-7)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(u251)等11種腫瘤細(xì)胞株(所有細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)的細(xì)胞毒活性，發(fā)現(xiàn)萘醌二聚體具有細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)原理、方法和結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)原理：srb(磺酰羅丹明b)，為一種水溶性蛋白染料，分子中具有磺酸基陰離子，在弱酸性條件下可與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合，用堿性溶液tris-base溶解細(xì)胞內(nèi)的srb并在540nm處測定其吸光值，從而反映細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，即可反映細(xì)胞的存活率。

實(shí)驗(yàn)方法：以含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基將細(xì)胞配制成細(xì)胞懸浮液，以每孔3000或5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，37℃培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的萘醌二聚體rubioncolinc(1)處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加入25μl預(yù)冷的50％三氯乙酸水溶液固定細(xì)胞1h或4度過夜，洗凈晾干。以每孔100μl的0.4％srb的1％醋酸水溶液染細(xì)胞15分鐘，以1％醋酸水溶液洗凈。后以每孔100μl的10mmtris-base溶液溶解細(xì)胞內(nèi)srb，并于540nm處測定其吸光值。根據(jù)結(jié)果計(jì)算抑制率及ic50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1：

表1萘醌二聚體rubioncolinc(1)的細(xì)胞毒活性(ic50，μm)

實(shí)施例3

本發(fā)明的萘醌二聚體rubioncolinc(1)利用人肝癌hepg2裸鼠移植瘤模型評價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果顯示萘醌二聚體具有較好的體內(nèi)抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下：

將人肝癌細(xì)胞hepg2(來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)用無血清dmem培養(yǎng)基配置成濃度1×10⁵個(gè)/ml細(xì)胞懸浮液，將其接種于babl/c裸鼠左側(cè)腋窩皮下，生長7天后，形成荷瘤小鼠模型。取接種生長良好的荷瘤小鼠，隨機(jī)分組，通過腹腔注射萘醌二聚體rubioncolinc(1)(40mg/kg，20mg/kg和10mg/kg)，隔天給藥一次，給藥14天后處死所有動(dòng)物，剝瘤稱重，計(jì)算抑瘤率，統(tǒng)計(jì)處理；5-氟尿嘧啶(10mg/kg)為陽性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，抑瘤率(％)＝(對照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％，rubioncolinc(1)的高和中劑量組的抑瘤率為38.5％和25.7％，陽性藥抑制率為64.5％。

實(shí)施例4

本發(fā)明萘醌二聚體rubioncolinc(1)利用熒光素酶雙報(bào)告基因法檢測其對nf-κb信號通路的抑制活性，結(jié)果顯示萘醌二聚體能較好的抑制nf-κb信號通路活性。實(shí)驗(yàn)原理、方法和結(jié)果如下：

采用螢光素酶雙報(bào)告基因法檢測化合物對nf-κb信號通路活性的影響。將處于對數(shù)生長期的hek293t細(xì)胞(來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)接種于24孔板中，貼壁后，使用lipofectamine2000(invitrogen)轉(zhuǎn)染5×κb-luciferase和ptk-renilla，繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)，后與不同濃度的rubioncolinc(1)孵育6小時(shí)，再以10ng/mltnf-α作用2小時(shí)后，移出上清，細(xì)胞在室溫下振蕩裂解(passsivelysisbuffer，promega)15分鐘，離心收集上清，用dualluciferasereporterassaysystem(promega)測定雙熒光素酶活力。結(jié)果如圖3所示，由圖可見，rubioncolinc(1)能較好的抑制tnf-α誘導(dǎo)的nf-κb信號通路的激活，ic50為2.97μm，是一類新型的nf-κb信號通路天然抑制劑。

本發(fā)明的rubioncolinc(1)為從柄花茜草(rubiapodanthad.)分離得到的萘醌二聚體，具有體內(nèi)外抗腫瘤和nf-κb信號通路抑制活性。本發(fā)明能作為制備抗腫瘤藥物制劑和前體藥物的應(yīng)用，具有制備成本低、毒性小、抗腫瘤效果好等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)施例5

實(shí)施例1所得化合物1，加入4％的硫酸乙醇溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成硫酸鹽化合物1。

實(shí)施例6

實(shí)施例1所得化合物1，加入4％的鹽酸溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成鹽酸鹽化合物1。

實(shí)施例7

實(shí)施例1所得化合物1，加入4％的酒石酸溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成酒石酸鹽化合物1。

實(shí)施例8：

實(shí)施例1所得化合物1，加入4％的檸檬酸溶液，ph＝4，過濾，干燥，制成檸檬酸鹽化合物1。

實(shí)施例9

片劑：實(shí)施例1所得化合物1或?qū)嵤├?-8所得的鹽10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg。

制備方法：將化合物或其鹽、乳糖和淀粉混和，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實(shí)施例10

安瓿劑：實(shí)施例1所得化合物1或?qū)嵤├?-8所得的鹽2mg，氯化鈉10mg。

制備方法：將化合物或其鹽和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。

實(shí)施例11

注射用凍干劑：實(shí)施例1所得化合物1或?qū)嵤├?-8所得的鹽10mg，碳酸氫鈉2mg，甘露醇252mg。

制備方法：將碳酸氫鈉、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30分鐘除熱原，過濾除去活性碳，在濾液中加入化合物或其鹽，超聲處理使溶解，用1n鹽酸調(diào)節(jié)ph為5.0-7.0，微孔濾膜濾過，加注射用水，分裝，冷凍干燥，上塞，軋蓋，即得。

實(shí)施例12

膠囊劑：實(shí)施例1所得化合物1或?qū)嵤├?-8所得的鹽10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg。

制備方法：將化合物或其鹽與助溶劑混和，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個(gè)膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。