本發(fā)明屬于基因工程和生物酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物源抗氧化蛋白酶的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物源抗氧化蛋白酶是一類(lèi)廣泛存在于自然界微生物體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)具有酶學(xué)活性，具有維持生物體內(nèi)氧化還原平衡、調(diào)控生物信號(hào)傳導(dǎo)、dna及蛋白質(zhì)損傷修復(fù)等多種功能。由于其來(lái)源豐富，容易提純，分子量小，功能簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，使得該蛋白酶在酶學(xué)研究中較早發(fā)展起來(lái)，同時(shí)也具有廣泛的藥物制備的參考及應(yīng)用價(jià)值。目前，在研究抗氧化酶的過(guò)程中，微生物源抗氧化蛋白酶具有強(qiáng)大的抗氧化作用，具有維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)、抗衰老以及腸道保護(hù)生物學(xué)效應(yīng)等作用。
現(xiàn)有的抗氧化蛋白酶多數(shù)從植物中提取，產(chǎn)量少。因此，研發(fā)人員把研究目標(biāo)集中在微生物菌種的篩選上，希望獲得微生物源的抗氧化蛋白酶。但是微生物種類(lèi)繁多，到底哪種抗氧化蛋白酶更好，不得而知，而且需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。本發(fā)明中的微生物源抗氧化蛋白酶制備技術(shù)采用基因工程表達(dá)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)，克服了植物源抗氧化蛋白酶含量少的缺點(diǎn)，可以批量發(fā)酵；同時(shí)本發(fā)明中的抗氧化蛋白酶為可溶性表達(dá)形式避免了其他微生物源蛋白酶為包涵體的缺點(diǎn)。本發(fā)明中的抗氧化蛋白酶已在發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了測(cè)試，具有抗氧化活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種微生物源抗氧化蛋白酶的制備和應(yīng)用。
為解決技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的解決方案是：
提供一種微生物源抗氧化蛋白酶，該蛋白酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述述微生物源抗氧化蛋白酶在制備用于抑制機(jī)體衰老和細(xì)胞凋亡的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述蛋白酶的制備方法，其特征在于，是以單核細(xì)胞增多性李斯特菌野生株的基因組dna為模版進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，獲得含有抗氧化蛋白酶目的基因且該基因含有酶切位點(diǎn)的目的片段；將目的基因與載體以限制性?xún)?nèi)切酶ndei和xhoi進(jìn)行雙酶切，然后將目的基因連接入表達(dá)載體pet30a(+)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞e.colidh5a感受態(tài)細(xì)胞中，在kana/lb固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；將陽(yáng)性克隆重組菌質(zhì)粒入感受態(tài)細(xì)胞e.colirosetta中，取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)超聲破碎、咪唑洗脫和鎳離子樹(shù)脂柱親和層析，分離純化得到重組蛋白，即所述微生物源抗氧化蛋白酶。
本發(fā)明中，所述制備方法的具體步驟包括：
(1)采用特異性引物對(duì)李斯特菌野生株的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增同時(shí)在引物上設(shè)計(jì)ndei和xhoi的酶切位點(diǎn)，所述引物的序列序列分別為：
上游引物：5’-tttcatatggtaaaagaaattacagatgcaacatttg-3’；
下游引物：5’-ccgctcgagaacgtatttgttgatgacttcatccagttc-3’；
所用pcr擴(kuò)增體系為：kod-plus-neo1μl，10×pcrbufferforkod-plus-neo5μl，mgso43μl，dntps5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板2μl，加ddh2o至50μl；pcr擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性30s，98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸30s，循環(huán)25～35次，最后68℃延伸8～12min；
(2)以限制性?xún)?nèi)切酶ndei和xhoi分別雙酶切pet30a(+)質(zhì)粒和擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳后回收目的產(chǎn)物，然后用t4dna連接酶16℃過(guò)夜連接，將目的基因與載體連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞e.colidh5a中，涂布在kana/lb瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，獲得重組菌株；在kana/lb瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，卡那霉素濃度為50mg/l，瓊脂濃度為1.5％；
(3)挑取重組菌株單克隆至5mlkana/lb瓊脂液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜；培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，測(cè)序；
(4)將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colirosetta中，過(guò)夜培養(yǎng)；然后挑取重組菌株單克隆至500mlkana/lb培養(yǎng)基中，在37℃、150r/min下培養(yǎng)；待培養(yǎng)至od600nm＝0.6時(shí)，加入終濃度為0.6mm的iptg，在30℃、100～300r/min誘導(dǎo)8h，得到蛋白誘導(dǎo)表達(dá)菌液；將菌液3700r/min離心15min，棄上清，收集沉淀；然后加入30ml、50mm的pbs，用細(xì)胞超聲破碎儀將細(xì)胞裂解；離心3700r/min離心15min收集上清，上清液與鎳柱結(jié)合4℃、4h，然后過(guò)柱純化；使用30ml、50mm咪唑洗脫雜蛋白，再以6-8ml、400mm咪唑洗脫目的蛋白，最終得到純化的活性蛋白，即所述微生物源抗氧化蛋白酶。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明中的微生物源抗氧化蛋白酶屬于硫氧還蛋白(trx)家族，來(lái)源于單核細(xì)胞增多性李斯特菌。該蛋白酶是一種重要的氧化還原平衡調(diào)節(jié)蛋白酶，在生物體氧化脅迫與損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，因此在抗衰老領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。trx一方面通過(guò)與trxr和nadph組成trx系統(tǒng)，對(duì)機(jī)體內(nèi)氧化損傷蛋白質(zhì)進(jìn)行還原性修復(fù)，
并對(duì)機(jī)體內(nèi)其它氧化還原系統(tǒng)(如：還原型谷胱甘肽)進(jìn)行調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。另一方面trx可作為細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ros)清除劑。ros是引起細(xì)胞凋亡和衰老的關(guān)鍵因素，因此本發(fā)明中的抗氧化蛋白酶可通過(guò)對(duì)ask1和nf-κb等因子的結(jié)合與調(diào)控，抑制機(jī)體的衰老和細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞能夠進(jìn)行損傷修復(fù)并增殖，延緩細(xì)胞的衰老與凋亡，因此它也是腫瘤與癌癥治療的重要靶點(diǎn)之一。
2、該方法構(gòu)建的重組菌并能高效且迅速地表達(dá)出具有活性的蛋白，目的蛋白產(chǎn)量高且該蛋白具有很高的抗氧化酶活性，為該蛋白酶在工業(yè)化生產(chǎn)、醫(yī)藥保健和抗衰老化妝品成分的創(chuàng)新中提供了更好的技術(shù)支撐，具有較高的研究及潛在的應(yīng)用價(jià)值。
3、該微生物源抗氧化蛋白酶的物理特征特征為可溶性形式，且保留天然活性，因而具備廣泛應(yīng)用場(chǎng)景。
附圖說(shuō)明
圖1為重組蛋白在大腸桿菌e.colirosetta的誘導(dǎo)表達(dá)及純化。
圖示中m為蛋白marker，1、2、3為純化的重組蛋白。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋?zhuān)景l(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。
1、重組表達(dá)菌的構(gòu)建
(1)采用特異的引物(seqidno.2和seqidno.3)對(duì)李斯特菌野生株(如：egde參考菌種或atcc10403s標(biāo)準(zhǔn)菌株)的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的同時(shí)在引物上設(shè)計(jì)ndei和xhoi的酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增引物為：
上游引物：5’-tttcatatggtaaaagaaattacagatgcaacatttg-3’
下游引物：5’-ccgctcgagaacgtatttgttgatgacttcatccagttc-3’
pcr擴(kuò)增體系為：kod-plus-neo1μl，10×pcrbufferforkod-plus-neo5μl，mgso43μl，dntps5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板2μl，加ddh2o至50μl。pcr擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性30s，98℃變性10s，60℃退火30s，68℃延伸30s，循環(huán)25～35次，最后68℃延伸8～12min。
(2)以限制性?xún)?nèi)切酶ndei和xhoi分別雙酶切pet30a(+)質(zhì)粒和擴(kuò)增產(chǎn)物，1％電泳后回收目的產(chǎn)物。然后用t4dna連接酶16℃過(guò)夜連接，將目的基因與載體連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞e.colidh5a中，涂布在kana/lb瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基上，37℃靜置，過(guò)夜培養(yǎng)。在kana/lb瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，卡那霉素濃度為50mg/l，瓊脂濃度為2.0％。對(duì)重組菌株用pcr、雙酶切質(zhì)粒和測(cè)序等方法進(jìn)行鑒定。
(3)將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞e.colirosetta中，獲得重組蛋白表達(dá)菌株。
2、重組蛋白的表達(dá)及純化
挑取重組菌株單克隆至5ml液體kana/lb培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后取1ml菌液轉(zhuǎn)接入500mlkana/lb培養(yǎng)基中，在37℃，150r/min下發(fā)酵培養(yǎng)。待培養(yǎng)至od600nm＝0.6時(shí)，加入終濃度為0.6mm的iptg，30℃，100～300r/min誘導(dǎo)8h，得到蛋白誘導(dǎo)表達(dá)菌液。將菌液3700r/min離心15min，棄上清，收集沉淀后加入30ml、50mm的pbs，用細(xì)胞超聲破碎儀將細(xì)胞裂解，離心3700r/min離心15min收集上清，上清液與鎳柱結(jié)合4℃，4h，然后過(guò)柱純化。使用30ml，50mm咪唑洗脫雜蛋白，6-8ml，400mm咪唑洗脫目的蛋白，最終得到純化的活性蛋白(即微生物源抗氧化蛋白酶)?；钚缘鞍椎募兌扔胹ds-page方法檢測(cè)。
初始lb培養(yǎng)基，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，包括0.9～1.6％的胰蛋白胨，0.8～1.4％的氯化鈉，0.5～0.7％的酵母提取物，余量為去離子水。
3、蛋白酶活性測(cè)定
經(jīng)測(cè)序，抗氧化蛋白酶的氨基酸序列如下：(1-103aa)
mvkeitdatfeqetseglvltdfwatwcgpcrmvapvleeiqeergealkivkmdvdenpetpgsfgvmsiptllikkdgevvetiigyrpkeeldevinkyv
該氨基酸序列的三聯(lián)密碼子格式如seqidno.1所示。
抗氧化蛋白酶的還原酶酶活性采用還原氧化態(tài)胰島素的方法進(jìn)行。
具體方法是：在96孔板中，采用200μl反應(yīng)體系，分別加入終濃度為10mmpbs溶液，10μm純化的抗氧化蛋白酶，0.15mm胰島素，2mmedta，1mmdtt，利用酶標(biāo)儀在od650nm處檢測(cè)吸光度值，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀讀數(shù)間隔為5min，連續(xù)讀30分鐘。經(jīng)反復(fù)測(cè)定獲知，發(fā)明中的抗氧化蛋白酶利用米氏方程獲得酶活動(dòng)力學(xué)參數(shù)km、vmax和kcat/km值分別為9.9μm、39.3μm/min和7.94×103min-1m-1。這說(shuō)明本發(fā)明中的抗氧化蛋白酶具有強(qiáng)還原酶活性，符合經(jīng)典的米氏方程酶學(xué)活性特征，即具有抗氧化活性。
本發(fā)明所述微生物源抗氧化蛋白酶可用于制備用于抑制機(jī)體衰老和細(xì)胞凋亡的藥物或化妝品。在化妝品或藥品中，微生物源抗氧化蛋白酶的添加終濃度為10μm，發(fā)揮活性時(shí)應(yīng)以液體形式呈現(xiàn)，建議外用。其作用原理是：該抗氧化蛋白酶可以修復(fù)因紫外線、氧化物或衰老因素造成的機(jī)體細(xì)胞內(nèi)二硫鍵的損傷，可以將已被氧化的二硫鍵重新還原成還原態(tài)的二硫鍵，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白的正常生理功能。
<110>浙江農(nóng)林大學(xué)
<120>一種微生物源抗氧化蛋白酶的制備和應(yīng)用
<160>3
seqidno：1
<210>1
<211>111
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>微生物源抗氧化蛋白酶
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<223>用于對(duì)李斯特菌野生株的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增的上游引物
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