本發(fā)明涉及一種在生理ph條件下有活力的草酸氧化酶基因及其編碼的蛋白與應用，尤其涉及該草酸氧化酶在用于制備降低草酸過多癥疾病病人血液或尿液中草酸濃度的藥物中的應用，屬基因工程技術領域。

背景技術：

泌尿系結石疾病是一種全球范圍內(nèi)的重大健康疾病，絕大多數(shù)泌尿系結石由草酸鈣或草酸鈣與磷酸鈣成分組成。許多疾病均與人體內(nèi)的草酸量過高有關，比如原發(fā)性高草酸尿癥、第二高草酸尿癥、孤獨癥、外陰痛、草酸過多引起的晚期腎結石疾病、心臟傳導障礙、克羅恩氏癥、炎癥性腸病、結腸炎、泌尿性結石、哮喘、慢性阻塞性肺病、纖維肌痛、zellweger綜合征等，以及其他慢性疾病。原發(fā)性高草酸尿癥(primaryhyperoxaluria，ph)包括i型，ii型和iii型，都是極為罕見的基因突變導致的乙醛酸鹽代謝異常遺傳疾病，該疾病因肝臟中特定代謝酶的缺失導致草酸在體內(nèi)的過度積累：i型疾病因乙醛酸鹽氨基轉(zhuǎn)移酶缺失導致，ii型疾病因乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶缺失導致，iii型疾病因肝臟特有的線粒體酶4-羥基-2-氧-戊二醛縮酶缺失導致，還有一些非以上三種類型的原發(fā)性高草酸尿疾病，原因正在進一步的研究中。原發(fā)性高草酸尿癥疾病是一種非常嚴重的遺傳病，晚期患者體內(nèi)的血液中草酸濃度可達100μmol/l，遠高于正常人草酸水平(<5μmol/l)，伴隨著患者腎功能的衰竭，過飽和的草酸鈣會在腎臟、甲狀腺、心肌層、骨骼、皮膚、血管及眼中沉積形成結石，損壞人體重要器官，危及生命。第二高草酸尿癥(secondaryhyperoxaluria，sh)是一種食源性草酸吸收過度或食入大量草酸前體導致的疾病，原因包括胃腸道疾病引起的，如腸炎、囊胞性纖維癥、短腸綜合征、或富含草酸食物或草酸前體飲食偏好。第二高草酸尿癥是一種非常常見的疾病，其危害沒有原發(fā)性高草酸尿癥嚴重，但是高血草酸及尿草酸濃度仍然會讓患者患上草酸過多引起的慢性疾病或晚期尿路系統(tǒng)衰竭。

人體通過食源性吸收的草酸占泌尿草酸總量的10～70％不等，食物中的草酸可以通過整個胃腸道消化系統(tǒng)吸收，包括胃，小腸和大腸，因此在消化吸收系統(tǒng)器官中去除食物中的草酸可以有效的防止草酸被胃腸道吸收。業(yè)界公認，草酸鈣濃度的過高會導致結石的形成，因此，降低草酸的濃度有助于降低結石形成的風險。

需要長期進行透析的慢性腎功能衰竭(crf)和腎功能衰竭晚期(esrf)病人也很容易導致草酸過多癥。該類病人的腎功能缺失導致草酸無法被有效清除，同時透析過程中需要注射維生素c作為抗氧化藥物，而其在人體內(nèi)會被代謝轉(zhuǎn)化為草酸。此類病人體內(nèi)血液中草酸一般在30-90μmol/l。2006年數(shù)據(jù)顯示，美國每年有34萬人需要透析，該人數(shù)還在一直上升，因此，該類病人也處于患草酸過多疾病的風險之中。

zellweger綜合征(zsd)病人也與草酸過多有很高的關聯(lián)性(83％)，zsd是一種過氧化物酶缺失導致的疾病，雖然zsd病人草酸代謝異常的機理尚不清楚，但是zsd病人體內(nèi)的血草酸濃度與原發(fā)性高草酸尿癥病人是差不多的。

迄今為止幾乎沒有有效的治療措施可以顯著的降低草酸過多癥患者形成結石的風險，其中最主要被使用的一些方法僅僅是通過口服草酸降解酶或草酸降解細菌來限制食物中草酸的吸收。然而，這些方法都會遇到一個共同的挑戰(zhàn)，那就是胃環(huán)境中的強酸性加上高活力的胃蛋白酶會降解草酸降解酶蛋白，腸道中的胰蛋白酶和糜蛋白酶也會降解草酸降解酶。而且，大多數(shù)已知的草酸降解酶的最適ph值均為弱酸性，所以在中性偏堿的腸道中的無活力或活力很低?？诜菟峤到饩瑯佑龅轿傅膹娝岘h(huán)境和腸道的蛋白酶解的挑戰(zhàn)，無法形成優(yōu)勢菌群發(fā)揮降草酸作用。

自然界中主要有兩種草酸降解酶：草酸脫羧酶和草酸氧化酶(www.brenda-enzymes.org/)，然而并沒有發(fā)現(xiàn)一種草酸脫羧酶在生理環(huán)境(ph7.4)有降解草酸活力。第一次被明確驗證有草酸氧化酶活力的蛋白來自于大麥，其在大麥萌發(fā)過程中起重要作用，故又被稱為萌發(fā)蛋白(germinprotein)。所有文獻中曾報道的萌發(fā)蛋白類似的(germ-like)草酸氧化酶，其均在酸性條件下具有降解草酸的活力。有文章(biochem.j.,1962,85,33)報道三角梅葉片在ph7.4條件下有草酸氧化酶活力，但是其提取溶液沒有草酸氧化酶活力。報道的在ph>7下具有活力的草酸氧化酶，其氨基酸序列未知，wo2011/066282專利描述了一種草酸降解酶來自于真菌，其專利實施例5中的酶并沒有被純化出來，也沒有任何序列信息，本專利發(fā)明人也曾嘗試純化該酶，但沒有成功。makotok等人也曾發(fā)表過一篇文章(journaloftheinstituteofbrewing,vol115,2009,232-237)，文章中說其來自于一種大麥種子和大麥芽的草酸氧化酶在中性ph下有活力。但是本專利發(fā)明人提取過相同種屬的大麥中的草酸氧化酶，發(fā)現(xiàn)其在ph7.4并無草酸氧化酶活力。因此，尋找在生理ph條件下有活力的草酸氧化酶，并獲得其氨基酸序列，實現(xiàn)基因工程重組表達，工業(yè)化生產(chǎn)，利用其降低人體中的草酸含量的治療措施仍然是非常必要的。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術中的不足，本申請篩選了上千種植物樣本，測試其在生理ph條件(ph7.4)下是否有草酸氧化酶活力，篩選到甜菜莖，香蕉皮，三角梅，夜來香，紫茉莉，守宮木，麻風樹等候選物種，然后通過基因克隆手段克隆到編碼草酸氧化酶的基因序列，通過基因工程重組表達系統(tǒng)(大腸桿菌，畢赤酵母，煙草及豌豆)重組表達，驗證基因序列的正確性以及其草酸氧化酶的活力性質(zhì)。

本發(fā)明提供了一組在ph7.4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸鹽，其基因序列與seqidno.1-4中任意一項至少有50％的一致性。

本發(fā)明提供了一組在ph7.4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸鹽，其基因序列與seqidno.1-4中任意一項至少有55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的一致性。

本發(fā)明的另一個目的是提供一組在ph7.4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸鹽，其氨基酸序列與seqidno.5-8中任意一項至少有50％的一致性。

本發(fā)明還提供一組在ph7.4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸鹽，其氨基酸序列與seqidno.5-8中任意一項有至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的一致性。

以上草酸氧化酶可以從甜菜莖，香蕉皮，三角梅，夜來香，紫茉莉，守宮木，麻風樹等植物物種中提取得到。

本發(fā)明還提供一組在ph7.4條件下有活力的草酸氧化酶，可以降解草酸或草酸鹽，是用不同分子量的聚乙二醇修飾的草酸氧化酶。

所述的聚乙二醇的分子量是2kd,5kd,10kd,20kd,4臂-20kd,30kd,40kd或4臂-40kd中的任意一種。

本發(fā)明提供一種包含草酸氧化酶基因的表達載體，其中草酸氧化酶基因序列與seqidno.1-4中任意一項至少有50％的一致性。

本發(fā)明提供一種包含草酸氧化酶基因的表達載體，其中草酸氧化酶基因序列與seqidno.1-4中任意一項至少有55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％，100％的一致性。

本發(fā)明提供一種重組表達菌種，包含以上表達載體，且能產(chǎn)生草酸氧化酶。

本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因植物株，部分植物(包括葉片，根，花等)或植物細胞，其轉(zhuǎn)化有含以上草酸氧化酶基因序列的表達載體。

本發(fā)明還提供了該草酸氧化酶在制備降低草酸過多癥疾病病人草酸濃度的藥物中的應用。所述的草酸過多癥疾病包括原發(fā)性高草酸尿癥，二型高草酸尿癥，zellweger癥，或慢性泌尿系統(tǒng)損壞性疾病等。

由于該草酸氧化酶在ph7.4條件下有酶活力，因此，含有草酸氧化酶的藥物可以制成針劑或經(jīng)腸溶材料包埋。

本發(fā)明提供的一組草酸氧化酶，它在ph7.4條件下的比活力不低于其最大比活力的20％，而且其是至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一被公開的且被驗證了的在ph7.4或ph7.0～8.0有活力的草酸氧化酶。該草酸氧化酶的發(fā)現(xiàn)為研發(fā)一種適用于治療草酸過多疾病的重組草酸氧化酶藥物提供了可能性。本發(fā)明也可以使用草酸氧化酶制備預防草酸過多疾病的藥物。

附圖說明

圖1為畢赤酵母表達載體zα-5102圖譜。

圖2為畢赤酵母表達載體gapzα-5102圖譜。

圖3為畢赤酵母表達載體zα-5601圖譜。

圖4為畢赤酵母表達載體gapzα-5601圖譜。

圖5為畢赤酵母表達載體zα-30640圖譜。

圖6為sds-page分析畢赤酵母x33中草酸氧化酶zα-5102的表達。

圖7為sds-page分析畢赤酵母x33中草酸氧化酶zα-5601的表達。

圖8為sds-page分析畢赤酵母x33中草酸氧化酶zα-30640的表達。

圖9為sds-page分析畢赤酵母x33中草酸氧化酶gapzα-5601的表達。

圖10為植物表達載體圖譜。

圖11為煙草葉片中草酸氧化酶活力顯色。

圖12為草酸氧化酶活力檢測，ph7.4。

左側(cè)試管中含有2mm草酸，右側(cè)試管中不含草酸。

圖13為不同分子量peg修飾的草酸氧化酶在大鼠模型中對血草酸的影響結果圖。

圖14為不同分子量peg修飾的草酸氧化酶在大鼠模型中對尿草酸的影響結果圖。

圖15為草酸氧化酶b5102和不同分子量peg修飾的b5102樣品免疫sd大鼠，其抗體效價結果圖。

具體實施方式

下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

【實施例1】產(chǎn)草酸氧化酶植物的篩選與活力測試

本專利發(fā)明人從廣西藥用植物園，昆明植物園，武漢植物園及海南亞熱帶植物園采集了千余種植物樣品，進行草酸氧化酶的篩選實驗。

產(chǎn)草酸氧化酶植物篩選時，樣品先經(jīng)過處理，處理過程如下：將一定量的植物樣品(葉，根，莖或花)用剪刀剪碎，放入定量的盛有純水的燒杯中，用高速均質(zhì)機勻漿為懸濁液(顆粒<100μm)，勻漿液經(jīng)離心后分為可溶部分(上清液)與不可溶部分(沉淀)，不可溶部分用純水重懸，兩者分別用來測降解草酸的活力。

草酸氧化酶活力測試方法有以下兩種：

(1)hplc方法：取40μl樣品與360μl的12mm的草酸溶液(用naoh調(diào)節(jié)至ph7.4)混勻后，37℃反應48小時，反應液加終止液(100μl1.5m硫酸溶液)終止反應。反應液經(jīng)高速離心去除沉淀，上清液過0.4μm膜后用hplc測定草酸含量。一個酶活單位定義為在上述體系中每分鐘降低1微摩爾草酸所需要的酶量。

(2)顯色法測草酸氧化酶活力：

20μl樣品溶液與580μl活力顯色液(含有10mm草酸；4mm3,5-二氯-2-羥基苯磺酸鈉(dhbs)；2u的辣根過氧化物酶；1mm的4-氨基安替比林(4-aa)；50mm的磷酸緩沖液，ph6.0或7.4)，37℃反應30min，用酶標儀監(jiān)測od492的吸光度。一個酶活單位定義為在上述反應體系中每分鐘降低1微摩爾草酸所需要的酶量。

經(jīng)過篩選，我們發(fā)現(xiàn)香蕉皮(bananapeel)，甜菜莖(beetstem)，三角梅葉片(bougainvilleaspectabilisleaves)，紫茉莉嫩芽(mirabilisjalapayoungleaf)，夜來香葉片(telosmacordatum(brum.f.))，麻風樹葉片(jatrophacarcasl.leaf)，守宮木(sauropusandrogynus(l.)leaf)等植物樣品在ph7.4的環(huán)境下有明確的草酸氧化酶活力。

【實施例2】香蕉和甜菜草酸氧化酶基因的克隆

(1)在甜菜莖及香蕉皮樣品中提取草酸氧化酶粗品

稱取一定量的甜菜莖及香蕉皮樣品，切碎后放入盛有純水的燒杯中，經(jīng)高速勻漿機勻漿為小于100μm的顆粒，離心去除上清液(無活力或極低的草酸氧化酶活力)，沉淀用含表面活性劑(1％硫磺酸脫氧膽酸鈉)及蔗糖(50％w/v)的緩沖溶液(2mmpbs，ph7.0)重懸后，4℃抽提2～5天，草酸氧化酶的粗提物經(jīng)q-sepharose色譜柱純化，收集洗脫樣品峰，后經(jīng)透析除去樣品中的表面活性劑及鹽成分。草酸氧化酶樣品經(jīng)native-page分離后仍具有草酸氧化酶活性，通過native-page膠的草酸氧化酶活力顯色后鑒定樣品洗脫峰及草酸氧化酶條帶，經(jīng)sds-page膠分離后，草酸氧化酶條帶被切取后委托中國農(nóng)業(yè)大學分析測試中心做氮端(n-terminal)氨基酸測序及ms-ms質(zhì)譜序列分析。

(2)基因組序列檢索

根據(jù)n-terminal測序結果，將氮端的蛋白序列在已公布的香蕉及甜菜的轉(zhuǎn)錄基因組草圖中進行t-blastn檢索，得到候選的基因序列，然后與質(zhì)譜的序列分析結果進行比對，確定目標草酸氧化酶基因序列。

(3)基因克隆

根據(jù)已確定的草酸氧化酶基因dna序列設計特異引物(表1)，在香蕉及甜菜的cdna文庫中進行pcr擴增，將pcr產(chǎn)物進行純化回收后測序鑒定是否克隆到草酸氧化酶基因。本實驗一共克隆到來自甜菜的b5100，b5102，b5601，來自香蕉的m30640等草酸氧化酶候選基因(如seqidno.1-4所示)。同時也克隆到了多條germin-like基因序列：108，122，303，1013(如seqidno.9-12所示)。

表1草酸氧化酶克隆引物

pcr體系(50μl)：

pcr程序：

【實施例3】大腸桿菌系統(tǒng)表達重組草酸氧化酶

(1)質(zhì)粒的構建

將草酸氧化酶(oxox)b5100，b5102，b5601，m30640基因克隆構建入pat載體(該載體是來源于pet-32a載體)，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入e.coliorigamib感受態(tài)細胞。

(2)搖瓶小量表達

將b5100，b5102，b5601，m30640的甘油菌種涂布于lb瓊脂糖平板(含100μg/ml氨芐抗生素),37℃倒置培養(yǎng)過夜至有單克隆菌斑出現(xiàn)。挑取單菌落接種于200ml搖瓶培養(yǎng)基中(含50mllb培養(yǎng)基，100μg/ml氨芐抗生素)，220rpm，37℃培養(yǎng)，od600至0.6～0.8，加入mncl2終濃度為1mm，iptg終濃度為0.6mm進行誘導表達，誘導5h后，9500g離心15min收集菌體，菌體重懸于50mm精氨酸溶液中，冰浴超聲破碎30min，并用50mm精氨酸重懸洗滌2次，包涵體中有80％為草酸氧化酶蛋白。菌體產(chǎn)量在該發(fā)酵條件下可達0.2～0.6g/l。

(3)7l發(fā)酵罐大量表達

將b5100，b5102，b5601，m30640基因單克隆菌斑接入500ml搖瓶(含200ml的lb培養(yǎng)基及100μg/ml的氨芐抗生素)，過夜培養(yǎng)，作為種子液。將種子液按0.5％的接種量接入7l的發(fā)酵罐(含3.5l的基礎培養(yǎng)基：甘油12g/l；酵母粉12g/l)，200rpm，37℃培養(yǎng)，10％的氨水調(diào)節(jié)ph穩(wěn)定在6.85，約8h后，開始勻速補加補料培養(yǎng)基(30g/l甘油，60g/l酵母粉)，當od600達到20時，添加iptg至終濃度為0.8mm，繼續(xù)誘導20h，放罐收集菌體。菌體產(chǎn)量在該發(fā)酵條件下可達1～5g/l。

(4)包涵體蛋白洗滌與復性

包涵體洗滌：

大腸桿菌菌體細胞用washingbuffer(50mmtris，50mmnacl，5mmedta，5mmdtt，1％tritonx-100，2m尿素，用鹽酸調(diào)ph8.0)重懸，然后按照1：1000加入核酸酶(benzonase，含終濃度為0.5mm的mgcl2)，攪拌15min，菌液變稀后進行高壓均質(zhì),高壓均質(zhì)的條件為1100bar，反復破碎4次。將細胞破碎液進行8000g離心10min，棄上清，收集包涵體沉淀。包涵體用適量的washbuffer充分重懸，攪拌約30min，8000g離心10min，棄上清收集沉淀，反復洗滌三次后用純水重懸包涵體，充分重懸后8000g離心10min，得到包涵體。sds-page電泳分析蛋白純度，是否能夠到達復性要求(純度>80％)。

包涵體復性：

草酸氧化酶包涵體采用快速稀釋方法復性：洗滌合格的包涵體溶解于8m尿素溶液中，測定蛋白濃度后，1ml/min勻速滴加到預冷的復性溶液中快速稀釋復性，蛋白終濃度為100μg/ml，磁力攪拌混勻后置于4℃復性24h。復性溶液配方是以下所列任意一種：

1.20mmtris,300mmnacl,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,ph8.0

2.20mmtris,300mmnacl,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,400mmarginine,ph8.0

3.20mmtris,300mmnacl,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,100mmα-cyclodextrin,ph8.0

4.20mmtris,300mmnacl,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,2％β-cyclodextrin,ph8.0

5.20mmtris,300mmnacl,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,40％sucrose,ph8.0

6.20mmtris,300mmnacl,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,40％glucose,ph8.0

7.20mmtris,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,ph8.0

8.20mmtris,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,400mmarginine,ph8.0

9.20mmtris,1mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,50mmbetaine,ph8.0

10.20mmtris,1mmmncl2,50mmbetaine,ph8.0

11.20mmtris,0.5-5mmmncl2,1mmgsh/0.2mmgssg,50mmbetaine,ph8.0

12.20mmtris,1mmmncl2，1mmgsh/0.2mmgssg,50mmbetaine,ph4.0-10.0

13.20mmtris,1mmmncl2,50mmbetaine,0.05mm1-hexanol,50mmacetamide,300mmkcl,ph8.0

復性后蛋白經(jīng)phenylsepharose樹脂純化，活力可達0.1～15u/mg蛋白。

縮略詞：

1、gsh谷胱甘肽6、sucrose蔗糖

2、gssg氧化型谷胱甘肽7、glucose葡萄糖

3、arginine精氨酸8、betaine甜菜堿

4、α-cyclodextrinα-環(huán)糊精9、hexanol己醇

5、β-cyclodextrinβ-環(huán)糊精10、acetamide乙酰胺

【實施例4】畢赤酵母系統(tǒng)表達草酸氧化酶

(1)載體構建

將b5100，b5102，b5601，m30640基因通過xhoi和noti酶切位點克隆進ppiczαbandpgapzαa載體，構建的重組質(zhì)粒為zα-5102，gapzα-5102，zα-5601，gapzα-5601，zα-30640(圖1～5)。重組質(zhì)粒zα-5102，zα-30640，zα-5601用pmei(mssi)內(nèi)切酶進行線性化，gapza-b5102，gapzα-5601，gapzα-30640用blni(avrii)進行線性化。線性化后的載體通過電轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)化畢赤酵母x33菌種進行表達。

表2.構建ppiczαbandpgapzαa表達載體引物名稱及序列

pcr體系(50ul)：

pcr程序：

(2)蛋白表達

用ypds培養(yǎng)基(10g/l酵母粉，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，1m山梨醇，20g/l瓊脂，含100μg/lzeocin抗生素)平板篩選的陽性克隆，再用高濃度抗生素的ypds平板(1mg/mlzeocin)進行拷貝數(shù)的篩選，篩選到的高拷貝數(shù)的克隆子用搖瓶表達驗證。

篩選到的高拷貝的zα-5102,zα-30640,zα-5601的克隆子接入4ml的ypd培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)18～20h，按4％的接種量轉(zhuǎn)接500ml搖瓶(含50ml培養(yǎng)基)表達培養(yǎng)基bmgy(酵母粉1％(w/v),蛋白胨2％(w/v),100mm磷酸鉀緩沖液ph6.0,無氨基酵母氮源1.34％(w/v),甘油1％(w/v),生物素0.04％(w/v))，28℃，220rpm生長18～20h后，od600到達3.0～6.0，離心收集菌體后重懸于bmmy培養(yǎng)基(酵母粉1％(w/v),蛋白胨2％(w/v),100mm磷酸鉀緩沖液atph6.0,無氨基酵母氮源1.34％(w/v),1.0％(v/v)甲醇,生物素0.04％(w/v)，5mmmncl2)進行誘導表達。誘導表達溫度為28℃，每天補加甲醇至終濃度為1.0％，連續(xù)誘導90～120h。培養(yǎng)物經(jīng)9500g離心后取上清液用于顯色法測定草酸氧化酶活力及sds-page鑒定分析。

篩選到的高拷貝的gapza-b5102，gapzα-5601，gapzα-30640菌株，轉(zhuǎn)接于bypd培養(yǎng)基(10g/l酵母粉,20g/l蛋白胨,20g/l葡萄糖,生物素400μg/l,mncl25mmand100mm磷酸鉀緩沖液,ph6.0)，28℃，220rpm震蕩培養(yǎng)，48h后補加2％的葡萄糖，培養(yǎng)72h后，收集培養(yǎng)物離心，上清用于草酸氧化酶活力測定與sds-page分析。

結果顯示，四種草酸氧化酶(b5100，b5102，b5601，m30640)均可以在酵母系統(tǒng)中成功表達，產(chǎn)量為0.01～0.1mg/ml培養(yǎng)基，sds-page分析顯示目的條帶為24kd(圖6～9)，顯色法活力測試顯示其在ph7.4下均有草酸降解活力。

【實施例5】植物系統(tǒng)表達草酸氧化酶

(1)載體構建

將b5102，b5601，m30640基因通過pcr擴增引入xbai及kpni酶切位點，然后經(jīng)此兩個位點插入phte載體，得到phte-5601,phte-5102andphte-30640(圖10)。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)菌液pcr及內(nèi)切酶酶切驗證后用凍融復蘇法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌gv3101中。

表3構建植物表達載體引物名稱及序列

pcr體系(50μl)：

pcr程序：

(2)轉(zhuǎn)化煙草葉片進行瞬時表達

野生型本生煙草(n.benthamiana)于溫室中(16/8h光照/黑暗，25℃)培養(yǎng)5～8周。將轉(zhuǎn)化有b5102，b5601，m30640基因的農(nóng)桿菌菌種接種于3mllb培養(yǎng)基中(含25mg/l利福平及50mg/l的卡那霉素)，28℃，220rpm過夜培養(yǎng)至od600>1.2作為種子液。種子液按1:100比例接入2llb培養(yǎng)基(含25mg/l利福平,50mg/l卡那霉素and20μm乙酰丁香酮)，220rpm，28℃培養(yǎng)至od600為0.8～1.2(約18h)。5000rpm離心5min，去除上清，菌體沉淀用5倍體積的細菌重懸液(10mm2-(n-嗎啡啉)乙烷磺酸鈉(mes)ph5.5，10mmmgso4,和100mm乙酰丁香酮)，室溫培養(yǎng)4h。

將農(nóng)桿菌菌液通過1ml或3ml注射器注入煙草葉片中進行侵染，每個注射點一般約有7平方厘米的范圍會被侵染到，每個葉片需侵染幾個點。侵染后的植物置于溫室中生長7天左右，每天給予正常澆水和施肥。

(3)葉片草酸氧化酶活力測試實驗

侵染后培養(yǎng)7天的煙草葉片被收獲用于草酸氧化酶活力測試。測試方法為：侵染點周圍葉片(含陰性對照組)被切為直徑約1cm的圓盤狀，葉片經(jīng)高速勻漿后離心，上清和沉淀置于草酸氧化酶活力測定緩沖液中(40mm丁二酸，2.5mm草酸，5u/ml辣根過氧化物酶，0.6mg/ml4-氯-1-萘酚，60％(v/v)乙醇，ph5.0)，室溫孵育過夜顯色，上清中未現(xiàn)酶活力，沉淀中呈現(xiàn)草酸氧化酶活力。

同樣的侵染方法用于豌豆苗的侵染表達實驗。

煙草和豌豆兩種表達系統(tǒng)的結果顯示，用于表達的3個草酸氧化酶基因均具有草酸氧化酶活力(圖11，圖12)，其表達量約為0.01～5mg/g新鮮葉片，但是表達的絕大部分草酸氧化酶均存在于葉片的固體材料中，不可溶或不能有效溶出。

【實施例6】草酸氧化酶(大腸桿菌表達)在不同ph值條件下的活力測試

測試方法：

10μl草酸氧化酶溶液加入到190μl的活力測試溶液中(800mg/l4-氨基安替比林，4.8mm3,5-二氯-2-羥基苯磺酸鈉，10u/ml辣根過氧化物酶,5mm草酸,不同ph緩沖液)，混勻后置于37℃孵育10～60min，酶標儀讀取od492吸光值。

不同ph緩沖液組成：ph4.5～6.0緩沖液選用50mm的檸檬酸緩沖液，ph6.0～8.0選用50mm的磷酸鹽緩沖液。

測試結果顯示，草酸氧化酶5100最大活力為18.2u/mg，5102最大活力為19.5u/mg，5601最大活力為18.7u/mg，30640最大活力為14u/mg。為了方便比較，我們將四種酶在不同ph值下的活力換算為相對活力整理到表3中：

表3四種草酸氧化酶的在不同ph值下的相對比活力

【實施例7】草酸氧化酶的peg化修飾

草酸氧化酶包涵體洗滌：

大腸桿菌細胞用washbuffer(50mmtris，50mmnacl，5mmedta，5mmdtt，1％tritonx-100，2m尿素，用鹽酸調(diào)ph8.0)充分重懸(濃度約30g/l)，然后按照1：1000加入核酸酶(benzonase，終濃度為0.5mm的mgcl2)，攪拌15min，菌液變稀后進行高壓均質(zhì)。高壓均質(zhì)的條件為1100bar，反復破碎4次。細胞破碎液離心，8000g，10min，棄上清，收集沉淀。

包涵體清洗：包涵體用適量的washbuffer充分重懸，攪拌約30min，8000g離心10min，棄上清收集沉淀，反復洗滌三次后用純水重懸包涵體，充分重懸后8000g離心10min，得到的包涵體稱重，sds-page分析包涵體蛋白純度，是否能夠到達復性要求(純度>80％)。

q柱變性純化草酸氧化酶包涵體：

洗滌合格的包涵體(純度>80％)溶解于8m尿素溶液(20mmtris-hcl,8murea,ph8.0)，13000g，離心10min，棄去沉淀，上清上樣與平衡好的q柱(平衡液平衡5柱體積)，用洗脫液b(8murea,30g/lnacl,tris-hcl,ph8.0)洗脫6柱體積(cv)洗脫雜質(zhì)蛋白，換用洗脫液c(8murea,160g/lnacl,tris-hcl,ph8.0)洗脫，收集目標樣品峰，經(jīng)q柱純化，草酸氧化酶包涵體蛋白純度可達95％，純化后的樣品用超濾管濃縮至5mg/ml用于下一步的復性實驗。

草酸氧化酶包涵體蛋白復性

按實施例3中敘述進行操作。

phenylsepharose樹脂純化

上樣前，phenylsepharose柱用平衡液(10mmtris-hcl,500mmnacl,ph8.0)平衡5柱體積(cv)。在復性后的草酸氧化酶b5102中加入nacl至終濃度為0.5m，混勻后過0.45μm的濾膜澄清。澄清液上樣與平衡好的phenylsepharose柱子，用washbuffer(10mmtris-hcl,250mmnacl,ph8.0)洗滌1.5柱體積后換用洗脫液(10mmtris-hcl,20％isopropanol,ph7.0)洗脫。收集目標蛋白樣品峰，并加nacl至50mm進行鹽析沉淀，鹽析后樣品經(jīng)12000g離心10min，棄去上清，沉淀重新溶解于硼酸緩沖液(10mmna2b4o7～h3bo3,ph9.0)中，用于后期的peg化修飾。純化得到的樣品進行sds-page分析蛋白純度，草酸氧化酶活力測試評定復性效果。

草酸氧化酶的peg化修飾

溶解于硼酸鹽溶液的草酸氧化酶b5102蛋白用硼酸緩沖液調(diào)整濃度至2mg/ml。按b5102蛋白上的賴氨酸的摩爾數(shù)的10倍比列投入mpeg-sc(methoxypegsuccinimidylcarboxymethylester)修飾物到溫和磁力攪拌的b5102蛋白溶液中進行peg化修飾反應，混勻后28℃反應6h，加入與mpeg摩爾量相等的甘氨酸終止反應。我們試驗了2kd,5kd,10kd,20kd,4臂-20kd,30kd,40kdand4臂-40kd的peg修飾物。

peg修飾后的b5102樣品用分子排阻色譜(gehiloadsuperdex16/600gl,usa)進行分離純化。分子排阻色譜在上樣前用磷酸緩沖液(10mmk2hpo4～kh2po4,ph7.4)進行平衡5柱體積，按柱體積的5％進行上樣，然后再用磷酸緩沖液進行洗脫，流速1ml/min，收集樣品峰。

【實施例8】不同分子量peg修飾的草酸氧化酶在大鼠模型中降低血草酸及尿草酸實驗

30只5周齡sd雄性大鼠，體重約為130～150g，購買自湖北省動物實驗中心。大鼠飼養(yǎng)與獨立供氣籠(ivc)系統(tǒng)(溫度18～26℃，濕度40～70％)中適應一周后，隨機分入大鼠代謝籠中，分為5組，其中一組為對照組，四組為實驗組，每組6只大鼠。經(jīng)過適應期后，對照組和實驗組大鼠的血草酸和尿草酸均穩(wěn)定后，3種不同分子量peg(20k，30k，40k)修飾的草酸氧化酶b5102通過尾靜脈注射方式給藥到不同的實驗組大鼠，其中一組實驗組大鼠注射相同劑量體積的生理鹽水作為安慰劑組，藥物給藥劑量為0.2mg/天/次，連續(xù)給藥3天，對照組大鼠沒有做任何治療處理。對照組大鼠喂常規(guī)鼠糧和飲水，實驗組大鼠喂常規(guī)鼠糧和1％乙二醇飲水。給藥后，所有大鼠的血草酸和尿草酸每天進行檢測監(jiān)控。每天通過尾靜脈采集0.3ml血液用于測定血草酸濃度，新采集的血液經(jīng)5000g離心5min后收集血清，加入鹽酸調(diào)節(jié)ph至2.0～4.0，防止血清中維生素c(vc)轉(zhuǎn)化為草酸。尿液每12h(8:30am和8:30pm)收集一次，并用鹽酸調(diào)節(jié)ph至1.5～2.0，防止vc轉(zhuǎn)化為草酸。所有大鼠的血草酸和尿草酸均被檢測，穩(wěn)定后可以進行藥效實驗。

血草酸測定采用amplexred(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine)熒光酶標法檢測，檢測流程如下：

(1)鹽酸酸化后的血清樣品用10k超濾膜離心管5000g離心30min超濾去除血清蛋白，溫度4℃。

(2)將超濾液加入96孔熒光酶標板(全黑色不透明)中，每個樣品點6個平行孔，前3個孔加入草酸反應試劑(100mm檸檬酸緩沖液,ph5.4,10μmamplexred,1u/mlhrp,0.1u/ml草酸氧化酶)，后3個孔加入背景校準試劑(100mm檸檬酸緩沖液,ph5.4,10μmamplexred,1u/mlhrp)，震蕩混勻后25℃孵育30min。

(3)用熒光酶標儀(激發(fā)光波長：538nm，發(fā)射光波長：590nm)檢測熒光值。

(4)根據(jù)樣品凈熒光值(草酸測試組平均熒光值-背景校準組平均熒光值)與草酸標準曲線熒光值進行對照，計算樣品中的草酸濃度。

尿草酸濃度測定采用美國trinity公司的草酸測定試劑盒，具體操作步驟嚴格按照操作說明書執(zhí)行。

結果顯示，與安慰劑組相比，給藥組(20k，30k，40kpeg-oxox-b5102)可以降40％～50％血草酸濃度，同時降20％～40％的尿草酸濃度。(圖13和圖14)

【實施例9】peg-oxox免疫原性的測定

草酸氧化酶b5102和不同分子量peg(2k，5k，10k，20k，30k，40k)修飾的b5102樣品通過尾靜脈注射sd大鼠進行免疫原性評估。注射劑量為0.2mg/次，每周一次，持續(xù)免疫四周，第一次免疫前及免疫后不同時間點取血清樣品測定抗體效價，評估免疫原性(免疫前0天，第7天，第14天，第21天，第28天，第45天，第60天)。

測定流程如下：

(1)用包被液(50mmcarbonate/bicarbonatebuffer,ph9.6)稀釋peg修飾的b5102蛋白樣品至10μg/ml，點100μl至高吸附96孔酶標板孔中，用錫箔紙包裹置于4℃過夜包被。

(2)將包被板置于室溫，倒空液體并拍干殘留液體，用300μl洗滌液(1.5mmkh2po4；8.1mmna2hpo4·12h2o；136mmnacl；2.7mmkcl；0.05％tween-20)清洗兩次。

(3)每個孔中加300μl封閉液(1.5mmkh2po4；8.1mmna2hpo4·12h2o；136mmnacl；2.7mmkcl；5％脫脂奶粉)，孵育1h。

(4)倒空液體并拍干殘留液體，用300μl洗脫液清洗兩次。

(5)將血清樣品用洗滌液做梯度稀釋(50倍，100倍，200倍，400倍，800倍，……)混勻后加100μl至每酶標孔中，37℃孵育1h或室溫孵育3h。

(6)倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加滿洗滌液，倒空液體并拍干殘留液體，重復3次。

(7)用洗滌液將hrp偶聯(lián)的羊抗大鼠抗體(二抗)稀釋到最優(yōu)濃度(一般為1/5000～1/20000)，并向每個測試孔中加入100μl二抗，室溫孵育1h。

(8)倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加滿洗脫液，倒空液體并拍干殘留液體，重復3～5次。

(9)將6mltmb試劑a(0.5mmedta-na；5mm檸檬酸；10％甘油；0.04％tetramethylbenzidine)和6ml試劑b(165mm乙酸鈉；8.3mm檸檬酸；0.06％30％-h2o2)混勻。

(10)每個孔中加100μltmb顯色液，室溫孵育30min后，每個孔中加100μl終止反應液(2mh2so4)。

(11)酶標儀測定od450吸光值。

結果顯示，草酸氧化酶的抗體效價在第28天時達到最高值。第28天的結果(圖15)顯示草酸氧化酶經(jīng)peg修飾后，草酸氧化酶的抗體效價顯著下降，且隨著修飾peg分子量的增大，下降幅度更大，20k，30k，40kpeg修飾的草酸氧化酶幾乎檢測不到抗體。

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<110>武漢康復得生物科技股份有限公司

<120>一種在生理ph條件下有活力的草酸氧化酶及其應用

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