本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種乙酰酰胺化六肽、及其純化方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著地球環(huán)境的不斷變化，大氣臭氧層也遭到較為嚴(yán)重的破壞，由此導(dǎo)致紫外線(ultraviolet，uv)輻射強(qiáng)度有所增強(qiáng)。另一方面，隨著人們生活方式的變化，戶外運(yùn)動(dòng)、日光浴機(jī)會(huì)逐漸增多，因而人們將遭受更多的的紫外線照射，這樣一來(lái)造成光損害性皮膚病也逐漸增多。由于紫外線照射而對(duì)皮膚造成的日曬傷急性損傷和光老化、皮膚癌等的慢性累積性傷害，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。

當(dāng)今皮膚老化問(wèn)題已日益引起人們的重視，因此，開發(fā)具有保護(hù)皮膚免受光損傷、預(yù)防和延緩皮膚衰老的組分或產(chǎn)品，已成為目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

小分子肽是一類具有高活性的肽類物質(zhì)，小分子肽可以以完整的形式被機(jī)體吸收；主動(dòng)吸收、低耗或不需消耗能量的特點(diǎn)；能夠直接進(jìn)入血液循環(huán)并送到人體各個(gè)部位，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。由于具有親水性，蛋白質(zhì)通常難以跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，提高其膜滲透性改善其細(xì)胞內(nèi)化率是重要的科學(xué)問(wèn)題。通過(guò)對(duì)小分子肽進(jìn)行修飾使其性能得以改善，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究方向之一。其中，多肽n-端乙?；蚦-端酰胺化是其結(jié)構(gòu)修飾的主要形式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種乙酰酰胺化六肽，其具有良好的抗氧化活性和抗皮膚光老化活性，且能預(yù)防或改善uvb引起的皮膚損傷。

本發(fā)明為達(dá)到其目的，采用的技術(shù)方案如下：

一種乙酰酰胺化六肽，命名為ac-gmccsr-nh2，分子量696.86da，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

其中，縮寫為ac表示英文名稱為acetyl，中文名稱為乙?；?；nh2表示英文名為amidegroup，中文名稱為酰胺基；gly表示英文名稱為glycine，中文名稱為甘氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；met表示英文名稱為methionine，中文名稱為甲硫氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；cys表示英文名稱為cysteine，中文名稱為半胱氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；ser表示英文名稱為serine，中文名稱為絲氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；arg表示英文名稱為arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。

本發(fā)明還提供上文所述的乙酰酰胺化六肽的純化方法，該方法包括如下步驟，

將待純化的乙酰酰胺化六肽(為合成的乙酰酰胺化六肽的粗肽)上樣至色譜柱；

以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，其中流動(dòng)相a為含有0.08～0.12％(體積)三氟乙酸的乙腈溶液，流動(dòng)相b為含有0.08～0.12％(體積)三氟乙酸的水；梯度洗脫程序?yàn)椋毫鲃?dòng)相a+流動(dòng)相b的體積比之和為100％，流動(dòng)相a的初始體積比例為8～12％，在上樣后的第0.01min到25min內(nèi)，流動(dòng)相a的體積比例上升到30～40％，在25min到25.1min內(nèi)，流動(dòng)相a的體積比例上升為100％，保持100％運(yùn)行至第30min停止，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；收集目標(biāo)峰的多肽溶液。

進(jìn)一步的，所述色譜柱為c18色譜柱。

優(yōu)選的，流動(dòng)相a為含有0.1％(體積)三氟乙酸的乙腈溶液，流動(dòng)相b為含有0.1％(體積)三氟乙酸的水；梯度洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相a的初始體積比例為10％，在上樣后的第0.01min到25min內(nèi)，流動(dòng)相a的體積比例上升到35％。

本發(fā)明還提供所述的乙酰酰胺化六肽的應(yīng)用，所述乙酰酰胺化六肽可在制備抗皮膚光老化、或具有皮膚保濕功效的護(hù)膚品中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述乙酰酰胺化六肽在制備用于預(yù)防或修復(fù)由于uvb引起的hacat細(xì)胞光損傷的制劑中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述乙酰酰胺化六肽在制備抗氧化制劑中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述乙酰酰胺化六肽在制備用于預(yù)防或改善由于uvb輻射而引起的皮膚損傷的制劑中應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物中含有如上文所述的乙酰酰胺化六肽。

進(jìn)一步的，所述組合物為化妝品、食品或藥物。

本發(fā)明采用抗氧化化學(xué)模型(abts自由基)、人表皮永生化細(xì)胞(hacat)及其uvb老化模型、昆明小鼠及其背部皮膚uvb老化模型等方法，測(cè)試本發(fā)明乙酰酰胺化六肽的抗氧化活性以及抗皮膚光老化活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的乙酰酰胺化六肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)uvb老化的hacat細(xì)胞的保護(hù)作用顯著強(qiáng)于修飾前的六肽。本發(fā)明的乙酰酰胺化六肽具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力，不僅具有預(yù)防或改善uvb引起的皮膚損傷，保持皮膚水分，降低皮膚中mda含量，增強(qiáng)皮膚組織中sod活力、cat活力、gsh-px活力，并降低細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中mmp-1和mmp-3的表達(dá)量。

本發(fā)明提供的具有抗氧化活性和抗皮膚光老化活性的合成多肽乙酰酰胺化六肽，可應(yīng)用于食品、生物制藥和化妝品等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)的純度鑒定hplc圖。

圖2為乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)的esi-ms圖譜。其中橫坐標(biāo)為m/z(質(zhì)荷比值)、縱坐標(biāo)為intensity(信號(hào)強(qiáng)度)。

圖3中a-d為小鼠背部皮膚的宏觀表征圖；a1-d1為皮膚組織病理學(xué)切片檢查結(jié)果(200x)。其中，a和a1為僅涂抹溶劑的正常對(duì)照組；b和b1為uvb老化的模型組；c和c1為加了陽(yáng)性對(duì)照的保護(hù)組；d和d1為加了乙酰酰胺化六肽的保護(hù)組。

圖4為皮膚表皮厚度測(cè)定圖。注：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。

圖5為皮膚水分含量測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組相比差異顯著；#代表與模型組相比差異顯著。

圖6為皮膚組織mda含量測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。

圖7為皮膚組織sod活力的測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。

圖8為皮膚組織cat活力的測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。

圖9為皮膚組織gsh-px活力的測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。

圖10為皮膚組織mmp-1含量的測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。

圖11為皮膚組織mmp-3含量的測(cè)定圖。注釋：#代表與模型組差異顯著。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。

以下實(shí)施例中所用細(xì)胞或試劑若未特別說(shuō)明，均為商業(yè)渠道購(gòu)買獲得；實(shí)施例中未特別說(shuō)明的實(shí)驗(yàn)操作均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作。實(shí)施例中所述的六肽均為gmccsr，乙酰酰胺化六肽均為ac-gmccsr-nh2。

通過(guò)多肽固相合成法合成ac-gmccsr-nh2，采用本領(lǐng)域常規(guī)多肽固相合成方法，具體可以通過(guò)商業(yè)化的生物合成公司來(lái)完成該多肽的合成。氨基酸序列采用本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案，下面對(duì)其進(jìn)行介紹以供參考。

多肽固相合成

選用rinkamide樹脂(上海杰肽生物科技有限公司)，由于rinkamide樹脂自帶有氨基，可以直接和氨基酸反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。按照氨基酸序列ac-gly-met-cys-cys-ser-arg-nh2的特征，先將arg的羧基以共價(jià)鍵的形式與一個(gè)樹脂相連，然后arg的氨基和ser的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加cys，ser的氨基和cys的羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個(gè)gly氨基酸后，再切除樹脂即得到酰胺化六肽ac-gmccsr-nh2。氨基酸鏈合成完畢后，將活化好的乙酸在醋酸酐和吡啶的催化下與肽鏈n端氨基反應(yīng)，進(jìn)行乙?；磻?yīng)，即得乙酰酰胺化六肽。

乙酰酰胺化六肽的純化

對(duì)通過(guò)多肽固相合成的乙酰酰胺化六肽ac-gmccsr-nh2進(jìn)行純化，以便獲得純度95％以上的產(chǎn)品。本發(fā)明按照如下方法純化：采用高效液相色譜純化乙酰酰胺化六肽ac-gmccsr-nh2，將ac-gmccsr-nh2粗肽經(jīng)kromasilc18-5(4.6×250mm)色譜柱進(jìn)行梯度洗脫純化，流速為1.0ml/min。以溶劑a為流動(dòng)相a，溶劑b為流動(dòng)相b，其中，流動(dòng)相a為含有0.1％(體積)三氟乙酸的乙腈溶液；溶劑b為含有0.1％(體積)三氟乙酸的水。梯度洗脫如下：a+b的體積總量為100％，a初始體積比例為10％，在上樣后的0.01min到25min內(nèi)，a的比例上升到35％，在25min到25.1min內(nèi)，a的比例上升為100％，保持100％運(yùn)行至30min停止，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。收集目標(biāo)峰的多肽溶液，液氮速冷，然后凍干。得到純度95％以上的產(chǎn)品，純度鑒定hplc結(jié)果見圖1，并經(jīng)esi-ms鑒定結(jié)構(gòu)(如圖2所示)。經(jīng)鑒定，其結(jié)構(gòu)式為：

多肽的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法介紹

abts自由基清除活性測(cè)定：用pbs(ph7.4)配置5mmol/l的abts溶液，加入過(guò)量的mno2制備自由基，30℃放置12h，隨后在4500r/min條件下離心10min，收集上層清液，用0.2μm尼龍膜過(guò)濾。置于-20℃?zhèn)溆茫鳛閍bts⁺儲(chǔ)備液。用于測(cè)試前，需用pbs溶液將abts⁺儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：加入20μl水+180μlabts溶液，進(jìn)行全波掃描，掃描確定最大吸收波長(zhǎng)為736nm(酶標(biāo)儀程序：振蕩30s，測(cè)定波長(zhǎng)范圍500-800nm)。測(cè)試樣品的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到工作液。樣品的測(cè)定：加入20μl不同濃度的樣品(1-100μg/ml)和180μlabts工作液。樣品的吸光度值記為a樣品，模型組的吸光度值(20μl蒸餾水+180μlabts工作液)記為a模型，設(shè)定空白組，吸光度值記為a空白。

根據(jù)下式計(jì)算abts自由基清除率：abts自由基清除率＝(a模型-a樣品)/(a模型-a空白)

實(shí)施例1abts自由基清除活性測(cè)試

參照上述方法評(píng)價(jià)乙酰酰胺化六肽及六肽的abts自由基清除活性。

采用96孔板測(cè)定abts自由基的清除活性：設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)736nm，反應(yīng)體系為20μl水+180μlabts溶液，測(cè)試六肽和乙酰酰胺化六肽的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到abts工作液。加入20μl濃度為1-100μg/ml的樣品和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min，反應(yīng)完畢后，根據(jù)上式計(jì)算abts自由基清除率。另外，還設(shè)置了陽(yáng)性對(duì)照組，以維生素c為測(cè)試樣品。

經(jīng)檢測(cè)，六肽gmccsr對(duì)abts自由基的半數(shù)清除濃度(ic50值)為16.94μm，乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)對(duì)abts自由基的ic50值為17.82μm，而陽(yáng)性對(duì)照維生素c的ic50值為26.18μm。結(jié)果表明，乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)和六肽gmccsr一樣具備較強(qiáng)的抗氧化活性，且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照，具備在食品、藥品、化妝品中應(yīng)用的潛力。

實(shí)施例2

取人表皮永生化細(xì)胞hacat一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來(lái)，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個(gè)細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的陽(yáng)性對(duì)照五勝肽(matrixyl，palm-kttks)、乙酰酰胺化六肽溶液(ac-gmccsr-nh2)、六肽溶液(gmccsr)，每孔加入200μl樣品溶液(正常對(duì)照組，則用完全培養(yǎng)基替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1所示。

表1乙酰酰胺化六肽對(duì)hacat的毒性

注：小寫字母a和b表示同一濃度不同樣品細(xì)胞存活率之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

由表1可知，乙酰酰胺化六肽和六肽一樣對(duì)hacat細(xì)胞的毒性均顯著小于陽(yáng)性對(duì)照五勝肽。在合成多肽中，乙酰酰胺化六肽作用后，hacat細(xì)胞的存活率超過(guò)80％。因此，可考慮在低于該濃度的條件下，測(cè)試樣品對(duì)hacat細(xì)胞的保護(hù)作用。

實(shí)施例3乙酰酰胺化六肽對(duì)uvb老化hacat細(xì)胞的保護(hù)作用

為了探究多肽對(duì)uvb老化的hacat的保護(hù)作用，建立uvb老化的hacat模型，設(shè)立uvb老化組和non-uvb正常組。在設(shè)定的uvb老化強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，通過(guò)mtt法測(cè)定hacat的存活率以及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的凋亡率來(lái)確定最適的uvb劑量。結(jié)果表明，當(dāng)uvb輻射強(qiáng)度為35mj/cm²時(shí)，模型組中hacat細(xì)胞的存活率為正常組的47.56±6.40％，差異顯著，接近半數(shù)存活率。同時(shí)，流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡結(jié)果表明，模型組的凋亡率明顯高于正常組的hacat細(xì)胞，模型組細(xì)胞g1期的比例顯著小于正常組，同時(shí)，s期細(xì)胞的比例顯著高于正常組。因此，uvb能將hacat細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在s期。結(jié)果表明，紫外線uvb老化的hacat模型建立成功。

在上述uvb老化的hacat模型的基礎(chǔ)上，測(cè)試1-50μg/ml濃度范圍內(nèi)的乙酰酰胺化六肽對(duì)hacat的保護(hù)作用，并與六肽、陽(yáng)性對(duì)照五勝肽進(jìn)行比較。具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2乙酰酰胺化六肽對(duì)hacat的保護(hù)作用

注：小寫字母a和b表示不同樣品細(xì)胞存活率之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

由表2可知，乙酰酰胺化六肽對(duì)uvb老化的hacat的保護(hù)作用顯著強(qiáng)于六肽和五勝肽，可見，乙酰酰胺化六肽具備在化妝品中應(yīng)用的潛力，能夠有效保護(hù)uvb老化的人表皮永生化細(xì)胞。

實(shí)施例4

選取spf級(jí)的昆明種小白鼠(或稱km小鼠)，7-8周齡，全為雌性，體重25g，共56只，分為7組。購(gòu)自廣州南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：scxk(粵)2011-0015，動(dòng)物質(zhì)量合格證為44002100005930。

飼養(yǎng)環(huán)境：溫度23±2℃，濕度55±10％，12h光照，12h黑暗，交替，其中沒(méi)有任何紫外線照射，自由供給食物和水。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前先讓小鼠適應(yīng)環(huán)境1個(gè)星期。然后進(jìn)行隨機(jī)分組。

將56只km小鼠隨機(jī)分為以下4組：a為正常組(normalcontrol，nc)、b為模型組(modelcontrol，mc)、c為陽(yáng)性對(duì)照組(五勝肽palm-kttks，matrixyl)、d為乙酰酰胺化六肽(ac-gmccsr-nh2)預(yù)防組一共4組，每組8只。兩籠一組，保持同種條件下，正常飼養(yǎng)，讓其適應(yīng)環(huán)境一周再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

首次用電推剪將所有小鼠的背部2.5×3cm²區(qū)域的毛發(fā)剪掉，短毛用全自動(dòng)女士剃毛器輕柔剃光，在正式實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)環(huán)境兩天。從第一周至第十周對(duì)小鼠背部皮膚進(jìn)行加藥和uvb處理十周，每次處理前均進(jìn)行脫毛處理，具體處理按如下要求操作：剃毛結(jié)束后，正常組給溶劑100μl，模型組給溶劑100μl，陽(yáng)性對(duì)照組和棕櫚?；慕M分別給樣品100μl(10mg/ml)；給藥結(jié)束后，給予小鼠足夠的活動(dòng)空間讓其單獨(dú)活動(dòng)2h，讓樣品充分滲透吸收，隨后，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和棕櫚?；慕M均用60mj/cm²的uvb照射，實(shí)驗(yàn)期間，若出現(xiàn)紅斑、水泡和糜爛現(xiàn)象，立即停止照射2-3d，待癥狀消失再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)；各實(shí)驗(yàn)組給藥頻率為一周三次。

第10周末，仔細(xì)將各組小鼠背部脫毛(面積為2.5×3cm²)，拍照，頸椎脫臼處死小鼠，迅速取下其背部實(shí)驗(yàn)處全層皮膚，剝離結(jié)締組織和皮下脂肪，快速切取1.0cmx1.0cm組織，放入4％的多聚甲醛中固定兩天以上。隨后，取出固定好的皮膚組織，用流水漂洗過(guò)夜，并進(jìn)行石蠟包埋，切片，染色，拍照。得到200x視野下的he染色的照片后，隨機(jī)取10個(gè)視野，取平均值來(lái)估算本樣品所代表的小鼠皮膚表皮的平均厚度。imageproplus6.0圖像分析軟件被用于對(duì)受試鼠皮膚表皮厚度進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖3-4。

皮膚含水量的測(cè)試采用皮膚組織干燥至恒重的方法測(cè)定。頸椎脫臼處死小鼠，迅速取下其背部實(shí)驗(yàn)處全層皮膚，剝離結(jié)締組織和皮下脂肪，迅速剪取約0.2g皮膚，精密稱其濕重，迅速被放入烘箱中，于80℃干燥至恒重。皮膚水分含量按公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

皮膚含水百分率(％)＝(濕重-干重)/濕重×100(1)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖5。

同時(shí)，快速切取約0.5g皮膚，用預(yù)冷生理鹽水漂洗2次，拭干，稱重，迅速放入預(yù)冷ep管中。用0.9％生理鹽水制備10％的皮膚組織勻漿。涂片鏡檢，待3個(gè)以上隨機(jī)視野均未見完整細(xì)胞停止勻漿，離心，去上清液備用。采用bca試劑盒測(cè)定蛋白含量，相繼采用丙二醛(mda)試劑盒、超氧化物歧化酶(sod)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(cat)試劑盒和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(gsh-px)試劑盒等測(cè)定組織中各相關(guān)mda的含量和抗氧化相關(guān)的酶的活力，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖6-9。

取皮膚組織0.4g，加入9倍預(yù)冷的pbs，于4℃條件下進(jìn)行均質(zhì)，10000rpm，20s，10％勻漿，在4℃下于3000×g離心20min。所得的上清液用于評(píng)價(jià)分泌的mmp-1和mmp-3，測(cè)定450nm處的吸光度值來(lái)獲得皮膚組織中小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶mmp-1和mmp-3的含量，具體測(cè)定方法嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫分析(elisa)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖10-11。

圖3中a-d為小鼠背部皮膚的宏觀表征圖；a1-d1為皮膚組織病理學(xué)切片檢查結(jié)果(200×)。其中，a和a1為僅涂抹溶劑的正常對(duì)照組；b和b1為uvb老化的模型組；c和c1為加了陽(yáng)性對(duì)照的保護(hù)組；d和d1為加乙酰酰胺化六肽的保護(hù)組。

由圖3可知，正常組小鼠背部皮膚光滑，色澤紅潤(rùn)、飽滿、充滿彈性、未見任何松弛現(xiàn)象，同時(shí)，h&e染色結(jié)果表明，正常組皮膚中各層結(jié)構(gòu)完整，皮下毛囊和皮脂腺形態(tài)飽滿、充盈，表皮較薄，表皮與真皮連接處緊密，真皮層厚度適中，浪狀膠原纖維束排列有序且分布均勻，未見病理改變。模型組小鼠背部皮膚表面灰暗，外觀松弛，皺紋深重，并且表面皮層出現(xiàn)局部老化壞死現(xiàn)象。初步可以看出，所有樣品處理組均比模型組小鼠皮膚有一定程度上的改善。h&e染色結(jié)果表明，模型組表皮呈現(xiàn)不規(guī)則增厚、細(xì)胞核碎裂、局部表皮角化不完全、基底層細(xì)胞少量細(xì)胞空泡性變、并伴有炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞)浸潤(rùn)等現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照五勝肽保護(hù)組相對(duì)于模型組而言，膚色有所改善，不再那么灰暗，皮膚的光澤度和飽滿度上都有不同程度的改善，但還是能看到較為明顯的曬傷的斑痕。h&e染色結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組表皮基底層少量細(xì)胞空泡性變，真皮層中度水腫伴少量炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞)浸潤(rùn)。乙酰酰胺化六肽保護(hù)組小鼠的背部皮膚局部皮膚損傷得到改善，相較于模型組，膚色較亮，表皮較為光滑，未見松弛和深重皺紋，結(jié)果表明，該乙酰酰胺化六肽具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力。

圖4為皮膚表皮厚度測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組差異顯著；#代表與模型組差異顯著。由圖5可知，相對(duì)于正常組，uvb處理的模型組小鼠的表皮厚度顯著增加；相對(duì)于模型組，陽(yáng)性對(duì)照組和乙酰酰胺化六肽處理組小鼠的表皮厚度均顯著降低，且乙酰酰胺化六肽處理組與正常組無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，該乙酰酰胺化六肽具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力。

圖5為皮膚水分含量測(cè)定圖。注釋：*代表與正常組相比差異顯著；#代表與模型組相比差異顯著。我們?cè)谛∈笤缀?，取整層皮膚中的一部分烘干至恒重后的計(jì)算皮膚中的水分含量，結(jié)果見圖6。由圖可知，模型組與正常組呈現(xiàn)顯著性差異，模型組皮膚層中的水分含量顯著低于正常組的皮膚，且乙酰酰胺化六肽作用組顯著高于模型組，結(jié)果表明，乙酰酰胺化六肽涂抹于皮膚后，對(duì)其整層皮膚的水分含量具有保持作用。

圖6為皮膚組織mda含量測(cè)定圖。由圖可知，模型組mda的含量顯著高于正常組，乙酰酰胺化六肽作用組中mda含量顯著低于模型組。由于紫外線uvb的作用會(huì)產(chǎn)生自由基，從而對(duì)皮膚的脂質(zhì)層造成破壞，產(chǎn)生過(guò)量的mda，由于乙酰酰胺化六肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能及時(shí)清除自由基，從而降低皮膚中mda的含量。結(jié)果表明，乙酰酰胺化六肽具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力。

圖7為皮膚組織sod活力測(cè)定圖。由圖可知，模型組以及所有經(jīng)uvb老化組組織中sod活力均顯著下降，乙酰酰胺化六肽處理組中sod活力顯著強(qiáng)于模型組，結(jié)果表明，乙酰酰胺化六肽具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力。

圖8為皮膚組織cat活力測(cè)定圖。由圖可知，經(jīng)uvb老化的模型組以及陽(yáng)性對(duì)照組的組織中cat活力均顯著下降。乙酰酰胺化六肽作用組的組織中cat活力顯著高于模型組，結(jié)果表明，乙酰酰胺化六肽具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力。

圖9為皮膚組織gsh-px活力測(cè)定圖。由圖可知，模型組中g(shù)sh-px活力顯著低于正常組，陽(yáng)性對(duì)照五勝肽和乙酰酰胺化六肽作用組皮膚組織gsh-px活力均顯著高于模型組，說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照五勝肽和乙酰酰胺化六肽均可通過(guò)提高組織中g(shù)sh-px活力來(lái)抗皮膚光老化。

圖10和圖11分別為皮膚組織中mmp-1和mmp-3表達(dá)情況測(cè)定圖。由圖可知，相對(duì)于uvb老化的模型組，乙酰酰胺化六肽作用組中mmp-1和mmp-3的表達(dá)量顯著下降，因此，乙酰酰胺化六肽通過(guò)降低細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中mmp-1和mmp-3的表達(dá)量來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗光老化效果。具備在抗皮膚光老化化妝品中應(yīng)用的潛力。