本發(fā)明屬于生物信息學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽及其確定、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小反芻獸疫病毒(pprv)屬于麻疹病毒屬(morbillivirus)，是引起山羊和綿羊等小反芻動(dòng)物急性傳染病的病原，該病特點(diǎn)是高發(fā)病率和高死亡率，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)列為法定報(bào)告動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為i類動(dòng)物疫病。最初的報(bào)道小反芻獸疫病毒僅感染山羊和綿羊，但近幾年病毒種間傳播的病例被不斷報(bào)道，目前該病主要分布于非洲和亞洲，正威脅歐洲。

目前，該病的主要預(yù)防手段是弱毒疫苗免疫，但是該疫苗存在熱穩(wěn)定性和毒力反強(qiáng)等問題，并且不利于小反芻獸疫的全球消滅計(jì)劃，hn是鑲嵌在pprv囊膜上的糖蛋白，構(gòu)成病毒粒子表面的纖突，hn蛋白能夠與淋巴細(xì)胞上的slam受體相互作用介導(dǎo)病毒入侵，因此hn蛋白的決定宿主嗜性；另外，因受體slam是主要部分與淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞上，可能是小反芻獸疫病毒導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的主要原因，小反芻獸疫病毒能引起機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，而hn蛋白則是主要的保護(hù)性抗原，hn蛋白是疫苗設(shè)計(jì)和檢測(cè)方法建立的重要靶標(biāo)，因此hn蛋白的抗原表位圖譜繪制和抗體制備具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽。

本發(fā)明的另一目的在于提供該小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽在小反芻獸疫病毒表位疫苗抗原和診斷試劑抗原制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的在于提供該小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位的確定、制備方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列為：h123：¹²³kflnpdreydfrdlr¹³⁷,或/和h185：¹⁸⁵gtgclgrtvtra¹⁹⁶,或/和h487：⁴⁸⁷irgprgrch⁴⁹⁵,或/和h569：⁵⁶⁹ecfpwyhkvwcyhdcli⁵⁸⁵。

一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽在小反芻獸疫病毒表位疫苗抗原和診斷試劑抗原制備中的應(yīng)用。

一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位的確定、制備方法，所述方法包括如下步驟：

計(jì)算模擬：

步驟一，用分子模擬軟件構(gòu)建虛擬hn蛋白頭部3d結(jié)構(gòu)：利用discoverystudiov4.5對(duì)這兩個(gè)目標(biāo)蛋白——野毒株pprvhn和疫苗株pprvhn蛋白進(jìn)行同源模建；其中pprvhw，genbank登錄號(hào)為fj905304；pprvhv，genbank登錄號(hào)：x74443；

步驟二，搜索模板：搜索pdb數(shù)據(jù)庫(www.pdb.org)，尋找通過實(shí)驗(yàn)解析出的同源蛋白的結(jié)構(gòu)，選擇序列一致性在30％以上，并且比對(duì)序列較長(zhǎng)的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)，進(jìn)行后續(xù)的計(jì)算；

步驟三，調(diào)整序列比對(duì)：選取模板蛋白之后，從pdb數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白的空間坐標(biāo)，將得到的模板蛋白序列與目標(biāo)蛋白進(jìn)行比對(duì)；

步驟四，建模：將比對(duì)結(jié)果提交服務(wù)器，根據(jù)模板蛋白的空間坐標(biāo)和序列的相似性推測(cè)結(jié)構(gòu)，從而計(jì)算得到目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)，即每次模建生成至少5個(gè)不同的目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)，要求pdftotalenergy較低的同時(shí)選擇dopescore最低的模型進(jìn)行后續(xù)計(jì)算；

步驟五，優(yōu)化：采用charmm力場(chǎng)，先進(jìn)行steepestdecent優(yōu)化5000步，再進(jìn)行conjugategradient優(yōu)化2000步；

步驟六，評(píng)估結(jié)構(gòu)：采用拉氏構(gòu)象圖分析方法評(píng)估蛋白結(jié)構(gòu)的合理性，若位于不許可區(qū)的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超過5％，則說明模擬的蛋白結(jié)構(gòu)是合理的，可以進(jìn)行后續(xù)的計(jì)算分析；

基于免疫信息學(xué)的預(yù)測(cè)：

步驟一，pprv-hn蛋白b細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)：將pprvhn蛋白的氨基酸序列用iedb、immunomedicinegroup和bepipred免疫信息學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，綜合分析預(yù)測(cè)其b細(xì)胞抗原表位；

步驟二，抗原表位的合成：將軟件預(yù)測(cè)的抗原表位氨基酸序列送genescript公司用多肽合成儀合成，合成后用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析多肽合成的純度及氨基酸的正確性；

抗體的制備；

步驟一，免疫動(dòng)物：具有反應(yīng)原性目的抗原rpprv-hn-f和小反芻獸疫病毒糖蛋白(pprv-glycoprotein)免疫6-8周齡雌性balb/c小鼠，頸背部皮下四點(diǎn)注射，免疫蛋白樣品量為50μg/只，免疫體積200μl/只；首次免疫用等體積弗氏完全佐劑乳化，二次免疫和三次免疫用等體積弗氏不完全佐劑佐劑乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠斷尾采血檢測(cè)血清中的抗體，待抗體效價(jià)高1：10000后方可進(jìn)行四免，四免不用佐劑，腹腔注射；

步驟二，多克隆抗體的純化，將乙醚完全浸潤(rùn)的脫脂棉和小鼠同時(shí)放入麻醉盒，待小鼠完全失去知覺時(shí)，摘取眼球取學(xué)，收集完成后，將小鼠斷頸處死，全血放37℃孵育30分鐘后4℃過夜，4℃，1500rpm，離心15分鐘，取血清，-20℃?zhèn)溆茫?/p>

表位的鑒定：

預(yù)測(cè)的表位經(jīng)過生物合成，鑒定符合實(shí)驗(yàn)要求，使用氨基化酶標(biāo)板作為固相載體的間接elisa方法進(jìn)行；

稀釋：將合成并凍干的表位肽用高壓過的去離子水稀釋成1μg/μl；

表位肽包被：將稀釋好的表位肽包被在氨基化酶標(biāo)板上，每孔50μl包被液，抗原的含量為5μg，4℃過夜；

洗板：將酶標(biāo)孔里的液體盡可能甩盡，然后每孔加入約250μlpbst，靜置3分鐘，重復(fù)三次，最后將酶標(biāo)板在紗布上拍干；

封閉：向酶標(biāo)孔中加入1×封閉液150μl，37℃溫箱孵育1.5小時(shí)后，將酶標(biāo)孔里的封閉液盡可能甩盡，最后將酶標(biāo)板在紗布上拍干后備用；

孵育一抗：用封閉液將單克隆抗體按1:500稀釋，加入酶標(biāo)板每孔50μl，放置37℃溫箱中孵育1小時(shí)；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封閉液將hrp標(biāo)記抗鼠igg二抗按1:5000稀釋，加入酶標(biāo)板每孔50μl，放置37℃溫箱中孵育1小時(shí)；

洗板：同上步洗板；

顯色：每孔加入50μltmb顯色液，避光37℃孵育15分鐘；

終止：每孔加入50μl終止液，終止顯色；

讀?。河媒K點(diǎn)法在波長(zhǎng)450nm處對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，讀取od450nm吸光度值；多表位抗原設(shè)計(jì)：

步驟一：設(shè)計(jì)多表位基因及誘導(dǎo)表達(dá)，將表位按照在天然蛋白中的順序排列，表位之間加gs接頭分子，送南京金斯瑞公司合成基因片段，連接到pet30a載體中，將載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，按照培養(yǎng)溫度37℃，誘導(dǎo)劑iptg終濃度為1.0mm，氨芐青霉素lb培養(yǎng)基，誘導(dǎo)7小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

步驟二：多表位抗原的純化

破碎菌體：將菌體反復(fù)凍融3次，用pbs緩沖液重懸菌體超聲破碎；

離心：將破碎的菌體4℃10000rpm離心20分鐘，分別收集沉淀和上清；

樣品準(zhǔn)備：使用緩沖液i(ph＝7.4)重懸上步收集的沉淀，充分混勻，8000rpm，4℃離心20分鐘，取上清用0.45μm濾器過濾處理待上樣；

平衡ni柱：先在柱子底部加入少量去離子水排除空氣，再裝入2mlni-nat填料，將裝好的柱子用5倍體積的去離子水洗滌以去除乙醇，最后用5倍體積的緩沖液i(ph＝7.4)平衡柱材；

上樣：將濾器過濾處理后的樣品，分次與柱材結(jié)合，靜置，待自然沉降，收集流湍液4℃環(huán)境保存；

洗滌：分次向柱子中加入緩沖液i(ph＝7.4)，總體積應(yīng)大于上樣量的5倍體積；洗脫：使用含有10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、300mm和400mm咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫蛋白，每個(gè)洗脫濃度靜置15分鐘，收集各濃度洗脫液置于冰上；

柱子保存：洗脫步驟完成后，用5倍柱材體積的緩沖液i(ph＝7.4)清洗柱子，加入適量20％乙醇4℃保存；

步驟三：多表位抗原的鑒定

蛋白電泳樣品準(zhǔn)備：取40μl蛋白上述步驟中分離的蛋白樣品于1.5ml離心管中，再加入10μl5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10分鐘，置于4℃冰箱快速降溫；上樣及電泳：取10μl于12％sds-page中，100mv電泳；

轉(zhuǎn)膜：將nc膜剪至與凝膠等量大小，并置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘，按照從負(fù)極到正極的順序分別放置厚濾紙、凝膠、nc膜、厚濾紙，注意應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，200ma恒流濕轉(zhuǎn)100分鐘；

封閉：取出轉(zhuǎn)印后的nc膜，置于適量5％脫脂奶粉中，室溫封閉兩小時(shí)；

加一抗：將封閉完成的nc膜置于5％的bsa中，加入鼠抗his單克隆抗體(稀釋比例1:2500)和羊源小反芻獸疫陽性血清(稀釋比例為1:250)，4℃冰箱過夜孵育；

洗滌：一抗孵育完成后，用pbst搖動(dòng)洗滌3次，每次10分鐘；

加二抗：將nc膜置于兔抗鼠igg-hrp(1:5000比例稀釋)和驢抗羊igg-hrp(1:25000比例稀釋)二抗中，稀釋液為含有5％脫脂奶粉的pbst，室溫?fù)u動(dòng)孵育1小時(shí)；

洗滌：同上步洗滌；

顯色：將洗滌完成的nc膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，混合ecl超敏發(fā)光液a和b，滴在nc膜上室溫孵育3分鐘；

觀察：調(diào)節(jié)不同的曝光時(shí)間，直到清洗看到明顯的條帶；

步驟四：免疫小鼠，將小白鼠分為5組，a組：pbs+弗氏不完全佐劑，b組：疫苗，c組：ehf1+弗氏不完全佐劑，d組：ehf2+弗氏不完全佐劑，e組：ehf3+弗氏不完全佐劑，每組12只小鼠，每只免疫蛋白50μl，免疫體積每只200μl。頸背部分四點(diǎn)皮下注射，21天后再次免疫；

步驟五：小鼠特異性抗體檢測(cè)，0天、7天、14天、28天和35天斷尾采血，37℃孵育30分鐘，4℃過夜，3000rpm離心15分鐘收集血清，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆茫冒籶prv全病毒的間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)抗體水平；

步驟六：小鼠t淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)，檢測(cè)免疫小鼠cd3+cd4+t細(xì)胞和cd3+cd8+t細(xì)胞的增值情況，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)免疫后0天，14天和26天外周血t細(xì)胞，在第35天檢測(cè)脾臟中的t淋巴細(xì)胞，步驟如下：

采血：斷尾采取小鼠抗凝血，每組采集5只小鼠，每只100μl；

抗體孵育：將采集的每只100μl抗凝血平均分成兩份，其中一份加入apchamsteranti-mousecd3e抗體和peratanti-mousecd4抗體各2.5μl，fitcratanti-mousecd8a抗體1μl；另一份加入apchamsterigg1,κisotypecontrol抗體、peratigg2a,κisotypecontrol抗體和fitcratigg2a,κisotypecontrol抗體各2.5μl，混勻后，避光4℃孵育15分鐘；

裂解紅細(xì)胞：加入1ml1×紅細(xì)胞裂解液，混勻，避光室溫孵育10分鐘；

洗滌：加入1mlhank’s液,混勻，1000g離心5分鐘，重復(fù)2次；

過濾：上樣前用高壓后的300目尼龍網(wǎng)過濾；

上樣：將準(zhǔn)備好的樣品放在流式細(xì)胞儀上樣架上，準(zhǔn)備收集細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果是：

在veroe6細(xì)胞接種小反芻獸疫病毒，檢測(cè)多克隆抗體與小反芻獸疫病毒的反應(yīng)原性以及抗體的特異性。結(jié)果顯示，rpprv-hn-f多克隆抗體(圖1a)與vero細(xì)胞中的小反芻獸疫病毒反應(yīng)，表現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，不與vero細(xì)胞反應(yīng)沒有熒光(圖1c)；小鼠陰性血清不與vero細(xì)胞中的小反芻獸疫病毒反應(yīng)(圖1b)，沒有熒光。表明，rpprv-hn-f多克隆抗體是小反芻獸疫病毒的特異性抗體；pprv-glycoprotein多克隆抗體(圖2)與小反芻獸疫病毒同樣具有良好的反應(yīng)原性和特異性。

用western-blotting方法對(duì)獲得的rpprv-hn-f(圖3a)和pprv-glycoprotein(圖3b)多克隆抗體進(jìn)行了基于原核表達(dá)純化rpprv-hn-f蛋白的特異性檢測(cè)，空載體表達(dá)菌作為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示rpprv-hn-f蛋白泳道出現(xiàn)單一條帶，而空載體表達(dá)菌泳道沒有條帶，表明兩種多克隆抗體與rpprv-hn-f蛋白具有良好的反應(yīng)原性，并且不與空載體表達(dá)菌反應(yīng)具有良好的特異性。

應(yīng)用氨基化酶標(biāo)板檢測(cè)了候選表位與rpprv-hn-f多克隆抗體(圖4)和pprv-glycoprotein(圖5)多克隆抗體的反應(yīng)原性，確定候選表位h123、h185、h487和h569。利用discoverystudiov4.5模擬了hn蛋白的頭部結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示h185、h487和h569表位位于蛋白的表面(圖6藍(lán)色部分)。

合成的三種多表位基因間接到pet30a載體中，經(jīng)過雙酶切鑒定(圖7)表明目的條帶正確的插入到了載體相應(yīng)的位置上。送金唯智生物公司進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序的結(jié)果與合成序列比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)有突變情況，表明正確的序列插入到了載體正確的位置上。

質(zhì)粒經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)，純化獲得了高純度的抗原蛋白(圖8)。

利用his標(biāo)簽抗體對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行western-blotting特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，在陽性克隆泳道中出現(xiàn)特異性的條帶，而空載體宿主菌泳道中沒有條帶(圖9)，表明宿主菌成功表達(dá)了his融合蛋白，即為目的蛋白。

檢測(cè)小鼠外周血抗體水平，基于全病毒的結(jié)果顯示(圖10)，各多表位抗原均能激起小鼠的抗體水平，ehf1蛋白組效果較好。

為了了解t淋巴細(xì)胞的增值變化，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了小鼠外周血和脾臟中的cd3+cd4+t淋巴細(xì)胞和cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞的增值情況。對(duì)免疫后第0天、14天、26天和35天不同時(shí)間點(diǎn)t淋巴細(xì)胞的水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同組在同一時(shí)間點(diǎn)cd3+cd4+t淋巴細(xì)胞水平有所不同，但是變化不顯著(圖11)。但是，不同組不同時(shí)間點(diǎn)cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞的水平確實(shí)不同(圖11)。

附圖說明

圖1是rpprv-hn-f多克隆抗體是小反芻獸疫病毒的特異性抗體；

圖2pprv-glycoprotein多克隆抗體與小反芻獸疫病毒同樣具有良好的反應(yīng)原性和特異性；

圖3westernblotting檢測(cè)多克隆抗體與rpprv-hn-f蛋白具有良好的反應(yīng)原性和特異性；

圖4rpprv-hn-f多克隆抗體篩選hn蛋白b細(xì)胞表位庫結(jié)果；

圖5pprv-glycoprotein多克隆抗體篩選hn蛋白b細(xì)胞表位庫結(jié)果；

圖6h185、h487和h569表位在hn蛋白結(jié)構(gòu)中的位置；

圖7重組質(zhì)粒pet30a-ehf1、pet30a-ehf2和pet30a-ehf3的雙酶切鑒定；

圖8多表位重組抗原ehf1、ehf2和ehf3純化后sds-page分析；

圖9western-blotting檢測(cè)his融合蛋白表達(dá)；

圖10基于全病毒間接elisa法檢測(cè)小鼠抗體水平；

圖11免疫后小鼠t淋巴細(xì)胞增值變化。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述的一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列為：h123：¹²³kflnpdreydfrdlr¹³⁷(seqidno.1)

或/和h185：¹⁸⁵gtgclgrtvtra¹⁹⁶(seqidno.2)

或/和h487：⁴⁸⁷irgprgrch⁴⁹⁵(seqidno.3)

或/和h569：⁵⁶⁹ecfpwyhkvwcyhdcli⁵⁸⁵(seqidno.4)。

本發(fā)明使用多種免疫信息學(xué)軟件對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行b細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后對(duì)預(yù)測(cè)的不同表位分別進(jìn)行人工合成，應(yīng)用間接elisa方法進(jìn)行驗(yàn)證其反應(yīng)原性，不同的多肽包被氨基化酶標(biāo)板，檢測(cè)與f蛋白的抗體的反應(yīng)原性，從而鑒定出pprvf蛋白的b細(xì)胞表位。

本發(fā)明一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位的確定、制備方法，所述方法包括如下步驟：

計(jì)算模擬：

步驟一，用分子模擬軟件構(gòu)建虛擬hn蛋白頭部3d結(jié)構(gòu)：利用discoverystudiov4.5對(duì)這兩個(gè)目標(biāo)蛋白——野毒株pprvhn和疫苗株pprvhn蛋白進(jìn)行同源模建；其中pprvhw，genbank登錄號(hào)為fj905304；pprvhv，genbank登錄號(hào)：x74443；

步驟二，搜索模板：搜索pdb數(shù)據(jù)庫(www.pdb.org)，尋找通過實(shí)驗(yàn)解析出的同源蛋白的結(jié)構(gòu)，選擇序列一致性在30％以上，并且比對(duì)序列較長(zhǎng)的蛋白結(jié)構(gòu)作為模板結(jié)構(gòu)，進(jìn)行后續(xù)的計(jì)算；

步驟三，調(diào)整序列比對(duì)：選取模板蛋白之后，從pdb數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白的空間坐標(biāo)，將得到的模板蛋白序列與目標(biāo)蛋白進(jìn)行比對(duì)；

步驟四，建模：將比對(duì)結(jié)果提交服務(wù)器，根據(jù)模板蛋白的空間坐標(biāo)和序列的相似性推測(cè)結(jié)構(gòu)，從而計(jì)算得到目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)，即每次模建生成至少5個(gè)不同的目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)，要求pdftotalenergy較低的同時(shí)選擇dopescore最低的模型進(jìn)行后續(xù)計(jì)算；

步驟五，優(yōu)化：采用charmm力場(chǎng)，先進(jìn)行steepestdecent優(yōu)化5000步，再進(jìn)行conjugategradient優(yōu)化2000步；

步驟六，評(píng)估結(jié)構(gòu)：采用拉氏構(gòu)象圖分析方法評(píng)估蛋白結(jié)構(gòu)的合理性，若位于不許可區(qū)的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超過5％，則說明模擬的蛋白結(jié)構(gòu)是合理的，可以進(jìn)行后續(xù)的計(jì)算分析；

基于免疫信息學(xué)的預(yù)測(cè)：

步驟一，pprv-hn蛋白b細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)：將pprvhn蛋白的氨基酸序列用iedb、immunomedicinegroup和bepipred免疫信息學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，綜合分析預(yù)測(cè)其b細(xì)胞抗原表位；

步驟二，抗原表位的合成：將軟件預(yù)測(cè)的抗原表位氨基酸序列送genescript公司用多肽合成儀合成，合成后用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析多肽合成的純度及氨基酸的正確性；

抗體的制備；

步驟一，免疫動(dòng)物：具有反應(yīng)原性目的抗原rpprv-hn-f和小反芻獸疫病毒糖蛋白(pprv-glycoprotein)免疫6-8周齡雌性balb/c小鼠，頸背部皮下四點(diǎn)注射，免疫蛋白樣品量為50μg/只，免疫體積200μl/只；首次免疫用等體積弗氏完全佐劑乳化，二次免疫和三次免疫用等體積弗氏不完全佐劑佐劑乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠斷尾采血檢測(cè)血清中的抗體，待抗體效價(jià)高1：10000后方可進(jìn)行四免，四免不用佐劑，腹腔注射；

步驟二，多克隆抗體的純化，將乙醚完全浸潤(rùn)的脫脂棉和小鼠同時(shí)放入麻醉盒，待小鼠完全失去知覺時(shí)，摘取眼球取學(xué)，收集完成后，將小鼠斷頸處死，全血放37℃孵育30分鐘后4℃過夜。4℃，1500rpm，離心15分鐘，取血清，-20℃?zhèn)溆茫?/p>

表位的鑒定：

預(yù)測(cè)的表位經(jīng)過生物合成，鑒定符合實(shí)驗(yàn)要求，使用氨基化酶標(biāo)板作為固相載體的間接elisa方法進(jìn)行；

稀釋：將合成并凍干的表位肽用高壓過的去離子水稀釋成1μg/μl；

表位肽包被：將稀釋好的表位肽包被在氨基化酶標(biāo)板上，每孔50μl包被液，抗原的含量為5μg，4℃過夜；

洗板：將酶標(biāo)孔里的液體盡可能甩盡，然后每孔加入約250μlpbst，靜置3分鐘，重復(fù)三次，最后將酶標(biāo)板在紗布上拍干；

封閉：向酶標(biāo)孔中加入1×封閉液150μl，37℃溫箱孵育1.5小時(shí)后，將酶標(biāo)孔里的封閉液盡可能甩盡，最后將酶標(biāo)板在紗布上拍干后備用；

孵育一抗：用封閉液將單克隆抗體按1:500稀釋，加入酶標(biāo)板每孔50μl，放置37℃溫箱中孵育1小時(shí)；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封閉液將hrp標(biāo)記抗鼠igg二抗按1:5000稀釋，加入酶標(biāo)板每孔50μl，放置37℃溫箱中孵育1小時(shí)；

洗板：同上步洗板；

顯色：每孔加入50μltmb顯色液，避光37℃孵育15分鐘；

終止：每孔加入50μl終止液，終止顯色；

讀?。河媒K點(diǎn)法在波長(zhǎng)450nm處對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行檢測(cè)，讀取od450nm吸光度值。

多表位抗原設(shè)計(jì)：

步驟一：設(shè)計(jì)多表位基因及誘導(dǎo)表達(dá)，將表位按照在天然蛋白中的順序排列，表位之間加gs接頭分子，送南京金斯瑞公司合成基因片段，連接到pet30a載體中。將載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，按照培養(yǎng)溫度37℃，誘導(dǎo)劑iptg終濃度為1.0mm，氨芐青霉素lb培養(yǎng)基，誘導(dǎo)7小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

步驟二：多表位抗原的純化

破碎菌體：將菌體反復(fù)凍融3次，用pbs緩沖液重懸菌體超聲破碎；

離心：將破碎的菌體4℃10000rpm離心20分鐘，分別收集沉淀和上清；

樣品準(zhǔn)備：使用緩沖液i(ph＝7.4)重懸上步收集的沉淀，充分混勻，8000rpm，4℃離心20分鐘，取上清用0.45μm濾器過濾處理待上樣；

平衡ni柱：先在柱子底部加入少量去離子水排除空氣，再裝入2mlni-nat填料，將裝好的柱子用5倍體積的去離子水洗滌以去除乙醇，最后用5倍體積的緩沖液i(ph＝7.4)平衡柱材；

上樣：將濾器過濾處理后的樣品，分次與柱材結(jié)合，靜置，待自然沉降，收集流湍液4℃環(huán)境保存；

洗滌：分次向柱子中加入緩沖液i(ph＝7.4)，總體積應(yīng)大于上樣量的5倍體積；

洗脫：使用含有10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、300mm和400mm咪唑濃度的洗脫緩沖液洗脫蛋白，每個(gè)洗脫濃度靜置15分鐘，收集各濃度洗脫液置于冰上；

柱子保存：洗脫步驟完成后，用5倍柱材體積的緩沖液i(ph＝7.4)清洗柱子，加入適量20％乙醇4℃保存；

步驟三：多表位抗原的鑒定

蛋白電泳樣品準(zhǔn)備：取40μl蛋白上述步驟中分離的蛋白樣品于1.5ml離心管中，再加入10μl5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10分鐘，置于4℃冰箱快速降溫；

上樣及電泳：取10μl于12％sds-page中，100mv電泳；

轉(zhuǎn)膜：將nc膜剪至與凝膠等量大小，并置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘，按照從負(fù)極到正極的順序分別放置厚濾紙、凝膠、nc膜、厚濾紙，注意應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，200ma恒流濕轉(zhuǎn)100分鐘；

封閉：取出轉(zhuǎn)印后的nc膜，置于適量5％脫脂奶粉中，室溫封閉兩小時(shí)；

加一抗：將封閉完成的nc膜置于5％的bsa中，加入鼠抗his單克隆抗體(稀釋比例1:2500)和羊源小反芻獸疫陽性血清(稀釋比例為1:250)，4℃冰箱過夜孵育；

洗滌：一抗孵育完成后，用pbst搖動(dòng)洗滌3次，每次10分鐘；

加二抗：將nc膜置于兔抗鼠igg-hrp(1:5000比例稀釋)和驢抗羊igg-hrp(1:25000比例稀釋)二抗中，稀釋液為含有5％脫脂奶粉的pbst，室溫?fù)u動(dòng)孵育1小時(shí)；

洗滌：同上步洗滌；

顯色：將洗滌完成的nc膜置于凝膠成像系統(tǒng)中，混合ecl超敏發(fā)光液a和b，滴在nc膜上室溫孵育3分鐘；

觀察：調(diào)節(jié)不同的曝光時(shí)間，直到清洗看到明顯的條帶。

步驟四：免疫小鼠。將小白鼠分為5組。a組：pbs+弗氏不完全佐劑，b組：疫苗，c組：ehf1+弗氏不完全佐劑，d組：ehf2+弗氏不完全佐劑，e組：ehf3+弗氏不完全佐劑。每組12只小鼠，每只免疫蛋白50μl，免疫體積每只200μl。頸背部分四點(diǎn)皮下注射，21天后再次免疫。

步驟五：小鼠特異性抗體檢測(cè)，0天、7天、14天、28天和35天斷尾采血，37℃孵育30分鐘，4℃過夜，3000rpm離心15分鐘收集血清，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。用包被pprv全病毒的間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)抗體水平；

步驟六：小鼠t淋巴細(xì)胞水平檢測(cè)。檢測(cè)免疫小鼠cd3+cd4+t細(xì)胞和cd3+cd8+t細(xì)胞的增值情況，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)免疫后0天，14天和26天外周血t細(xì)胞，在第35天檢測(cè)脾臟中的t淋巴細(xì)胞，步驟如下：

采血：斷尾采取小鼠抗凝血，每組采集5只小鼠，每只100μl；

抗體孵育：將采集的每只100μl抗凝血平均分成兩份，其中一份加入apchamsteranti-mousecd3e抗體和peratanti-mousecd4抗體各2.5μl，fitcratanti-mousecd8a抗體1μl；另一份加入apchamsterigg1,κisotypecontrol抗體、peratigg2a,κisotypecontrol抗體和fitcratigg2a,κisotypecontrol抗體各2.5μl，混勻后，避光4℃孵育15分鐘；

裂解紅細(xì)胞：加入1ml1×紅細(xì)胞裂解液，混勻，避光室溫孵育10分鐘；

洗滌：加入1mlhank’s液,混勻，1000g離心5分鐘，重復(fù)2次；

過濾：上樣前用高壓后的300目尼龍網(wǎng)過濾；

上樣：將準(zhǔn)備好的樣品放在流式細(xì)胞儀上樣架上，準(zhǔn)備收集細(xì)胞。

圖1和2間接免疫熒光檢測(cè)多克隆抗體與小反芻獸疫病毒具有良好的反應(yīng)原性和特異性。

a.veroe6細(xì)胞表現(xiàn)出合胞體，熒光強(qiáng)度較亮，并且出現(xiàn)在病變的細(xì)胞上，說明抗體具有良好的反應(yīng)原性。

b.veroe6細(xì)胞沒有出現(xiàn)熒光，說明對(duì)照抗體不與病毒反應(yīng)。

c.veroe6細(xì)胞沒有出現(xiàn)熒光，表明單克隆抗體不與veroe6細(xì)胞反應(yīng)，說明單克隆抗體具有良好的特異性。

圖3westernblotting檢測(cè)多克隆抗體與rpprv-hn-f蛋白具有良好的反應(yīng)原性和特異性。

圖3a中1泳道為rpprv-hn-f蛋白，出現(xiàn)一個(gè)明顯的條帶，而2泳道空載體表達(dá)菌，沒有條帶，說明多克隆抗體與rpprv-hn-f蛋白具有良好的反應(yīng)原性和特異性；同樣的結(jié)果出現(xiàn)在圖3b中。

圖4rpprv-hn-f多克隆抗體篩選hn蛋白b細(xì)胞表位庫結(jié)果

用基于氨基化的酶標(biāo)板為固相載體的間接elisa方法檢測(cè)多克隆抗體與表位肽的反應(yīng)原性。明顯看出h123、h487和h569表位肽中，rpprv-hn-f多克隆抗體組的od450值極其顯著與對(duì)照組od450值(p<0.00001)，表明h123、h487和h569表位與rpprv-hn-f多克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性，即為有效表位。

圖5pprv-glycoprotein多克隆抗體篩選hn蛋白b細(xì)胞表位庫結(jié)果

用基于氨基化的酶標(biāo)板為固相載體的間接elisa方法檢測(cè)多克隆抗體與表位肽的反應(yīng)原性。明顯看出h185、h487和h569表位肽中，pprv-glycoprotein多克隆抗體組的od450值極其顯著與對(duì)照組od450值(p<0.00001)，表明h185、h487和h569表位與pprv-glycoprotein多克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性，即為有效表位。

圖6h185、h487和h569表位在hn蛋白結(jié)構(gòu)中的位置

可以明顯看到，圖中藍(lán)色部分是抗原表位，從3d結(jié)構(gòu)中可以明顯看出該表位位于抗原的表面較為突出的地方，這可能是該表位對(duì)應(yīng)的抗體具有良好反應(yīng)原性的重要原因。

圖7重組質(zhì)粒pet30a-ehf1、pet30a-ehf2和pet30a-ehf3的雙酶切鑒定m：dnamarker；1：pet30a載體雙酶切產(chǎn)物；2：pet30a-ehf1載體雙酶切產(chǎn)物；3：pet30a-ehf2載體雙酶切產(chǎn)物；4：pet30a-ehf3載體雙酶切產(chǎn)物明顯看出pet30a-ehf1、pet30a-ehf2和pet30a-ehf3均出線兩條帶，其中一條與pet30a對(duì)照一直，另外的條帶與ehf1、ehf2和ehf3相一致，表明目的條帶正確的插入到了載體相應(yīng)的位置上。

圖8多表位重組抗原ehf1、ehf2和ehf3純化后sds-page分析m：蛋白marker；1-3：多表位重組抗原ehf1、ehf2和ehf3經(jīng)過鎳瓊脂糖凝膠柱純化多表位重組抗原，通過不同咪唑濃度的洗脫，目的蛋白從柱子上洗脫下來，sds-page分析結(jié)果顯示多表位重組抗原各泳道沒有明顯的雜帶，表明獲得較純的蛋白。

圖9western-blotting檢測(cè)his融合蛋白表達(dá)

1：空載體宿主菌沉淀；2：pet30a-ehf3/bl21(de3)沉淀；3：pet30a-ehf2/bl21(de3)沉淀；4：pet30a-ehf1/bl21(de3)沉淀在陽性克隆pet30a-ehf1/bl21(de3)、pet30a-ehf2/bl21(de3)和pet30a-ehf3/bl21(de3)沉淀泳道中出現(xiàn)特異性的條帶，分別在25kda左右，40-55kda之間和55-70kda之間，而空載體宿主菌泳道中沒有條帶，表明宿主菌成功表達(dá)了his融合蛋白，即為目的蛋白。

圖10基于全病毒間接elisa法檢測(cè)小鼠抗體水平

在第7天每組的小鼠都產(chǎn)生較低的抗體水平，在第14和21天每組小鼠抗體水平都在不斷升高，第21天二次免疫，在第28和35天每組小鼠抗體水平也在升高，pbs組始終沒有抗體。但是，相比疫苗組，試驗(yàn)組的抗體水平較低。然而，ehf1蛋白的水平在第21天是高于疫苗組的。三組試驗(yàn)組相比，ehf1蛋白組始終保持較高的抗體水平；ehf2蛋白組在二次免疫后才顯著升高，在第35天ehf1蛋白組抗體水平相當(dāng)；但是ehf3蛋白組抗體水平始終是最低的。

圖11免疫后小鼠t淋巴細(xì)胞增值變化

在免疫后第14天疫苗組、ehf1、ehf2和ehf3的cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞百分比顯著高于pbs組；在免疫后第26天，不同實(shí)驗(yàn)組的cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞百分比出現(xiàn)顯著差異，疫苗組、ehf1組和ehf2組均顯著高于pbs組，ehf3極其顯著高于pbs組；疫苗組與ehf1組、ehf2組和ehf3組相比，ehf1組和ehf2組顯著高于疫苗組，ehf3組則極顯著高于疫苗組；在免疫后第35天，疫苗組、ehf1組、ehf2組和ehf3組的cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞百分比極顯著高于pbs組，ehf3組的cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞百分比則顯著高于pbs組，并且ehf1組的cd3+cd8+t淋巴細(xì)胞百分比極顯著高于疫苗組。

經(jīng)過以上方案鑒定的表位肽，為小反芻獸疫病毒表位疫苗抗原和診斷試劑抗原制備的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)小反芻獸疫病毒的防治具有重大意義。

本發(fā)明不局限于上述最佳實(shí)施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下都可得出其他各種形式的產(chǎn)品，但不論在其形狀或結(jié)構(gòu)上作任何變化，凡是具有與本申請(qǐng)相同或相近似的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>一種小反芻獸疫病毒hn蛋白抗原表位肽及其確定、制備方法和應(yīng)用

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