本發(fā)明涉及土壤提取物純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤中球囊霉素的提純方法。

背景技術(shù)：

球囊霉素是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種叢枝菌根真菌分泌到土壤中的一類(lèi)糖白質(zhì)，能夠和單克隆抗體(mab32b11)發(fā)生免疫性熒光反應(yīng)，且非常穩(wěn)定，難溶于水，只有用偏堿性的檸檬酸鈉溶液才能提取得到。球囊霉素由n連接而成，分子量約為355kd，由3％～5％n、36％～59％c、4％～6％h、33％～49％o和0.03％～0.1％p組成，有些還含有0.8％～8.8％fe。球囊霉素還屬于一種熱激蛋白，其蛋白序列與一種線粒體基質(zhì)熱激蛋白hsp60的序列高度同源(>80％)。

最初的球囊霉素的提取方法為考馬斯亮藍(lán)法，其原理是：除球囊霉素蛋白以外的所有非熱穩(wěn)態(tài)蛋白在浸提過(guò)程中都能夠被破壞。根據(jù)這一原理球囊霉素被分為總球囊霉素(tg)、易提取球囊霉素(eeg)、免疫反應(yīng)性總球囊霉素(irtg)和免疫反應(yīng)性易提取球囊霉素(ireeg)。最近，grsp被分成3種：易提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(ee-grsp)、難提取球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(de-grsp)和總球囊霉素相關(guān)土壤蛋白(t-grsp＝ee-grsp+de-grsp)。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，球囊霉素能夠提高水穩(wěn)性團(tuán)聚體的含量和土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性，改善土壤理化性狀，在保護(hù)、恢復(fù)和重建生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。球囊霉素也夠能固定土壤中的碳和氮，是土壤有機(jī)碳庫(kù)的重要組分。球囊霉素還具有非常重要的膠結(jié)功能，它能夠與重金屬元素結(jié)合，并通過(guò)吸附、隔離作用，過(guò)濾重金屬或者降低重金屬的生物可利用性。此外，球囊霉素還可以提高植物的抗旱性。

球囊霉素的定量研究涉及提取和定量測(cè)定兩個(gè)方面，一般提取球囊霉素通常采用wright和upadhyaya描述的方法，通過(guò)不同的提取條件可分別獲得易提取球囊霉素和總提取球囊霉素；球囊霉素的定量測(cè)定則采用考馬斯亮藍(lán)g-2500染色或者酶聯(lián)免疫法(elisa)對(duì)提取液中的球囊霉素含量進(jìn)行定量。整個(gè)方法的關(guān)鍵步驟就是從土壤中獲得球囊霉素提取液，因?yàn)槠淝蚰颐顾氐暮考疤禺愋灾苯佑绊懞罄m(xù)的研究。然而，一系列研究指出，應(yīng)用wright和upadhyaya的方法提取的球囊霉素并非am真菌的專(zhuān)性分泌物，不能確定為真正意義上的球囊霉素。之后也有不少研究者對(duì)球囊霉素的提取方法進(jìn)行改進(jìn)，但仍是無(wú)法從土壤中獲得純度較高的相關(guān)蛋白，這嚴(yán)重限制了人們研究其在土壤中的分布及環(huán)境功能。因此，本發(fā)明提供一種土壤中球囊霉素的提純方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)從土壤中提取球囊霉素的傳統(tǒng)方法并不是專(zhuān)性的方法，不能去除球囊霉素以外的所有非熱穩(wěn)態(tài)土壤蛋白，從而無(wú)法得到高純度球囊霉素的問(wèn)題，提供了一種土壤中球囊霉素的提純方法，該方法能去除球囊霉素以外的所有非熱穩(wěn)態(tài)土壤蛋白，得到高純度的球囊霉素。

本發(fā)明提供的一種球囊霉素的提純方法，步驟包括：

s1、采集土壤表面0-20cm的黃壤，混勻風(fēng)干，過(guò)孔徑4mm的網(wǎng)篩去除土壤中雜質(zhì)；

s2、取步驟s1所得土壤，加入20mmol/l，ph為7的檸檬酸鈉溶液，振蕩30～60s，后于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，分別收集上清液及沉淀；

s3、將步驟s2所得上清液于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液，重復(fù)提取、離心、收集上清液的過(guò)程多次至上清液的顏色不再是紅棕色，即得液態(tài)的易提取球囊霉素；

s4、取步驟s2所得沉淀，加入50mmol/l，ph為8的檸檬酸鈉溶液，振蕩至沉淀均勻散開(kāi)，再于100-105kpa，120-125℃條件下提取55-65min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液，重復(fù)提取、離心、收集上清液的過(guò)程多次至上清液的顏色不再是紅棕色，即得液態(tài)的難提取球囊霉素；

s5、取步驟s1所得土壤，加入50mmol/l，ph為8的檸檬酸鈉溶液，振蕩30～60s，后于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液，重復(fù)提取、離心、收集上清液的過(guò)程多次至上清液的顏色不再是紅棕色，即得液態(tài)的總提取球囊霉素；

s6、分別將步驟s3所得液態(tài)的易提取球囊霉素、步驟s4所得液態(tài)的難提取球囊霉素、步驟s5所得液態(tài)的總提取球囊霉素的ph調(diào)節(jié)至2.5后，在4℃，4000～8000g/s下離心15～20min，棄去上清液收集下層沉淀；溶解沉淀后裝入透析袋，置于去離子水下透析60～72h，收集提取液，提取液在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥12～24h，得到固態(tài)的純化易提取球囊霉素、難提取球囊霉素和總提取球囊霉素。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明使用柑橘園特定深度的土壤進(jìn)行提取，原料易得，預(yù)處理要求簡(jiǎn)單對(duì)環(huán)境無(wú)污染；

(2)本發(fā)明與傳統(tǒng)的提取方法相比，安全高效，能去除球囊霉素以外的所有非熱穩(wěn)態(tài)土壤蛋白，得到高純度的球囊霉素；

(3)本發(fā)明提取的高純度的球囊霉素為固態(tài)，方便對(duì)其具體組成、基團(tuán)分布、空間構(gòu)型、結(jié)構(gòu)特征的研究，認(rèn)識(shí)其“真實(shí)面貌”，并揭示其遷移轉(zhuǎn)化的機(jī)理。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種球囊霉素的提純方法，步驟包括：

s1、采集土壤表面0-20cm的黃壤，混勻風(fēng)干，過(guò)孔徑4mm的網(wǎng)篩去除土壤中雜質(zhì)；

s2、取步驟s1所得土壤，加入20mmol/l，ph為7的檸檬酸鈉溶液，振蕩30～60s，后于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，分別收集上清液及沉淀；

s3、將步驟s2所得上清液于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液，重復(fù)提取、離心、收集上清液的過(guò)程多次至上清液的顏色不再是紅棕色，即得液態(tài)的易提取球囊霉素；

s4、取步驟s2所得沉淀，加入50mmol/l，ph為8的檸檬酸鈉溶液，振蕩至沉淀均勻散開(kāi)，再于100-105kpa，120-125℃條件下提取55-65min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液，重復(fù)提取、離心、收集上清液的過(guò)程多次至上清液的顏色不再是紅棕色，即得液態(tài)的難提取球囊霉素；

s5、取步驟s1所得土壤，加入50mmol/l，ph為8的檸檬酸鈉溶液，振蕩30～60s，后于100-105kpa，120-125℃條件下提取25-35min，再在10000～12000g/s下離心5～10min，收集上清液，重復(fù)提取、離心、收集上清液的過(guò)程多次至上清液的顏色不再是紅棕色，即得液態(tài)的總提取球囊霉素；

s6、分別將步驟s3所得液態(tài)的易提取球囊霉素、步驟s4所得液態(tài)的難提取球囊霉素、步驟s5所得液態(tài)的總提取球囊霉素的ph調(diào)節(jié)至2.5后，在4℃，4000～8000g/s下離心15～20min，棄去上清液收集下層沉淀；溶解沉淀后裝入透析袋，置于去離子水下透析60h，收集提取液，提取液在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥12～24h，得到固態(tài)的純化易提取球囊霉素、難提取球囊霉素和總提取球囊霉素。

選用的0-20cm黃壤為球囊霉素含量最豐富的土壤層，利于后續(xù)球囊霉素提取。提取過(guò)程后的特定的轉(zhuǎn)速及時(shí)間，有利于球囊霉素與雜質(zhì)的分離，并提出以上清液顏色來(lái)判斷提純進(jìn)行程度，更加直觀方便、判斷準(zhǔn)確，易于提純步驟的控制。進(jìn)一步的，實(shí)現(xiàn)了球囊霉素液態(tài)到固態(tài)的轉(zhuǎn)化，通過(guò)冷凍干燥的方式得到的固態(tài)純化球囊霉素，更加利于后續(xù)對(duì)其具體組成、基團(tuán)分布、空間構(gòu)型、結(jié)構(gòu)特征的研究。

優(yōu)選的，步驟s2所述檸檬酸鈉溶液配制方法包括如下步驟：

a、配制a液：取0.42～4.2gc6h8o7·h2o溶于100～1000ml蒸餾水中配制得0.02mol/l檸檬酸溶液；

b、配制b液：取0.5365～5.365gna2hpo4·7h2o或0.716～7.16gna2hpo4·12h2o在蒸餾水中溶至100～1000ml配制得0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液；

c、把a(bǔ)液和b液以13:87的比例充分混勻得20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。

優(yōu)選的，步驟s4所述檸檬酸鈉溶液配制方法包括如下步驟：稱取1.4705～14.705g檸檬酸鈉定溶至100～1000ml蒸餾水中使檸檬酸鈉溶液濃度為50mmol/l，定容過(guò)程采用1～4mol氫氧化鈉溶液調(diào)整ph為8.0。

優(yōu)選的，步驟s2所述土壤取量為1.0～5.0g，檸檬酸鈉溶液用量為4～40ml，步驟s4所述檸檬酸鈉溶液用量為8～40ml。

優(yōu)選的，步驟s5所述土壤取量為1.0～5.0g，檸檬酸鈉溶液用量為4～40ml。

優(yōu)選的，步驟s6所述冷凍干燥步驟前進(jìn)行預(yù)凍，所述預(yù)凍溫度為-40℃，預(yù)凍時(shí)間為2-5h。

更加優(yōu)選的，步驟s6所述冷凍干燥為隔板溫度-60℃～-55℃，冷凝器溫度低于-65℃～-60℃，極限真空度0.8～1mbar的條件下冷凍干燥處理20～24h。

優(yōu)選的，步驟s1所述土壤為橘園土壤。

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種球囊霉素的提純方法予以進(jìn)一步說(shuō)明。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)得到。

實(shí)施例一

在橘園采集10～20cm黃壤，混合均勻，風(fēng)干，過(guò)孔4mm的篩子，去除土壤中的根系、垃圾以及石塊。

配制20mmol/l(ph＝7.0)檸檬酸鈉浸提液：(1)a液：0.02mol/l檸檬酸溶液(取0.42gc6h8o7·h2o溶于100ml蒸餾水)；(2)b液：0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液(取0.5365gna2hpo4·7h2o或0.716gna2hpo4·12h2o溶至100ml)；(3)分別量取a液和b液13ml、87ml，充分混勻得到100ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。配置50mmol/l(ph＝8.0)檸檬酸鈉浸提液：稱取1.4705g檸檬酸鈉定溶至100ml蒸餾水中，定容過(guò)程中用1mol氫氧化鈉溶液調(diào)整ph為8.0。

稱取中采集的土壤1g放入離心管10ml中，加入8ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩30s，接著在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，在4℃，10000g/s下離心5min，用10ml離心管分別收集上清液和殘余土。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，在4℃，10000g/s下離心5min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化易提取球囊霉素。

上述殘余土壤中加入8ml50mmol/l(ph＝8.0)檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩，直到黏附在離心管底部的土壤完全散開(kāi)，然后在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，10000g/s下離心10min，收集上清液。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，在4℃，10000g/s下離心10min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化難提取球囊霉素。

再稱取采集的土壤1.0g加入8ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩30s，接著在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，10000g/s下離心10min，收集上清液。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，10000g/s下離心10min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化總提取球囊霉素。

用1m鹽酸滴定純化的易提取、難題取和總提取球囊霉素溶液調(diào)節(jié)其ph為2.5，然后在4℃，4000g/s下離心20min，棄去上清液，收集下層沉淀。用0.1m氫氧化鈉溶解收集的下層沉淀，再用透析袋裝入已溶解的沉淀，袋中留三分之一至一半的空間，加樣端用夾子夾緊袋口，使透析袋處于懸浮狀態(tài)，透析袋在去離子水下透析60h，期間要加快透析速度可多次更換透析液，或使用磁力攪拌器，透析完后用離心管收集提取液。然后把裝有提取液的離心管放在超低溫冰箱中預(yù)凍，-40℃下冷凍2小時(shí)以上，得到凍牢凍透的提取液。將預(yù)凍好提取液從超低溫冰箱中取出，快速擦干離心管外壁的水分，去掉離心管的蓋子，再將裝有提取液的離心管放入冷凍干燥機(jī)中，在隔板溫度低于-55℃，冷凝器溫度低于-60℃，極限真空度低于1mbar的條件下冷凍干燥處理20h。即可得到固態(tài)的純化易提取、難提取和總提取球囊霉素。

本發(fā)明方法獨(dú)特，檢測(cè)上述所制得的固態(tài)的純化易提取、難提取和總提取球囊霉素純度分別為99.3％，98.5％，97.6％。

實(shí)施例二

在橘園采集0～20cm黃壤，混合均勻，風(fēng)干，過(guò)孔4mm的篩子，去除土壤中的根系、垃圾以及石塊。

配制20mmol/l(ph＝7.0)檸檬酸鈉浸提液：(1)a液：0.02mol/l檸檬酸溶液(取4.2gc6h8o7·h2o溶于1000ml蒸餾水)；(2)b液：0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液(取5.365gna2hpo4·7h2o或7.16gna2hpo4·12h2o溶至1000ml)；(3)分別量取a液和b液130ml、870ml，充分混勻得到1000ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。配置50mmol/l(ph＝8.0)檸檬酸鈉浸提液：稱取7.3525g檸檬酸鈉定溶至500ml蒸餾水中，定容過(guò)程中用2mol氫氧化鈉溶液調(diào)整ph為8.0。

稱取中采集的土壤4g放入離心管50ml中，加入32ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩60s，接著在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，在4℃，12000g/s下離心8min，用50ml離心管分別收集上清液和殘余土。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，在4℃，12000g/s下離心8min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化易提取球囊霉素。

上述殘余土壤中加入32ml50mmol/l(ph＝8.0)檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩，直到黏附在離心管底部的土壤完全散開(kāi)，然后在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，12000g/s下離心8min，收集上清液。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，在4℃，12000g/s下離心8min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化難提取球囊霉素。

再稱取采集的土壤4.0g加入32ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩60s，接著在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，12000g/s下離心8min，收集上清液。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，12000g/s下離心8min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化總提取球囊霉素。

用2m鹽酸滴定純化的易提取、難題取和總提取球囊霉素溶液調(diào)節(jié)其ph為2.5，然后在4℃，6000g/s下離心20min，棄去上清液，收集下層沉淀。用2m氫氧化鈉溶解收集的下層沉淀，再用透析袋裝入已溶解的沉淀，袋中留三分之一至一半的空間，用細(xì)繩綁緊透析袋兩端，使透析袋處于懸浮狀態(tài)，透析袋在去離子水下透析72h，期間要加快透析速度可多次更換透析液，或使用磁力攪拌器，透析完后用離心管收集提取液。然后把裝有提取液的離心管放在超低溫冰箱中預(yù)凍，-40℃下冷凍2小時(shí)以上，得到凍牢凍透的提取液。將預(yù)凍好提取液從超低溫冰箱中取出，快速擦干離心管外壁的水分，去掉離心管的蓋子，再將裝有提取液的離心管放入冷凍干燥機(jī)中，在隔板溫度低于-55℃，冷凝器溫度低于-60℃，極限真空度低于1mbar的條件下冷凍干燥處理24h。即可得到固態(tài)的純化易提取、難提取和總提取球囊霉素。

本發(fā)明方法獨(dú)特，檢測(cè)上述所制得的固態(tài)的純化易提取、難提取和總提取球囊霉素純度分別為97.8％，96.1％，96.4％。

實(shí)施例三

在橘園采集10～15cm黃壤，混合均勻，風(fēng)干，過(guò)孔4mm的篩子，去除土壤中的根系、垃圾以及石塊。

配制20mmol/l(ph＝7.0)檸檬酸鈉浸提液：(1)a液：0.02mol/l檸檬酸溶液(取4.2gc6h8o7·h2o溶于1000ml蒸餾水)；(2)b液：0.02mol/l磷酸氫二鈉溶液(取5.365gna2hpo4·7h2o或7.16gna2hpo4·12h2o溶至1000ml)；(3)分別量取a液和b液130ml、870ml，充分混勻得到1000ml20mmol/l、ph＝7.0的檸檬酸鈉緩沖液。配置50mmol/l(ph＝8.0)檸檬酸鈉浸提液：稱取14.705g檸檬酸鈉定溶至1000ml蒸餾水中，定容過(guò)程中用4mol氫氧化鈉溶液調(diào)整ph為8.0。

稱取中采集的土壤5g放入50ml離心管中，加入32ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩60s，接著在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，12000g/s下離心10min，收集上清液和殘余土。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，12000g/s下離心10min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化易提取球囊霉素。

上述殘余土壤中加入40ml50mmol/l(ph＝8.0)檸檬酸鈉浸提液，然后在然后在振蕩器上振蕩，直到黏附在離心管底部的土壤完全散開(kāi)，然后在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，12000g/s下離心10min，收集上清液。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取30min，12000g/s下離心10min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液體的純化難提取球囊霉素。

再稱取采集的土壤5.0g加入40ml20mmol/l(ph＝7.0)的檸檬酸鈉浸提液，然后在振蕩器上振蕩30s，接著在高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，10000g/s下離心10min，收集上清液。重復(fù)數(shù)次把收集的上清液再放入高溫滅菌鍋103kpa，121℃條件下提取60min，在4℃，10000g/s下離心10min，直到離心管中上層液的顏色不再是紅棕色，得到液態(tài)的純化總提取球囊霉素。

用2m鹽酸滴定純化的易提取、難題取和總提取球囊霉素溶液調(diào)節(jié)其ph為2.5，然后在4℃，8000g/s下離心15min，棄去上清液，收集下層沉淀。用0.5m氫氧化鈉溶解收集的下層沉淀，再用透析袋裝入已溶解的沉淀，袋中留三分之一至一半的空間，加樣端用夾子夾緊袋口，使透析袋處于懸浮狀態(tài)，透析袋在去離子水下透析60h，期間要加快透析速度可多次更換透析液，或使用磁力攪拌器，透析完后用離心管收集提取液。然后把裝有提取液的離心管放在超低溫冰箱中預(yù)凍，-40℃下冷凍2小時(shí)以上，得到凍牢凍透的提取液。將預(yù)凍好提取液從超低溫冰箱中取出，快速擦干離心管外壁的水分，去掉離心管的蓋子，再將裝有提取液的離心管放入冷凍干燥機(jī)中，在隔板溫度低于-55℃，冷凝器溫度低于-60℃，極限真空度低于1mbar的條件下冷凍干燥處理24h。即可得到固態(tài)的純化易提取、難提取和總提取球囊霉素。

本發(fā)明方法獨(dú)特，檢測(cè)上述所制得的固態(tài)的純化易提取、難提取和總提取球囊霉素純度分別為97.4％，95.6％，95.8％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。