本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種具有誘導(dǎo)活化型彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞死亡，延緩活化型彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的多肽的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用及其制備。

背景技術(shù)：

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，可以分為非霍奇金淋巴瘤(nhl)和霍奇金淋巴瘤(hl)兩大類。在我國(guó)，近年來(lái)新發(fā)淋巴瘤病例逐年上升，每年至少超過(guò)25000例，其中90％以上都屬于非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤又可以分成很多種亞型，其中彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤(diffuselargebcelllymphoma,dlbcl)是最長(zhǎng)見(jiàn)的一種亞型，占所有非霍奇金淋巴瘤的40％。根據(jù)分子特征，彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤又可以分為2種主要亞型，生發(fā)中心b細(xì)胞樣型(gcb-dlbcl)和活化b細(xì)胞型(abc-dlbcl)。這兩種分子亞型的病人預(yù)后完全不同，生發(fā)中心b細(xì)胞樣型，表達(dá)正常生發(fā)中心b細(xì)胞特征的基因，預(yù)后較好；活化b細(xì)胞樣(abc-like)型，表達(dá)活化的外周血b細(xì)胞和漿細(xì)胞特征的基因，預(yù)后較差；

近年來(lái)，多個(gè)國(guó)際多中心隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，r+chop方案(美羅華，環(huán)磷酰胺，阿霉素，長(zhǎng)春新堿，潑尼松)是標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案。但是，彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤是一種高度異質(zhì)性的疾病，病人對(duì)于現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案的反應(yīng)具有較大區(qū)別，5年生存率從26到73％。gcb型5年總生存率在75％左右，而abc-like型的治療效果較差，5年總生存率大約在35％左右。由于對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案反應(yīng)較差，abc-like型更需要引入新的特異治療方案，顯著提高abc-like-dlbcl病人的5年生存率。

在分子水平上，abc-like型和gcb型存在明顯不同。abc-likedlbcl細(xì)胞有持續(xù)慢性激活的b細(xì)胞受體(bcr)/nfkb通路，并且此通路的激活是abc-like型細(xì)胞存活的必須條件。因此，針對(duì)bcr/nfkb信號(hào)通路是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，到目前為止，最具有代表性的拉鐵尼伯(ibrutinib)在臨床實(shí)驗(yàn)中的效果明顯，有望不久的將來(lái)能用于臨床治療abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤。拉鐵尼伯的原理就是抑制bcr/nfkb信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶btk來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。但是，臨床上對(duì)于拉鐵尼伯治療的反應(yīng)率不是很高，有些病人具有myd88等蛋白的突變，而對(duì)btk激酶抑制劑具有先天耐藥性。除此之外，在治療過(guò)程中，有些病人也會(huì)出現(xiàn)對(duì)拉鐵尼伯的獲得性耐藥。因此，尋找能特異性抑制abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤的藥物，對(duì)于未來(lái)彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤的病人臨床預(yù)后有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有特異性抑制活化b細(xì)胞(abc-like)型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，和特異性誘導(dǎo)abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞死亡的多肽。并根據(jù)此多肽的氨基酸序列和蛋白的空間結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)出的新的小分子藥物。

本發(fā)明的第一方面，提供一種多肽，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

所述的seqidno:1的序列為：

grkkrrqrrrpqggsghsgvytklcgvfpphlveavm

所述的多肽為37個(gè)氨基酸的肽段(seqidno:1)，其中g(shù)rkkrrqrrrpq為幫助進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的tat序列，ggsghsg為連接肽，vytklcgvfpphlveavm為目標(biāo)序列。此目標(biāo)序列對(duì)應(yīng)的是人regnase-1(又稱zc3h12a或mcpip1)蛋白的第556-573位氨基酸。

本發(fā)明同時(shí)提供了兩個(gè)對(duì)照多肽seqidno:2和seqidno:3：

seqidno:2的序列為grkkrrqrrrpqggsghsggasrgea；此目標(biāo)序列對(duì)應(yīng)的是人的a20(又叫tnfaip3)的第436-442位氨基酸；

seqidno:3的序列為grkkrrqrrrpqggsghsglvprggg；此目標(biāo)序列對(duì)應(yīng)的是人的regnase-1蛋白的第108-114位氨基酸序列。

本發(fā)明的第二方面，提供一種上述的多肽在制備預(yù)防或治療活化b細(xì)胞(abc-like)型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。

所述的多肽特異地抑制abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞死亡。

本發(fā)明的第三方面，提供一種藥物組合物，其包含上述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。

所述的藥物組合物的劑型為注射劑，由所述的多肽按常規(guī)藥劑學(xué)方法制備。

所述的藥學(xué)上可接受的載體為藥學(xué)上可接受的賦形劑，懸浮劑，填充劑和/或稀釋劑。

本發(fā)明的第四方面，提供了能用于新藥開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)，通過(guò)此多肽序列和空間結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)新藥物的方法。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明提供的多肽能夠特異性抑制活化b細(xì)胞型彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)活化b細(xì)胞型彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞死亡，具有在制備防治abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤病變過(guò)程中良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1.cck8表明tat-reg1-ctd抑制abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤hbl-1細(xì)胞增殖，而對(duì)乳腺癌細(xì)胞sum-159和骨髓瘤細(xì)胞u-266不抑制作用。對(duì)照組多肽，tat-reg1-rg和tat-a20-rg對(duì)這3種腫瘤細(xì)胞都無(wú)殺傷作用。

圖2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)表明tat-reg1-ctd抑制abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤hbl-1細(xì)胞增殖和促進(jìn)abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤hbl-1細(xì)胞死亡，而對(duì)乳腺癌細(xì)胞sum-159和骨髓瘤細(xì)胞u-266不抑制作用。對(duì)照組多肽，tat-reg1-rg和tat-a20-rg對(duì)這3種腫瘤細(xì)胞都無(wú)殺傷作用。

圖3.pi染色表明tat-reg1-ctd能特異地促進(jìn)abc-like型彌漫大b細(xì)胞淋巴瘤hbl-1細(xì)胞死亡，而對(duì)乳腺癌細(xì)胞sum-159和骨髓瘤細(xì)胞u-266無(wú)殺傷作用。對(duì)照組多肽，tat-reg1-rg和tat-a20-rg對(duì)這3種腫瘤細(xì)胞都無(wú)殺傷作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

一、實(shí)驗(yàn)材料

tat-reg1-ctd1(seqidno:1)、tat-a20-rg(seqidno:2)、tat-reg1-rg(seqidno:3)(強(qiáng)耀生物)，rpmimediummodified(hyclone)、dmem/highglucose(hyclone)、phosphatebuffferedsaline(1×)(hyclone)、penicillin-streptomycinsolution(hyclone)、胎牛血清(四季青)、cellcountingkit-8(cck-8，dojindolaboratories)、propidiumiodide(pi，sigma)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1、多肽溶液、pi染色液配置

多肽凍干粉溶解于無(wú)菌水中，儲(chǔ)存濃度為1mg/ml，100ul分裝，至于-80℃保存。pi用pbs溶解，儲(chǔ)存濃度為10mg/ml，至于4℃避光保存。

2、細(xì)胞培養(yǎng)

hbl、sum-159細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycinsolution的dmem/highglucose中，u266細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清和1％penicillin-streptomycinsolution的rpmimediummodified中，每2-3d進(jìn)行一次傳代。

3、顯微鏡拍照

將hbl、sum-159和u266分別種于96孔板，分為control組、實(shí)驗(yàn)組和單純培養(yǎng)基組。control組為不加肽的細(xì)胞，單純培養(yǎng)基組為不含肽且不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組為用肽處理的細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。24h后用tat-hu-reg1-ctd1、tat-hu-a20-rg、tat-hu-reg1-rg分別處理細(xì)胞，濃度為30ug/ml和50ug/ml,處理48h，用顯微鏡拍照。

4、cck-8

將hbl、sum-159和u266分別種于96孔板，分為control組、實(shí)驗(yàn)組和單純培養(yǎng)基組。control組為不加肽的細(xì)胞，單純培養(yǎng)基組為不含肽且不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組為用肽處理的細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。24h后用tat-hu-reg1-ctd1、tat-hu-a20-rg、tat-hu-reg1-rg分別處理細(xì)胞，濃度為30ug/ml和50ug/ml,處理48h。每孔加入10ulcck-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2-3h。利用tecanm200酶標(biāo)儀，選擇450nm波長(zhǎng)，檢測(cè)各孔光吸收值。

5、pi染色

將hbl、sum-159和u266分別種于96孔板，分為control組、實(shí)驗(yàn)組和單純培養(yǎng)基組。control組為不加肽的細(xì)胞，單純培養(yǎng)基組為不含肽且不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組為用肽處理的細(xì)胞，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。24h后用tat-hu-reg1-ctd1、tat-hu-a20-rg、tat-hu-reg1-rg分別處理細(xì)胞，濃度為30ug/ml和50ug/ml，處理48h。用0.05mg/mlpi給各組細(xì)胞染色10min，用熒光顯微鏡拍照。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、小分子肽tat-hu-reg1-ctd1顯著抑制細(xì)胞增殖

在臨床上，能特異殺死一種或幾種腫瘤細(xì)胞，但對(duì)別的細(xì)胞沒(méi)有毒副作用的藥物具有重要的腫瘤治療應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)有的治療方法對(duì)abc-dlbcl型腫瘤的效果較差，為了尋找能特異性殺死abc-dlbcl型腫瘤的藥物，我們合成了3個(gè)小分子肽分別命名為tat-hu-reg1-ctd1、tat-hu-a20-rg、tat-hu-reg1-rg。同時(shí)為了證明小分子肽的特異性，我們選取了3種腫瘤細(xì)胞系，分別是乳腺癌細(xì)胞系sum-159，骨髓瘤細(xì)胞u-266，abc-dlbcl細(xì)胞hbl-1。分別用30ug/ml和50ug/ml的小肽處理細(xì)胞24小時(shí)，cck8檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量的多少。結(jié)果顯示小肽tat-hu-reg1-ctd1在30ug/ml和50ug/ml的濃度都能顯著抑制abc-dlbcl細(xì)胞增殖(圖1)，但對(duì)乳腺癌細(xì)胞系sum-159，骨髓瘤細(xì)胞u-266沒(méi)有明顯影響(圖1)。兩個(gè)對(duì)照小分子肽tat-hu-a20-rg和tat-hu-reg1-rg對(duì)abc-dlbcl細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。兩個(gè)對(duì)照小分子肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞系sum-159和骨髓瘤細(xì)胞u-266也沒(méi)有明顯影響。

2、小分子肽tat-hu-reg1-ctd1顯著誘導(dǎo)abc-dlbcl細(xì)胞死亡

為了進(jìn)一步驗(yàn)證小分子肽tat-hu-reg1-ctd1對(duì)abc-dlbcl細(xì)胞的影響，我們直接用光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)觀察。結(jié)果顯示小肽tat-hu-reg1-ctd1在30ug/ml和50ug/ml的濃度都能顯著降低abc-dlbcl細(xì)胞數(shù)量，并誘導(dǎo)部分細(xì)胞崩解而死亡(圖2)。小肽tat-hu-reg1-ctd1對(duì)sum-159和u-266細(xì)胞沒(méi)有明顯影響(圖2)。兩個(gè)對(duì)照小分子肽tat-hu-a20-rg和tat-hu-reg1-rg對(duì)三種細(xì)胞都沒(méi)有明顯影響。

3、小分子肽tat-hu-reg1-ctd1顯著誘導(dǎo)abc-dlbcl細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步理解小分子肽tat-hu-reg1-ctd1對(duì)abc-dlbcl細(xì)胞的作用機(jī)制，我們用pi染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示小肽tat-hu-reg1-ctd1在30ug/ml和50ug/ml的濃度都能顯著誘導(dǎo)abc-dlbcl細(xì)胞凋亡(pi染色陽(yáng)性)(圖3)。小肽tat-hu-reg1-ctd1對(duì)sum-159和u-266細(xì)胞沒(méi)有明顯影響(圖3)。兩個(gè)對(duì)照小分子肽tat-hu-a20-rg和tat-hu-reg1-rg對(duì)三種細(xì)胞都沒(méi)有明顯影響。

四、結(jié)論

本發(fā)明的小分子肽tat-hu-reg1-ctd1能特異地抑制abc-dlbcl增殖；

本發(fā)明的小分子肽tat-hu-reg1-ctd1能特異地促進(jìn)abc-dlbcl死亡；

本發(fā)明的小分子肽tat-hu-reg1-ctd1能特異地誘導(dǎo)abc-dlbcl凋亡。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>南通大學(xué)

<120>一種能特異地殺死活化b細(xì)胞型彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤的多肽及其應(yīng)用

<130>/

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

glyarglyslysargargglnargargargproglnglyglysergly

151015

hisserglyvaltyrthrlysleucysglyvalpheproprohisleu

202530

valglualavalmet

35

<210>2

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

glyarglyslysargargglnargargargproglnglyglysergly

151015

hisserglyglyalaserargglygluala

2025

<210>3

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<400>3

glyarglyslysargargglnargargargproglnglyglysergly

151015

hisserglyleuvalproargglyglygly

2025