本發(fā)明屬于自組裝多肽領(lǐng)域，具體涉及一種陽(yáng)離子型的兩親性自組裝短肽及其作為高效dna凝聚試劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因治療是近年來(lái)發(fā)展非常迅速的先進(jìn)治療方法，是將有治療作用的基因通過(guò)合適的載體導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以發(fā)揮治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)?；蜉d體包括病毒類載體和非病毒載體，其中病毒類載體有很大的安全隱患，會(huì)引起并發(fā)癥甚至導(dǎo)致患者死亡。目前，非病毒載體因其安全、有效、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)已成為病毒類載體最有希望的替代者。

一個(gè)分子要成為非病毒基因載體，首要前提是它是一種高效的dna凝聚試劑。眾所周知，裸露的dna一般以伸展構(gòu)象存在，體積較大，并且dna分子本身帶有負(fù)電荷，會(huì)與細(xì)胞膜外層的陰離子產(chǎn)生靜電排斥，因此，dna分子難以獨(dú)立地穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。而dna凝聚試劑可以誘導(dǎo)伸展?fàn)顟B(tài)的dna分子進(jìn)行高度壓縮，凝聚為體積較小的顆粒，從而使dna分子易于通過(guò)內(nèi)吞或胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。目前研究較多的dna凝聚試劑多為高分子陽(yáng)離子聚合物，如聚乙烯亞胺（polyethylenimine）等，它們富含陽(yáng)離子，能夠較強(qiáng)結(jié)合dna并引起dna分子的縮聚形成顆粒。然而，陽(yáng)離子聚合物作為dna凝聚試劑用作基因載體仍存在兩個(gè)突出問(wèn)題：第一，在生理?xiàng)l件下陽(yáng)離子聚合物易于與dna發(fā)生解離，而裸dna分子容易被核酸酶降解、傳輸過(guò)程中又易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而清除；第二，高分子量和較高濃度的陽(yáng)離子聚合物雖然具有較理想的轉(zhuǎn)染效率，但由于其富含正電荷且在體內(nèi)不可降解，有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。因此，研發(fā)具有較強(qiáng)dna結(jié)合能力且生理?xiàng)l件下對(duì)dna分子具有保護(hù)作用、體內(nèi)可降解的低毒高效的dna凝聚試劑有望為非病毒基因載體提供新的選擇。

肽分子由氨基酸殘基組成，具有生物相容性高、毒性低、體內(nèi)可降解等優(yōu)點(diǎn)，而且短肽分子的可設(shè)計(jì)性強(qiáng)，如能設(shè)計(jì)合適的短肽分子，在其中引入較多正電荷使其具有強(qiáng)的dna結(jié)合能力，進(jìn)一步賦予分子較強(qiáng)的組裝聚集能力使其可以有效地凝聚dna分子成為尺寸較小的顆粒，將有望成為優(yōu)良的基因載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種可以誘導(dǎo)dna分子有效凝聚的自組裝肽，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面涉及一種多肽，其特征在于所述的多肽具有如下結(jié)構(gòu)

（ile）x-（val）y-（ala）z-（gly）u-（lys）v

其中，ile為異亮氨酸，val為纈氨酸，ala為丙氨酸，gly為甘氨酸，lys為賴氨酸，

x、y、z、u和v獨(dú)立地為1-5之間的整數(shù)，優(yōu)選的，所述的x、y、z、u和v獨(dú)立地為2-3之間的整數(shù)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的多肽

分子結(jié)構(gòu)為：ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys，分子結(jié)構(gòu)式為：

在本發(fā)明的多肽分子中，從n端到c端，該多肽分子含有重復(fù)單元的疏水氨基酸殘基ile、val、ala和gly，其側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)體積依次減小，分子c端為3個(gè)重復(fù)單元的lys氨基酸殘基，提供正電荷。

本發(fā)明另一方面還涉及一種自組裝體，其特征在于由上述多肽自組裝得到，所述的自組裝體長(zhǎng)度為20?200nm，寬度為10?30nm，厚度為4?5nm的片層狀結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的自組裝體為所述多肽在ph為3.1-4.0的水溶液中自組裝而成。

本發(fā)明另一方面還涉及一種dna凝聚體，其特征在于含有上述多肽以及dna。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述多肽和dna的正負(fù)電荷之比在2.5以上。

本發(fā)明另一方面還涉及上述多肽的應(yīng)用，所述的應(yīng)用用于作為dna載體。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述應(yīng)用還包括降低dna分子的水合動(dòng)力學(xué)直徑和/或抑制dna被核酸酶酶解。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的dna為λ-dna。

相比于現(xiàn)有，技術(shù)本發(fā)明至少具有以下有益的效果：

（1）本發(fā)明肽分子具有良好的自組裝能力，在0.53mm濃度以上可以自組裝形成納米片層狀結(jié)構(gòu)；

（2）本發(fā)明肽分子是一種高效的dna凝聚試劑，溶液中當(dāng)該肽分子所帶正電荷數(shù)量與dna分子所帶負(fù)電荷數(shù)量的比值在2.5以上時(shí)，可以誘導(dǎo)dna分子的有效凝聚，使dna分子由伸展構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨葔嚎s的凝聚構(gòu)象；

（3）本發(fā)明肽分子在較大濃度范圍（<200μm）對(duì)動(dòng)物細(xì)胞不具有毒性。

本發(fā)明的肽具有很強(qiáng)的自組裝能力，且在200μm濃度以下對(duì)人體細(xì)胞hepg2和nih3t3不具有毒性；同時(shí)，在多肽分子與λ-dna分子的混合溶液中，當(dāng)多肽分子所帶正電荷數(shù)量與λ-dna分子所帶負(fù)電荷數(shù)量的比值在2.5以上時(shí)，可以誘導(dǎo)λ-dna分子的凝聚，其水合動(dòng)力學(xué)直徑由伸展?fàn)顟B(tài)的400?600nm變?yōu)槟蹱顟B(tài)的100?200nm。因此，該肽分子可以誘導(dǎo)dna分子的有效凝聚，是一種高效的dna凝聚試劑。

說(shuō)明書附圖

圖1（a）不同濃度肽分子溶液的圓二色譜；（b）0.2mm和（c）1.0mm肽溶液的透射電子顯微鏡結(jié)構(gòu)；

圖2（a）肽分子ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys和λ-dna分子（濃度為10μg/ml）的混合溶液（溶液中同時(shí)存在濃度為1.54×10^-3mm的溴化乙錠）中，體系在600nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)：520nm）隨肽分子正電荷數(shù)目與dna分子負(fù)電荷數(shù)目的比值（+/-）的變化；（b）λ-dna分子在水溶液中所采取構(gòu)象的原子力顯微鏡表征；（c）λ-dna分子水溶液及λ-dna/肽混合溶液（+/-=3）的動(dòng)態(tài)光散射表征；（d）λ-dna/肽混合溶液（+/-=3）中聚集體結(jié)構(gòu)的負(fù)染法透射電鏡表征；

圖3肽分子ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys和λ-dna分子的混合溶液（固定λ-dna濃度為10μg/ml，變化肽濃度使肽分子正電荷數(shù)目與dna分子負(fù)電荷數(shù)目的比值（+/-）從0開(kāi)始逐漸增大）經(jīng)hindiii核酸酶作用后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；

圖4hpeg·2細(xì)胞和nih3t3細(xì)胞在肽分子ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys存在下的存活率表征。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1：多肽和自組裝體的制備

合成如下所示的多肽

其合成（以合成0.25mmol肽分子為例）方法如下：

（1）稱取負(fù)載量為0.318mmol/g的mbha樹(shù)脂0.786g，dcm溶脹一夜。配制濃度為0.2mol/l的下列氨基酸的dmf溶液：fmoc-ala-oh體積32ml，質(zhì)量1.99g；fmoc-gly-oh體積32ml，質(zhì)量1.90g；fmoc-ile-oh體積32ml，質(zhì)量2.26g；fmoc-lys(boc)-oh體積32ml，質(zhì)量3.00g；fmoc-val-oh體積32ml，質(zhì)量2.17g。充分?jǐn)嚢枞芙?，氨基酸用量均?倍計(jì)算，保證充分反應(yīng)。

（2）配制下列合成試劑：a）活化劑（0.45mhbtu、0.45mhobt的dmf溶液）：稱取11.44g的hbtu和4.07g的hobt充分溶解于67ml的dmf溶液；b）活化堿（2mdiea的dmf溶液）：量取11.84ml的二異丙基乙胺（diea）和22.17ml的dmf充分混合；c）脫保護(hù)劑（20%(v/v)哌啶/0.1mhobt的dmf溶液）：量取74.8ml的哌啶，稱取5.05g的hobt充分溶解于300ml的dmf溶液；d）蓋帽劑（20%(v/v)乙酸酐、0.125mdiea、0.015mhobt的dmf溶液）:量取2.2ml乙酸酐、0.24ml的diea，稱取0.0223g的hobt，充分溶解于8.8ml的dmf溶液；e）裂解劑（體積比tfa:tis:water=95:2.5:2.5）：及量取14.25mltfa，0.375mltis，0.375mlwater充分混合）。

（3）利用cem公司的liberty微波多肽合成儀應(yīng)用fmoc固相合成法合成多肽，得到尚未裂解的連接有樹(shù)脂的多肽粗產(chǎn)品；反應(yīng)完成后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶?jī)?nèi)，在35℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去dcm、tfa等殘余液體。用滴管將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的液體逐滴加入7-8倍殘液體積的冰乙醚內(nèi)，靜置產(chǎn)生沉淀后，用高速冷凍離心機(jī)在9000rpm、4℃條件下離心10min，反復(fù)乙醚沉淀，離心5-6次。除去上層清液，保留沉淀，通風(fēng)櫥內(nèi)待乙醚揮發(fā)完之后，向沉淀中加超純水，超聲搖勻，放入冰箱中預(yù)凍1h，再使用凍干機(jī)-60℃冷凍干燥24h左右，即得到純化的產(chǎn)品，密封-20℃保存。

（4）配制肽分子ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys的水沖液（ph3.5?4.0）溶液，其濃度分別為0.25mm，0.5mm，1.0mm和2.0mm，室溫放置3天，圓二色譜結(jié)果（圖1a）發(fā)現(xiàn)分子在0.5mm濃度及其以下主要呈現(xiàn)為無(wú)規(guī)卷曲的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而在0.5mm濃度以上呈現(xiàn)β-折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，原子力顯微鏡結(jié)果（圖1b,c）顯示，0.2mm濃度時(shí)溶液中有許多無(wú)規(guī)聚集體存在，而沒(méi)有規(guī)則的自組裝結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，1.0mm濃度時(shí)分子自組裝為自組裝體長(zhǎng)度為20?200nm，寬度為10?30nm，厚度為4?5nm的片層狀結(jié)構(gòu)構(gòu)。

（5）配制肽分子ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys和λ-dna分子的混合溶液，固定λ-dna濃度為10μg/ml（溶液中同時(shí)加入溴化乙錠etbr，其濃度為1.54×10^-3mm），控制肽分子濃度使其正電荷數(shù)目與dna分子負(fù)電荷數(shù)目的比值（+/-）從小到大依次增加，檢測(cè)體系在600nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度的變化（激發(fā)波長(zhǎng)：520nm），熒光強(qiáng)度隨+/-比值增加而減小，在+/->2.5時(shí)達(dá)到平衡（圖2a），說(shuō)明肽分子能夠有效取代etbr與dna分子結(jié)合。λ-dna分子自身在溶液中采取伸展構(gòu)象（圖2b），其水合動(dòng)力學(xué)直徑為400?600nm（圖2c），而其與肽分子的混合溶液（+/-=3）中dna分子高度壓縮凝聚，變?yōu)轭w粒狀結(jié)構(gòu)（圖2d），其水合動(dòng)力學(xué)直徑為100?200nm（圖2c）。

實(shí)施例2：酶解和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

（1）酶解實(shí)驗(yàn)：配制λ-dna分子和多肽分子的混合溶液，固定λ-dna濃度為10μg/ml，控制肽分子濃度使其正電荷數(shù)目與dna分子負(fù)電荷數(shù)目的比值（+/-）從0開(kāi)始逐漸變大；在溶液中加入hindiii核酸酶作用1小時(shí)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果（圖3）顯示，+/-=0時(shí)，存在多個(gè)清晰條帶，說(shuō)明裸露的λ-dna分子被酶解為多個(gè)小分子量片段；而+/-=0.5時(shí)，條帶數(shù)目大大減少且顏色變淺；+/->0.5時(shí)，沒(méi)有可見(jiàn)的電泳條帶。結(jié)果說(shuō)明，肽分子與dna分子結(jié)合后，可以有效地保護(hù)dna分子不被核酸酶酶解。

（2）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：首先在無(wú)菌的96孔板中接種100ul密度為1×10⁵cells/ml的hpeg2/nih3t3細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)箱中24h，待其貼壁后將孔板中的培養(yǎng)液吸出，向每個(gè)孔中加入100ul新鮮培養(yǎng)液和100ul經(jīng)過(guò)過(guò)濾的不同濃度的多肽溶液，每個(gè)濃度設(shè)立4個(gè)平行abspeptide，另外用只加緩沖液tris不加多肽的孔作為對(duì)照組abstris，之后將孔板重新置于37℃培養(yǎng)箱中6h，作用完成后，向每個(gè)孔中加入20ul濃度為5mg/ml的mtt溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，之后將孔板中的液體吸出，在每個(gè)孔中加入150ul的dmso，并向空白孔中加入等量的dmso作為調(diào)零孔absblank，然后將孔板置于搖床上震蕩10min使之充分混勻，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式為：

survivalratio=1-(abstris-abspeptide)/(abstris-absblank)。

從圖4可以看出，ile-ile-ile-val-val-val-ala-ala-ala-gly-gly-gly-lys-lys-lys分子在200μm濃度以下時(shí)，hpeg2細(xì)胞和nih3t3細(xì)胞的存活率都在95%以上，也就是說(shuō)該肽分子200μm濃度以下對(duì)所研究細(xì)胞沒(méi)有毒性。

以上對(duì)本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說(shuō)明的是，以上實(shí)施例只能用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡(jiǎn)單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的等同替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。