本發(fā)明屬于酶制劑應用
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種提高木五糖轉(zhuǎn)化率的專用復合酶制劑及其應用。
背景技術(shù)：
：低聚木糖是一種功能性寡糖，由2～7個d-木糖以β-1，4-木糖苷鍵連接而成的混合物，部分還含有阿拉伯糖醛酸、葡萄糖醛酸側(cè)鏈。低聚木糖是目前功能性寡糖中最能促進體內(nèi)有益菌增長的活性糖，還有預防口腔齲齒、促進鈣的吸收、降低血壓和血清膽固醇、抑制腸道病原菌、預防便秘和腹瀉等生理功能。低聚木糖應用到飼料領(lǐng)域能提高動物的腸道健康和消化率，提高動物的免疫力。目前，制備低聚木糖的原料來源有玉米芯，甘蔗渣，蘆葦和木材，其中大部分的專利是有關(guān)玉米芯的。木材制備低聚木糖的復合酶制劑專利報道比較少。發(fā)明專利cn1266633a公開了一種酶法制備功能性低聚木糖的生產(chǎn)工藝，該方法用玉米芯、玉米秸稈和稻草等作為原料經(jīng)篩選、干燥、粉碎后，用水浸濕，脫水后，用堿浸提，酸中和，最后添加木聚糖酶水解制備低聚木糖。近年來，隨著微生態(tài)學理論研究的不斷發(fā)展與深入，應用微生態(tài)制劑來調(diào)整人體內(nèi)微生態(tài)平衡作為防病、治病和保健作用的手段正在世界范圍內(nèi)形成熱潮。目前，國內(nèi)外已有上百種微生態(tài)制劑被開發(fā)應用。其中以雙歧桿菌活性菌制劑居多，雙歧桿菌是人類腸道菌群中一種重要的有益微生物，該菌具有生物學屏障作用，有控制細胞內(nèi)毒血癥、降低自氧化作用、整腸作用，可恢復腸道菌群的正常水平，對致病菌具有很強的拮抗作用。對雙歧桿菌的研究主要分為兩個方面：一方面通過直接攝入雙歧桿菌活菌體來增加人體內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量，但因這類細菌屬專性厭氧菌，對氧非常敏感，對低ph的抵抗能力較差，活性保持比較困難，市場上的大多數(shù)產(chǎn)品活菌量較低，保存不到一個月就全部死亡。另一方面則通過攝入碳源促進體內(nèi)雙歧桿菌的增殖。盡管葡萄糖對雙歧桿菌等人體內(nèi)有益菌群的增殖效果良好，但由于雙歧桿菌菌群主要定位于人體的大腸部位，淀粉類食物經(jīng)人體口腔、胃和小腸等消化器官的消化吸收后，由之轉(zhuǎn)化而來的葡萄糖卻很難到達大腸部位。與之相比，低聚木糖幾乎不為人體所消化吸收并且很難被體內(nèi)的有害細菌所利用，因此，低聚木糖可作為雙歧因子直接增殖人體內(nèi)的雙歧桿菌。有張曉萍論文表明，聚合度≧4的低聚木糖，能夠減少木糖和木二糖的積累，提高青春雙歧桿菌對這些糖的利用，特別是木四糖和木五糖的利用，同時也能夠獲得較高的菌體濃度，說明聚合度比較高的低聚木糖增殖青春雙岐桿菌的效果要好于聚合度比較低的低聚木糖。本申請的申請人于之前申請的發(fā)明專利cn106754828a，其公開了一種用于桉木制備低聚木糖的復合酶，包括木聚糖酶和纖維素酶；上述的復合酶還包含有甘露聚糖酶。該發(fā)明的復合酶可廣泛應用于低聚木糖的生產(chǎn)，能有效提高桉木半纖維素轉(zhuǎn)化低聚木糖的效率，而且復合酶中的纖維素酶和甘露聚糖酶能明顯促進木聚糖酶對半纖維素的降解作用，三種酶協(xié)同作用，能使木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率提高12.5％，并且木四糖的轉(zhuǎn)化率也提高了50％，但是利用該發(fā)明的復合酶制劑制備木五糖的轉(zhuǎn)化率極低。因此，現(xiàn)有文獻報道中多為生產(chǎn)以木二糖和木三糖為主的低聚木糖的方法和酶制劑，而鮮于關(guān)注木五糖的生產(chǎn)，因此，本發(fā)明致力于開發(fā)聚合度≧4的低聚木糖，尤其是增加低聚木糖中木五糖的含量，用于提高雙歧桿菌的產(chǎn)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，提供了一種提高木五糖轉(zhuǎn)化率的專用復合酶制劑及其應用，用以提高聚合度≧4的低聚木糖，尤其是增加低聚木糖中木五糖的含量，用于提高雙歧桿菌的產(chǎn)量。一種提高木五糖轉(zhuǎn)化率的專用復合酶制劑，包括木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶。進一步，所述復合酶制劑中還包含碳酸鈉。優(yōu)選的，所述復合酶制劑中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸鈉的重量比為2：0.2-0.5：0.5-0.2：0.5-4。優(yōu)選的，所述復合酶制劑中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸鈉的重量比為2：0.2-0.5：0.5-0.2：1.5-3.5。優(yōu)選的，所述復合酶制劑中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸鈉的重量比為2：0.2-0.5：0.5-0.2：2-3。優(yōu)選的，所述復合酶制劑中木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶、碳酸鈉的重量比為2：0.2-0.5：0.5-0.2：2.5。進一步，本發(fā)明的所述復合酶制劑在提高木五糖轉(zhuǎn)化率中的應用。進一步，本發(fā)明還提供了一種所述復合酶制劑用于提高木五糖轉(zhuǎn)化率的方法，包括以下步驟：1)將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過膜脫堿濃縮，得到半纖維素溶液，取濃度為12％的稀硫酸與半纖維素溶液等體積混合，100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)ph至中性；2)用濃硫酸調(diào)節(jié)半纖維素溶液的ph至5.5，按10-12g/kg木聚糖的比例加入所述復合酶制劑，50-60℃作用6-12h；3)酶解反應結(jié)束后，升溫至80℃以上，保溫15min，滅活復合酶；4)將酶解后的溶液通過板框進行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。進一步，本發(fā)明還提供了一種所述復合酶制劑提高木五糖轉(zhuǎn)化率的方法，包括以下步驟：1)將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過膜脫堿濃縮，得到半纖維素溶液，取濃度為12％的稀硫酸與半纖維素溶液等體積混合，100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)ph至中性；2)用濃硫酸調(diào)節(jié)半纖維素溶液的ph至5.5，按10.8g/kg木聚糖的比例加入所述復合酶制劑，50-60℃作用6-12h；3)酶解反應結(jié)束后，升溫至80℃以上，保溫15min，滅活復合酶；4)將酶解后的溶液通過板框進行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。優(yōu)選的，所述復合酶制劑中，木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶的酶活分別為10000u/g、5000u/g、2000u/g。進一步，根據(jù)本發(fā)明的方法制備的低聚木糖溶液在雙歧桿菌培養(yǎng)中的應用。優(yōu)選地，所述雙歧桿菌為動物雙歧桿菌(bifidobacteriumanimalis)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有如下優(yōu)點：(1)本發(fā)明的復合酶制劑處理粘膠纖維壓榨液制備得到的低聚木糖溶液中，木五糖的含量得到顯著提高，木五糖的轉(zhuǎn)化率高達42％。(2)在本發(fā)明的復合酶制劑中，碳酸鈉的添加量對木五糖轉(zhuǎn)化率的影響非常顯著。隨著碳酸鈉添加量的增加，低聚木糖溶液中木五糖的轉(zhuǎn)化率緩慢提高，但當碳酸鈉在復合酶制劑中的添加量達到2.0kg時，木五糖的轉(zhuǎn)化率得到大幅提升，超過40％，當碳酸鈉在復合酶制劑中的添加量超過3.0kg時，木五糖的轉(zhuǎn)化率又開始迅速下降。從而說明，碳酸鈉可以與所述復合酶中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶產(chǎn)生協(xié)同作用，促進木五糖的轉(zhuǎn)化，尤其是當碳酸鈉在復合酶制劑中的添加量為2.0-3.0kg時，協(xié)同促進作用最強，能大幅提升木五糖的轉(zhuǎn)化率，取得了意料不到的技術(shù)效果。(3)以本發(fā)明制備得到的低聚木糖溶液為碳源培養(yǎng)動物雙歧桿菌，能顯著增加動物雙岐桿菌的菌體濃度，24小時和48小時時菌體濃度分別提高了52％和50.5％，從而說明，提高低聚木糖中木五糖的含量能有效促進動物雙歧桿菌的增殖，縮短菌體培養(yǎng)周期，從而降低生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益，效果顯著。綜合上述，本發(fā)明的復合酶制劑能夠以粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液為原料制備以木糖為主要成分的低聚木糖溶液，通過碳酸鈉與復合酶制劑中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶產(chǎn)生的協(xié)同作用，大大提高木五糖的轉(zhuǎn)化率，并且根據(jù)本發(fā)明的酶制劑和方法制備的低聚木糖溶液在動物雙歧桿菌培養(yǎng)中獲得了良好的效果。具體實施方式在粘膠纖維生產(chǎn)過程中，主要通過堿法溶解原料紙漿，具體就是利用氫氧化鈉溶液將紙漿中的半纖維素溶解出來。堿溶解后，將原料進行壓榨，獲得的溶液即為本發(fā)明實施例中所述的粘膠纖維壓榨液，其主要成分為半纖維素和氫氧化鈉。本發(fā)明實施例中采用離子色譜法測定葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖的含量，測定方法具體為：1原理樣品隨著流動相進入固定相(色譜柱)，溶于流動相中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出，不同保留時間留出來的組分，進入電化學檢測器，發(fā)生氧化還原反應，產(chǎn)生強弱不等的信號，由信號形成色譜圖，在一定范圍之內(nèi)，信號值和濃度成線性關(guān)系。電化學檢測工作原理：糖類屬于弱酸，在強堿溶液中會部分或者全部以陰離子形成存在，利用在陰離子色譜柱上不同的保留性進行分離，在強堿性條件下，糖結(jié)構(gòu)中的羥基等電化學活性基團在適當?shù)碾娢幌驴梢栽诮痣姌O表面被氧化而導致電流的變化，電流的大小產(chǎn)生不同的色譜峰。2測定步驟2.1標準曲線取葡萄糖、木糖和木二糖、木三糖、木四糖、木五糖標準溶液先稀釋10倍，再按下表稀釋，為實驗用標準溶液：混合標準溶液(ml)去離子水(ml)總體積(ml)0.10.910.30.710.50.510.70.311.0012.2實驗條件離子色譜儀：ic-5000檢測器：電化學檢測器流速：0.7ml/min柱溫：30℃色譜柱：thermofisherpa10保護柱：thermofisherga10ph電極：agcl電位：standardquad進樣量：25ul流動相：0.25mol/l氫氧化鈉：水＝40:60運行時間：45min出峰順序：葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖3實驗結(jié)果與計算3.1標準曲線的制作以葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖系列濃度為橫坐標，色譜峰面積響應值為縱坐標，列出直線回歸方程：y＝ac+b；其中y為上述某種糖的峰面積，a、b為標準方程系數(shù)，c為對應糖的濃度。3.2樣品含量計算公式：p＝c*n；其中p為樣品中上述某種糖的含量，c為由標準曲線計算出來的對應糖的濃度，n為稀釋倍數(shù)。本實施例中所述的木聚糖酶，植酸酶和甘露聚糖酶均可采購自濰坊康地恩生物科技有限公司，其酶活分別為木聚糖酶10000u/g，植酸酶5000u/g，甘露聚糖酶2000u/g；所述碳酸鈉可購自國藥集團。實施例1一種生產(chǎn)木五糖的專用復合酶，包含木聚糖酶2kg，植酸酶0.2kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉2.0kg。按比例稱取上述各組分，混合均勻，即得本發(fā)明所述專用復合酶。實施例2一種生產(chǎn)木五糖的專用復合酶，包含木聚糖酶2kg，植酸酶0.2kg，甘露聚糖酶0.5kg，碳酸鈉2.3kg。制備方法同實施例1.實施例3一種生產(chǎn)木五糖的專用復合酶，包含木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉3.0kg。制備方法同實施例1.實施例4復合酶在以粘膠纖維壓榨液為原料生產(chǎn)木五糖中的應用1、將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過膜脫堿濃縮，得到低堿高濃度的半纖維素溶液；取20毫升的半纖維素溶液，與20毫升濃度為12％的稀硫酸混合，100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)節(jié)ph至中性，用離子液相色譜測定里面木聚糖的總含量，結(jié)果表明獲得的半纖維素溶液中木聚糖含量為50g/l；2、用濃硫酸調(diào)節(jié)半纖維素溶液ph至5.5；3、按10-12g/kg木聚糖的比例加入本發(fā)明實施例1-3任意所述復合酶，50-60℃作用6-12h；4、酶解反應結(jié)束后，升溫至80℃以上，保溫15min，滅活復合酶；5、將酶解后的溶液通過板框進行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。利用離子液相色譜測定上述獲得的低聚木糖溶液中的木五糖的含量，并計算木五糖的轉(zhuǎn)化率，具體結(jié)果見表1。木五糖轉(zhuǎn)化率＝木五糖含量/總木聚糖含量×100％。表1本發(fā)明所述復合酶對木五糖轉(zhuǎn)化率的影響復合酶添加量酶解條件木五糖含量木五糖轉(zhuǎn)化率實施例112g/kg木聚糖50℃酶解12h20.1g/l40.2％實施例210.8g/kg木聚糖60℃酶解6h20.6g/l41.2％實施例310g/kg木聚糖55℃酶解8h21.0g/l42.0％從表1的結(jié)果可以看出，利用本發(fā)明提供的復合酶處理粘膠纖維壓榨液制備得到的低聚木糖溶液中木五糖的含量得到顯著提高，木五糖的轉(zhuǎn)化率高達42％，取得了意料不到的效果。實施例5碳酸鈉的添加量對于木五糖轉(zhuǎn)化率的影響1、實驗設計取實施例4步驟1制得的木聚糖含量為50g/l的半纖維素溶液；調(diào)節(jié)半纖維素溶液的ph為5.5，按10g/kg木聚糖的比例分別加入下述復合酶樣品，55℃作用8h；；酶解反應結(jié)束后，升溫至80℃，保溫15min，滅活復合酶；將酶解后的溶液通過板框進行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。復合酶樣品配方：樣品1：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉0kg。樣品2：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉0.5kg。樣品3：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉1.0kg。樣品4：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉1.5kg。樣品5：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉2.0kg。樣品6：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉2.5kg。樣品7：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉3.0kg。樣品8：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉3.5kg。樣品9：木聚糖酶2kg，植酸酶0.5kg，甘露聚糖酶0.2kg，碳酸鈉4.0kg。2、結(jié)果分析利用離子液相色譜分別測定利用上述復合酶樣品制得的低聚木糖溶液中木二糖、木三糖、木四糖和木五糖的含量(g/l)，計算木五糖的轉(zhuǎn)化率。具體結(jié)果見表2。表2碳酸鈉的添加量對于木五糖轉(zhuǎn)化率的影響復合酶碳酸鈉木二糖木三糖木四糖木五糖木五糖轉(zhuǎn)化率樣品105.54.05.412.525％樣品20.5kg5.54.05.513.026％樣品31.0kg5.54.05.513.026％樣品41.5kg5.83.85.315.831.6％樣品52.0kg6.04.45.020.240.2％樣品62.5kg6.24.84.821.843.6％樣品73.0kg5.84.05.021.042.0％樣品83.5kg6.03.85.316.232.4％樣品94.0kg5.84.25.015.230.4％從表2的結(jié)果可以看出，與木二糖、木三糖和木四糖相比，碳酸鈉對木五糖的轉(zhuǎn)化率影響最為顯著。隨著復合酶制劑中碳酸鈉添加量的增加，利用該復合酶制劑制備得到的低聚木糖溶液中木五糖的轉(zhuǎn)化率緩慢提高，但當碳酸鈉在復合酶中的添加量達到2.0kg時，木五糖的轉(zhuǎn)化率得到大幅提升，超過40％，當碳酸鈉在復合酶中的添加量超過3.0kg時，木五糖的轉(zhuǎn)化率又開始迅速下降。從而說明，當碳酸鈉在復合酶中的添加量為2.0-3.0kg時，可以與所述復合酶中的木聚糖酶、植酸酶和甘露聚糖酶協(xié)同作用，促進木五糖的轉(zhuǎn)化，大幅提升木五糖的轉(zhuǎn)化率，取得了意料不到的技術(shù)效果。實施例6本發(fā)明制備得到的低聚木糖溶液在動物雙歧桿菌培養(yǎng)中的應用研究表明動物雙岐桿菌在代謝低聚木糖的過程中，在6-24小時時間段會快速消耗木四糖和木五糖，木二糖和木三糖會出現(xiàn)一定的累積。增加聚合度≧4的糖濃度,特別是木五糖的濃度可以有效提高菌體的生長速度，縮短發(fā)酵周期。申請人將實施例4制備得到的木五糖含量高于20g/l的低聚木糖溶液與市售低聚木糖產(chǎn)品(木五糖含量低于5g/l，)作為碳源培養(yǎng)動物雙歧桿菌。(1)培養(yǎng)基：基礎培養(yǎng)基(w/v)：蛋白胨0.5％；胰胨0.5％；牛肉浸膏0.5％；酵母粉1.0％；cac120.0008％；mgso40.0019％；kh2po40.0004％；nhaco30.04％；nacl0.008％。(2)培養(yǎng)條件：用20ml的螺紋管培養(yǎng)，在37℃條件下靜止培養(yǎng)0-48小時，每24小時測定雙歧桿菌的菌體濃度od600。具體結(jié)果見表3，表3低聚木糖對動物雙歧桿菌的增殖菌體濃度的影響。從表3的實驗結(jié)果可知，與市售低聚木糖產(chǎn)品相比，以本發(fā)明提供的木五糖高于20g/l的低聚木糖溶液為碳源培養(yǎng)動物雙歧桿菌，能顯著增加動物雙岐桿菌的菌體濃度，24小時和48小時時菌體濃度分別提高了52％和50.5％，從而說明，提高低聚木糖中木五糖的含量能有效促進動物雙歧桿菌的增殖，縮短菌體培養(yǎng)周期，從而降低生產(chǎn)成本，增加經(jīng)濟效益，效果顯著。以上所述僅為發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12