本發(fā)明屬于生物化學中的多肽藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種對膠原誘導的血小板聚集具有促進作用的多肽。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病包括急性心肌梗死、缺血性心臟病、腦卒中、腦梗死、肺梗死和周圍血管病等常見病，近年來發(fā)病呈年輕化趨勢，已成為嚴重威脅人類健康的頭號殺手。動脈粥樣硬化血栓形成是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，而血小板激活和聚集是誘導血管內(nèi)血栓形成的重要因素。因此，研究開發(fā)影響血小板聚集功能藥物具有重要意義。血小板通過粘附、聚集、釋放等功能不僅參與生理性止血過程，同時在組織修復、炎癥反應、血栓形成及器官移植排斥等病理過程中也扮演著相當重要的角色【1】。其中，血小板聚集對于血栓的形成起著核心作用【2】。血小板聚集的誘導劑主要包括：花生四烯酸、二磷酸腺苷、膠原、凝血酶等。而膠原是血小板活化聚集的強力誘導劑，血小板表面有兩種主要的膠原受體：整合素α2β1（gpⅰa-ⅱa）受體和血小板糖蛋白ⅵ（gpⅳ）受體。其中，α2β1主要參與血小板粘附，而（gpⅳ）主要參與血小板粘附后的信號轉(zhuǎn)導和血小板活化與聚集【3-6】。目前，臨床上常用的抗血小板藥物多為非肽類藥物，主要包括：阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛、替羅非班等。近年來，大量國內(nèi)外文獻報道了具有抗血栓活性的生物活性肽，其具有易消化吸收，免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抗癌和抗氧化等其他作用【7】。例如：rgd序列相關(guān)肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arg-gly-asp）序列的多肽，rgd存在于纖維蛋白原中，可競爭性抑制gpⅱb/ⅲa配體識別位點，從而抑制血小板聚集【8,9】；依替巴肽是一個合成型的環(huán)多肽,其結(jié)構(gòu)由7個氨基酸環(huán)繞而成,包含6個氨基酸和巰丙酰殘基（mpa-har-gly-asp-trp-pro-cys-nh2），而活性基團為賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,該基團可“封閉”血小板gpⅱb/ⅲa受體,可逆地阻止其與凝血因子ⅰ結(jié)合,從而起到抗血小板聚集的作用【10,11】。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種對膠原誘導的人血小板聚集具有促進作用的多肽。實現(xiàn)本發(fā)明所述目的而采取的技術(shù)方案是：該多肽包含有seqidno:1所示的km13多肽的序列，其序列為trp-tyr-lys-gly-glu-arg-val-asp-gly-asn-arg-gln-ile-val-gly-tyr-ala，其分子量為2010.01da。合成多肽后，經(jīng)高效液相色譜法及質(zhì)譜法技術(shù)驗證，表明合成的底物為完整的peptidei氨基酸序列（附圖1、附圖2）。本發(fā)明所提供的多肽經(jīng)測試具有促進膠原誘導的血小板聚集活性，在km13濃度為2.5～10nm時可以促進膠原誘導的人血小板聚集，其促進率為25%，因此可作為預防和治療出血性疾病藥物。該多肽限定于促進膠原誘導的血小板聚集，可用于探索其與其它血小板激活劑（花生四希酸，adp，瑞斯托霉素等）對血小板的作用及相關(guān)功能的影響，還可以用于監(jiān)測現(xiàn)有的抗血小板治療。本發(fā)明所提供的多肽的生物學特性能預見其許多應用。本發(fā)明可涉及用于出血性疾?。涸u估血小板聚集功能，評估現(xiàn)有止血治療（止血繃帶、止血粘著劑等）的有效性；同時，因其在血管損傷情況下可強化血小板就地募集功能，從而加強止血療效。本發(fā)明可涉及用于血栓性疾?。涸u估血小板聚集功能，評價抗血小板治療（如阿司匹林，氯吡格雷、替格瑞洛等）現(xiàn)在或?qū)碇委煹挠行?；同時，因其促血小板聚集作用，可用于抗血栓治療。本發(fā)明可作為瘢痕形成劑或皮膚病學乳劑的用途：某些傷口瘢痕形成或皮膚性疾病的愈合需要血小板的就地遷移、粘附、聚集和活化。本發(fā)明是合成一個由17個氨基酸組成的多肽，通過體外人血血小板聚集實驗來測定其對血小板聚集活性的作用。實驗證明，該多肽對膠原誘導的血小板聚集有顯著的促進作用。附圖說明下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明的發(fā)明范圍。圖1為本發(fā)明所提供的多肽的高效液相色譜純化圖：峰值c即為km13。圖2為峰值c（即km13）的二級質(zhì)譜圖。圖3為經(jīng)光學比濁法檢測km13對膠原誘導的血小板聚集的影響。具體實施方式實施例1：本發(fā)明所提供的多肽人體外促膠原誘導的血小板聚集。通過光學比濁法檢測來評價km13對膠原誘導的血小板聚集的影響。從我院血庫提供的健康的志愿者簽字同意后，收集單采血小板。（1）取1ml單采血小板，20℃下，200g/分鐘，離心30min。用1mlrcd緩沖液(nacl108mm，kcl38mm，nahco31.7mm，sodiumcitrate21.2mm，glucose27.8mm，mgcl2·6h2o1.1mm)重懸沉淀為富含血小板的血漿，rcd緩沖液為貧血小板的血漿。（2）吸取500ul血小板重懸液37℃下預熱5min，打開血小板聚集儀，按要求設置好參數(shù)，將其置于血小板聚集儀測試區(qū)調(diào)零。后在上述血小板重懸液中加入不同濃度的km13（2.5nm，5nm，10nm）37℃預熱5min后，放入磁力棒，將帶有磁力攪拌棒的血小板反應杯插入機器的檢測孔中，在37℃，1000rpm/s條件下觀察km13對血小板聚集的影響，共觀察6-10min。每組重復三次，取平均值。（3）吸取血小板重懸液，加入不同濃度的km13，37℃，50rpm/min恒溫震蕩箱中孵育1小時，后將孵育液放入血小板反應杯并插入機器的檢測孔中，調(diào)零后加入1ul膠原，37℃，1000rpm/s條件下觀察血小板聚集率的變化情況，共觀察6～10min。每組重復三次，取平均值。通過以下公式計算血小板聚集促進率：[(y-x)/x]*100%。x代表膠原誘導的血小板平均聚集率；y代表km13+膠原誘導的血小板平均聚集率。（附圖3）。經(jīng)血小板聚集實驗，該多肽能顯著促進膠原誘導的人血小板聚集。其中，km13單獨作用下，不能顯著誘導血小板聚集；膠原單獨作用下，誘導血小板平均聚集率為55%；km13和膠原共同作用下誘導血小板平均聚集率為73%。在2.5～10nm范圍內(nèi)，隨著km13濃度的增加，血小板聚集率沒有明顯變化。km13濃度（nm）0nm2.5nm5nm10nm血小板聚集率（%）55737373從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供的多肽對膠原誘導的人血小板聚集有促進作用,促進率約為25%。本發(fā)明提供的多肽促進膠原誘導的人血小板聚集率與多肽濃度無明顯關(guān)系。參考文獻[1]georgejn.platelets[j].lancet(london,england).2000,355(9214):1531-9。[2]panicciar,priorar,liottaaa,abbater.plateletfunctiontests:acomparativereview[j].vaschealthriskmanag.2015,11:133-48。[3]collerbs,beerjh,scudderle,steinbergmh.collagen-plateletinteractions:evidenceforadirectinteractionofcollagenwithplateletgpia/iiaandanindirectinteractionwithplateletgpiib/iiiamediatedbyadhesiveproteins[j].blood.1989,74(1):182-92。[4]moroim,jungsm.plateletglycoproteinvi:itsstructureandfunction[j].thrombosisresearch.2004,114(4):221-33。[5]puettd,wassermanbk,fordjd,cunninghamlw.collagen-mediatedplateletaggregation.effectsofcollagenmodificationinvolvingtheproteinandcarbohydratemoieties[j].thejournalofclinicalinvestigation.1973,52(10):2495-506。[6]tsujim,ezumiy,araim,takayamah.anovelassociationoffcreceptorgamma-chainwithglycoproteinviandtheirco-expressionasacollagenreceptorinhumanplatelets[j].thejournalofbiologicalchemistry.1997,272(38):23528-31。[7]takahashik,ohbak,kanekok.ubiquitousexpressionandmultiplefunctionsofbiologicallyactivepeptides[j].peptides.2015,72:184-91。[8]huangcl,chengjc,sterna,hsiehjt,liaoch,tsengcp.disabled-2isanovelalphaiib-integrin-bindingproteinthatnegativelyregulatesplatelet-fibrinogeninteractionsandplateletaggregation[j].journalofcellscience.2006,119(pt21):4420-30。[9]zhangjg,krajdenob,kainthanrk,kizhakkedathujn,constantinescui,brooksde,etal.conjugationtohyperbranchedpolyglycerolsimprovesrgd-mediatedinhibitionofplateletfunctioninvitro[j].bioconjugatechemistry.2008,19(6):1241-7。[10]厲保秋,楊桂芹,王紅霞,魏玉華.依替巴肽一級結(jié)構(gòu)的確證[j].藥物分析雜志.2007(07):961-4。[11]王曉鋒,陳乃宏,王文.抗血小板聚集藥物的機制研究進展[j].中國康復理論與實踐.2010(10):954-7。sequencelisting<110>昆明醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院<120>一種促血小板聚集多肽<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>17<212>prt<213>人工序列<400>1trptyrlysglygluargvalaspglyasnargglnilevalglytyrala151015當前第1頁12