本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及核酸純化技術(shù)，特別是提取丙型肝炎病毒rna的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitisvirusc，hcv)感染引起的病毒性肝炎。由于目前尚未確立丙型肝炎的預(yù)防方法，并且部分丙型肝炎患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，所以hcv感染的早期發(fā)現(xiàn)與早期治療非常重要。目前臨床上常用的hcv檢測(cè)方法主要有兩類：免疫學(xué)方法測(cè)定抗hcv或hcv編碼蛋白，pcr法檢測(cè)丙型肝炎病毒核糖核酸(hcv-rna)。免疫學(xué)方法存在其自身的局限性：窗口期長(zhǎng)(50-70天)，而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍長(zhǎng)時(shí)間存在。血清中的hcv-rna是病毒復(fù)制和肝炎進(jìn)程的確切標(biāo)志，因此與免疫學(xué)診斷相比，核酸診斷具有更高的靈敏度和特異性，大大縮短了檢測(cè)的窗口期，同時(shí)漏檢概率極大縮小。由于hcv感染者血清病毒滴度通常很低，而且病毒核酸極易降解，所以rna提取方法對(duì)丙型肝炎病毒rna定量檢測(cè)的效果有較大的影響。因此，能夠從微量樣本中高效回收hcv病毒rna的方法能夠進(jìn)一步改善樣本中hcv-rna的定量檢測(cè)靈敏度。另外，經(jīng)典的rna提取方法往往會(huì)用到有毒試劑如異硫氰酸胍、苯酚、氯仿等，這也是其難以避免的固有缺陷之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種具有高安全性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的丙型肝炎病毒核酸(hcv-rna)高效提取試劑盒。本發(fā)明的試劑盒主要包含以下組分：核酸提取試劑2(裂解液)：鹽酸胍40-70g/100ml，曲拉通(tx-100)2％-20％(v/v)，檸檬酸0-2g/l，檸檬酸鈉0-15g/l，ph4.0-7.0，優(yōu)選的，鹽酸胍50-60mg/100ml，曲拉通10-20％(v/v)，檸檬酸1-2g/l，檸檬酸鈉10-15g/l，ph4.0-6.0；核酸提取試劑4(洗滌液i)：鹽酸胍10-50g/100ml，檸檬酸0-2g/l，檸檬酸鈉0-20g/l，異丙醇20％-60％(v/v)，ph4.0-7.0，優(yōu)選的，鹽酸胍20-40g/100ml，檸檬酸1-2g/l，檸檬酸鈉10-20g/l，異丙醇30％-50％(v/v)，ph4.0-6.0；核酸提取試劑5(洗滌液ii)：氯化鈉5-20g/l，曲拉通(tx-100)0-5％(v/v)，優(yōu)選的，氯化鈉5-15g/l，曲拉通(tx-100)0-3％(v/v)。配制得到的試劑均為無(wú)色透明液體，2℃-8℃保存，效期18個(gè)月。根據(jù)需要，可向核酸提取試劑5中添加生物防腐劑，優(yōu)選pc-300，最優(yōu)選200μl/lpc-300。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上述鹽酸胍與檸檬酸緩沖體系的組合，提供了對(duì)hcv-rna的高安全性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的提取。本發(fā)明的試劑盒還可包含核酸提取試劑3：磁珠，10-50mg/ml，優(yōu)選的25mg/ml。另外，本發(fā)明的試劑盒還可包含以下組分：核酸提取試劑1：蛋白酶k10-40mg/ml，優(yōu)選的20mg/ml；核酸提取試劑6：礦物油50-100％(v/v)，優(yōu)選的，礦物油70-100％(v/v)；核酸提取試劑7：tris(ph8.0)1-50mm，edta(ph8.0)1-20mm，優(yōu)選的，tris(ph8.0)5-20mm，edta(ph8.0)1-10mm。根據(jù)需要，可向核酸提取試劑1中添加生物防腐劑，優(yōu)選疊氮化鈉，最優(yōu)選1mg/ml疊氮化鈉。根據(jù)需要，可向核酸提取試劑3和6中添加生物防腐劑，優(yōu)選pc-300，最優(yōu)選200μl/lpc-300。相應(yīng)地，使用所述試劑盒提取hcv-rna的流程如下：i.試劑準(zhǔn)備(在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行)取出試劑盒各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)備用。ii.樣本處理(在樣本處理區(qū)進(jìn)行)a.根據(jù)樣本數(shù)量，取1.5ml或2.0ml離心管分別標(biāo)記，每管加入10μl核酸提取試劑1；b.每管加入200μl待測(cè)樣本，蓋上管蓋，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心；c.每管加入600μl核酸提取試劑2以及5μl核酸提取試劑3，蓋上管蓋，振蕩混勻10秒，室溫靜置10分鐘；d.瞬時(shí)離心，將離心管置于磁性分離器上，3分鐘后緩慢將溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；e.每管加入800μl核酸提取試劑4，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器上，3分鐘后緩慢將溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；f.每管加入700μl核酸提取試劑5和100μl核酸提取試劑6，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器上；g.約3分鐘后，上清液分為兩層，將吸頭伸入離心管底部，從底部開(kāi)始緩慢將液體完全吸出丟棄；瞬時(shí)離心30秒后將離心管置于磁性分離器上；h.約3分鐘后，將管底殘余液體完全吸出丟棄；i.每管加入35μl核酸提取試劑7，振蕩混勻使離心管壁的棕色殘留物完全洗脫于溶液中，60℃溫浴10分鐘；j.瞬時(shí)離心，將離心管置于磁性分離器上靜置3分鐘，上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。若不及時(shí)使用，應(yīng)將提取的核酸保存于-20℃以下。本發(fā)明的試劑盒中使用鹽酸胍與檸檬酸緩沖體系的組合進(jìn)行hcv-rna的高效提取，避免了有毒試劑如異硫氰酸胍、苯酚、氯仿等的使用，安全性更高。另外，本發(fā)明的試劑盒在靈敏度、穩(wěn)定性方面也有長(zhǎng)足的進(jìn)步和提高。實(shí)施方式本文包括以下的實(shí)施例，用于以例證的方式更清楚、明確地闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的公開(kāi)應(yīng)當(dāng)理解，可以在所公開(kāi)的特定的實(shí)施方式中進(jìn)行許多改變但是仍然獲得相似或類似的結(jié)果，而不偏離本發(fā)明的思想和范圍。本發(fā)明的具體實(shí)施方式僅用于解釋本發(fā)明，而非意圖通過(guò)任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1血漿hcv提取試劑的制備制備以下四種配方，用于提取血漿hcv。配方a：本發(fā)明的試劑盒核酸提取試劑1：蛋白酶k20mg/ml；核酸提取試劑2(裂解液)：鹽酸胍573.18g/l，曲拉通(tx-100)200ml/l，檸檬酸1.68g/l，檸檬酸鈉7.35g/l，ph為4.4±0.1；核酸提取試劑3：磁珠，100％；核酸提取試劑4(洗滌液i)：鹽酸胍382.12g/l，檸檬酸1.05g/l，檸檬酸鈉11.76g/l，異丙醇400ml/l，ph為5.4±0.1；核酸提取試劑5(洗滌液ii)：氯化鈉5.84g/l，曲拉通(tx-100)10ml/l；核酸提取試劑6：礦物油100％(v/v)；核酸提取試劑7：1mtris(ph8.0)10ml/l，0.5medta(ph8.0)2ml/l。配制過(guò)程中需要注意：1.裂解液：depc處理水為配液溶劑；鹽酸胍體積偏大，加入depc水需緩慢少量加入，以免超過(guò)溶液體積；鹽酸胍較難溶，可以使用超聲或溫浴幫助溶解。2.洗滌液i：depc處理水為配液溶劑；鹽酸胍體積偏大，加入depc水需緩慢少量加入，以免超過(guò)溶液體積；鹽酸胍較難溶，可以使用超聲或溫浴幫助溶解；異丙醇有刺激性氣味，操作時(shí)需注意。3.洗滌液ii：depc處理水為配液溶劑。配方b：市售丙型肝炎病毒(hcv)核酸定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自圣湘生物)配方c：根據(jù)名為《一種利用一步法實(shí)時(shí)熒光定量rt-qpcr檢測(cè)丙型肝炎病毒核酸的試劑盒》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)cn106119415a中的公開(kāi)內(nèi)容，配制病毒核酸提取試劑配方d：根據(jù)名為《一種提取動(dòng)物組織樣品中病原核酸的試劑》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)cn102417905a中的公開(kāi)內(nèi)容，配制病毒核酸提取試劑配方e：核酸提取試劑1：蛋白酶k20mg/ml；核酸提取試劑2(裂解液)：鹽酸胍573.18g/l，曲拉通(tx-100)200ml/l，tris12.11g/l，鹽酸調(diào)ph至4.4±0.1；核酸提取試劑3：磁珠，100％；核酸提取試劑4(洗滌液i)：鹽酸胍382.12g/l，tris12.11g/l，異丙醇400ml/l，鹽酸調(diào)ph至5.4±0.1；核酸提取試劑5(洗滌液ii)：氯化鈉5.84g/l，曲拉通(tx-100)10ml/l；核酸提取試劑6：礦物油100％(v/v)；核酸提取試劑7：1mtris(ph8.0)10ml/l，0.5medta(ph8.0)2ml/l。實(shí)施例2不同配方提取效率的比較使用濃度為5e5iu/ml的hcv血漿樣本，采用實(shí)施例1中的各種配方，分別進(jìn)行rna提取實(shí)驗(yàn)。配方a和配方e對(duì)應(yīng)的提取方法如下：a.取1.5ml離心管分別標(biāo)記，每管加入10μl核酸提取試劑1；b.每管加入200μl待測(cè)樣本，蓋上管蓋，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心；c.每管加入600μl核酸提取試劑2以及5μl核酸提取試劑3，蓋上管蓋，振蕩混勻10秒，室溫靜置10分鐘；d.瞬時(shí)離心，將離心管置于磁性分離器上，3分鐘后緩慢將溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；e.每管加入800μl核酸提取試劑4，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器上，3分鐘后緩慢將溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；f.每管加入700μl核酸提取試劑5和100μl核酸提取試劑6，振蕩混勻5秒，瞬時(shí)離心后將離心管再次置于磁性分離器上；g.約3分鐘后，上清液分為兩層，將吸頭伸入離心管底部，從底部開(kāi)始緩慢將液體完全吸出丟棄；瞬時(shí)離心30秒后將離心管置于磁性分離器上；h.約3分鐘后，將管底殘余液體完全吸出丟棄；i.每管加入35μl核酸提取試劑7，振蕩混勻使離心管壁的棕色殘留物完全洗脫于溶液中，60℃溫浴10分鐘；j.瞬時(shí)離心，將離心管置于磁性分離器上靜置3分鐘，上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。配方c、d對(duì)應(yīng)的提取方法以實(shí)施例1中所列的相應(yīng)專利申請(qǐng)文件或其商業(yè)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。采用熒光定量pcr對(duì)提取得到的rna產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)得到的ct值，結(jié)果如下表1：上述結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒(配方a)具有明顯優(yōu)于配方e、c的提取效率。試劑d可能不適用于血清/血漿樣本，提取失敗。實(shí)施例3提取靈敏度及穩(wěn)定性檢測(cè)選取hcv陽(yáng)性血漿樣本e1，從中取出一部分一式三份進(jìn)行10倍稀釋，分別得到10倍稀釋的樣本e2、e3和e4。使用實(shí)施例1中所述配方b(圣湘生物hcv核酸定量檢測(cè)試劑盒)測(cè)定樣本e1、e2、e3和e4的核酸濃度，得到表2數(shù)據(jù)。表2：配方b測(cè)定值e1e2e3e4ct值29.7533.1135.9540濃度(iu/ml)2.55e+042.66e+03393.4322.57根據(jù)表2可以看出，通過(guò)配方b測(cè)定樣本e4計(jì)算得到的濃度為22.57iu/ml，低于配方b的靈敏度下限25iu/ml。將e4樣本2倍稀釋，得到理論濃度為11iu/ml的1/2e4樣本。使用實(shí)施例1中所述配方a(本發(fā)明試劑盒)測(cè)定樣本e4和1/2e4的核酸濃度，得到表3數(shù)據(jù)。表3：配方a測(cè)定值由表3針對(duì)每種樣品所示出的二十次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的試劑a能夠穩(wěn)定提取樣本e4和1/2e4，證實(shí)試劑的測(cè)出下限低于試劑b。也就是說(shuō)，本發(fā)明試劑盒a在靈敏度上優(yōu)于試劑b。當(dāng)前第1頁(yè)12