本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羰基還原酶突變體及其在不對(duì)稱還原羰基化合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手性醇是合成手性藥物的重要中間體，生物催化不對(duì)稱還原羰基化合物生產(chǎn)手性醇是制備手性醇的重要方法之一。生物催化通常以產(chǎn)羰基還原酶(或酮還原酶)的微生物或偶聯(lián)有輔酶再生系統(tǒng)的重組酶為生物催化劑。由于重組酶在反應(yīng)中幾乎無副反應(yīng)生成，因此目前大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中絕大部分都采用重組酶。然而，隨著生物催化劑定制需求的快速增長(zhǎng)，現(xiàn)有的基礎(chǔ)酶庫在數(shù)量和質(zhì)量上都遠(yuǎn)不能滿足需要。以蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶進(jìn)行分子改造是公認(rèn)的解決天然酶局限的有力工具，可目標(biāo)導(dǎo)向性地快速獲得酶學(xué)性能改良的突變體，以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)中工藝的要求。
近年來，隨著x射線晶體衍射技術(shù)和核磁共振對(duì)生物大分子的解析手段不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)的理性/半理性設(shè)計(jì)越來越成為體外改良蛋白質(zhì)性質(zhì)的重要手段，過去十年間人們成功地利用該技術(shù)改造了上百種蛋白質(zhì)的性質(zhì)(j.d.bloom，f.h.arnold.inthelightofdirectedevolution:pathwaysofadaptiveproteinevolution.pnas，2009，106：9995-10000)。野生型羰基還原酶chkred20能夠催化多種苯乙酮衍生物而生成光學(xué)純度較高的手性醇(t.-x.tang，y.liu，z.-l.wu.characterizationofarobustanti-prelogshort-chaindehydrogenase/reductasechkred20fromchryseobacteriumsp.ca49.jmolcatalb-enzym.2014，105：82-88；專利zl201310399109.2，zl201410103481.9)，但是對(duì)于鄰位取代的苯乙酮衍生物如1-(3-氯-2,6-二氟苯基)乙酮，1-(2-(三氟甲基)苯基)乙酮和1-(2,4-二甲基苯基)乙酮等卻難以轉(zhuǎn)化，這可能由于該酶在催化口袋的某些部位存在較大的位阻。應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)，進(jìn)一步改良chkred20的催化口袋，擴(kuò)展其底物譜，將推動(dòng)該酶在相關(guān)領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明利用基于結(jié)構(gòu)的半理性設(shè)計(jì)對(duì)來源于金黃桿菌ca49(chryseobacteriumsp.ca49)的羰基還原酶chkred20進(jìn)行分子改造，將一個(gè)或者多個(gè)氨基酸進(jìn)行替換，從而獲得底物譜更廣的突變體。
根據(jù)本領(lǐng)域公共知識(shí)，構(gòu)建的能表達(dá)上述突變體的載體、基因工程菌等也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明基于母本羰基還原酶chkred20的晶體結(jié)構(gòu)確定活性口袋，通過首輪丙氨酸掃描，篩選獲得2個(gè)有益突變子h145a和m201a。通過對(duì)145和201兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行飽和突變，篩選到催化活力大幅提高的突變體h145a/m201a。然后，將與his145和met201距離較近的位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，應(yīng)用高通量篩選方法篩選得到底物特異性改變較大的h145a/m201a/s153r和h145a/m201a/y188l。其中，h145a/m201a/y188l的立體選擇性也發(fā)生了反轉(zhuǎn)。在第三輪中，通過將底物口袋外部邊緣的氨基酸殘基進(jìn)行飽和突變，高通量篩選到底物特異性進(jìn)一步改變的突變子h145a/m201a/s153r/n39d/q97a。
本發(fā)明的具體實(shí)施方法為：
(1)第一輪篩選：對(duì)催化口袋進(jìn)行丙氨酸掃描
我們已經(jīng)公開了從金黃桿菌ca49中(chryseobacteriumsp.ca49，2012年11月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為no：cctccm2012484)克隆羰基還原酶chkred20的方法(吳中柳，劉艷等，一株金黃桿菌及其羰基還原酶用于阿瑞匹坦手性中間體生產(chǎn)，中國專利，cn103497911b)。羰基還原酶chkred20基因大小為750bp，編碼249個(gè)氨基酸，在ncbi的登錄號(hào)為kc342020。
基于對(duì)羰基還原酶chkred20晶體結(jié)構(gòu)分析(pdbid：5x8h)，我們嘗試對(duì)催化口袋中的9個(gè)氨基酸殘基(i144、h145、k160、p186、y188、i189、l194、l197、m201)進(jìn)行丙氨酸掃描，即將這些位點(diǎn)分別突變成丙氨酸，測(cè)定這些單點(diǎn)突變體對(duì)底物1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮的催化活性，結(jié)果表明h145a和m201a比野生型的活力高。通過對(duì)145位點(diǎn)和201位點(diǎn)進(jìn)行雙位點(diǎn)飽和突變，所獲得突變體h145a/m201a具有比單點(diǎn)突變體h145a和m201a更高的活力。
經(jīng)上述對(duì)催化口袋的丙氨酸掃描，我們獲得了3個(gè)對(duì)底物1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮催化提高的突變體，分別為h145a、m201a、h145a/m201a，其特征如下：
h145a：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)。
m201a：第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)。
h145a/m201a：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)。
(2)第二輪篩選：基于靶點(diǎn)的飽和突變文庫
以h145a/m201a為模板，選擇羰基還原酶chkred20的晶體結(jié)構(gòu)中距離145his和205met在
經(jīng)上述基于靶點(diǎn)的飽和突變文庫篩選，我們獲得了2個(gè)對(duì)底物1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮催化活力進(jìn)一步提高的突變體，分別為h145a/m201a/s153r和h145a/m201a/y188l，其特征如下：
h145a/m201a/s153r：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)、第153位的絲氨酸突變?yōu)榫彼?dna序列由tcc變?yōu)閏gg)。
h145a/m201a/y188l：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)、第188位的絡(luò)氨酸突變?yōu)榱涟彼?dna序列由tat變?yōu)閏tg)。
(3)第三輪篩選：底物口袋出入口相關(guān)位點(diǎn)的飽和突變
通過上述(1)和(2)輪的半理性設(shè)計(jì)，野生型chkred20對(duì)于鄰位取代的苯乙酮衍生物的底物限制已經(jīng)打破，由于底物催化口袋的出入口是控制底物進(jìn)出的第一道屏障，我們嘗試隨機(jī)化排列在口袋口的氨基酸殘基i38、n39、h42、q97、l152、l193、l194。由于h145a/m201a/s153r符合“anti-prelog”法則，我們將此作為第三輪飽和突變文庫構(gòu)建模板，并以1-(2，4-二甲基苯基)乙酮為底物進(jìn)行高通量篩選。有3個(gè)突變體被篩選出來：突變體h145a/m201a/s153r/q97a，h145a/m201a/s153r/l152m和h145a/m201a/s153r/n39d，它們對(duì)濃度15mm的1-(2，4-二甲基苯基)乙酮轉(zhuǎn)化率分別為96.4％、91.6％和92.0％，而對(duì)照h145a/m201a/s153r的轉(zhuǎn)化率為69.8％。在對(duì)這三個(gè)突變體隨機(jī)整合中，突變體h145a/m201a/s153r/q97a/n39d對(duì)1-(2，4-二甲基苯基)乙酮的轉(zhuǎn)化活力最高，可在18小時(shí)轉(zhuǎn)化93.9％的340mm(50g/l)的該底物，并且對(duì)2a-6a、15a、16a、17a、19a的催化活力也大幅度提高(如實(shí)例4.2中表7所示)。
經(jīng)上述對(duì)底物口袋出入口相關(guān)位點(diǎn)的飽和突變文庫進(jìn)行篩選，我們獲得了4個(gè)對(duì)底物催化活力進(jìn)一步提高的突變體，分別為h145a/m201a/s153r/q97a，h145a/m201a/s153r/l152m，h145a/m201a/s153r/n39d和h145a/m201a/s153r/q97a/n39d，其特征如下：
h145a/m201a/s153r/q97a：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna：序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)、第153位的絲氨酸突變?yōu)榫彼?dna序列由tcc變?yōu)閏gg)、第97位的谷氨酰胺突變?yōu)楸彼?dna序列由cag變?yōu)間cg)。
h145a/m201a/s153r/l152m：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)、第153位的絲氨酸突變?yōu)榫彼?dna序列由tcc變?yōu)閏gg)、第152位的亮氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?dna序列由gaa變?yōu)閍aa)。
h145a/m201a/s153r/n39d：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)、第153位的絲氨酸突變?yōu)榫彼?dna序列由ctt變?yōu)閍tg)、第39位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?dna序列由aat變?yōu)間at)。
h145a/m201a/s153r/q97a/n39d：第145位的組氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由cat變?yōu)間ct)、第201位的甲硫氨酸突變?yōu)楸彼?dna序列由atg變?yōu)間cg)、第153位的絲氨酸突變?yōu)榫彼?dna序列由tcc變?yōu)閏gg)、第97位的谷氨酰胺突變?yōu)楸彼?dna序列由cag變?yōu)間cg)、第39位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?dna序列由aat變?yōu)間at)。
通過對(duì)野生型chkred20的底物特異性和催化選擇性進(jìn)行改造，我們獲得了底物譜更廣且活力更高的突變體h145a/m201a/s153r/q97a/n39d，以及選擇性反轉(zhuǎn)的突變體h145a/m201a/y188l。
本發(fā)明有益效果：上述所有酶活力提高的突變子與母本相比，酶的催化范圍更廣，能催化更多的藥物中間體，催化底物的時(shí)空效率均有提高。其中突變子h145a/m201a/s153r/q97a/n39d能夠高效轉(zhuǎn)化底物1-(2,4-二甲基苯基)乙酮，1-(2-氟苯基)乙酮和1-(2-氯苯基)乙酮，1-(2-溴苯基)乙酮，2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮等底物，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1野生型及突變子粗酶液酶活力的測(cè)定
1.1粗酶液的制備
挑取單克隆至lb(含卡那霉素50μg/ml)培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，以1％的接種量轉(zhuǎn)接至tb(含卡那霉素50μg/ml)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3h，加入0.5mmiptg誘導(dǎo)后，30℃繼續(xù)培養(yǎng)至18h。菌液4℃、8000rpm離心收集菌，細(xì)胞均質(zhì)機(jī)破碎，離心取上清為粗酶液。
1.2粗酶活力的測(cè)定
粗酶活力測(cè)定反應(yīng)條件：該反應(yīng)體系由兩相組成，水相為磷酸鉀緩沖液(0.1m，ph8.0)中包含3g/l的粗酶液(總蛋白濃度))，0.2g/l的nad+；有機(jī)相為異丙醇和底物(底物溶解于異丙醇中)，占總反應(yīng)體積的45％。40℃、150rpm反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，等體積乙酸乙酯萃取，測(cè)定產(chǎn)物的生成量。
實(shí)施例2羰基還原酶chkred20催化口袋的丙氨酸掃描
2.1丙氨酸掃描突變體的構(gòu)建方法
基于對(duì)羰基還原酶chkred20晶體結(jié)構(gòu)的分析，我們嘗試對(duì)催化口袋中的9個(gè)氨基酸殘基(i144、h145、k160、p186、y188、i189、l194、l197、m201)進(jìn)行丙氨酸掃描，將這些位點(diǎn)定點(diǎn)突變?yōu)楸彼幔客蛔兙贼驶€原酶chkred20基因?yàn)槟０?，所用引物見?。
表1丙氨酸掃描的引物序列
pcr條件為：10×buffer5μl，引物(10mm)各6μl，dntp(2.5mm)4μl，pfu酶(2.5u/ml)1μl，質(zhì)粒10ng，超純水補(bǔ)足50μl。條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16個(gè)循環(huán)。pcr產(chǎn)物用1μldpni酶于37℃處理1h。pcr產(chǎn)物10μl化學(xué)法轉(zhuǎn)入e.colidh5α。送于上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株e.colibl21-de3。
所獲得的丙氨酸掃描突變體酶活測(cè)定方法見實(shí)例1.2。測(cè)定結(jié)果顯示，在40℃反應(yīng)3小時(shí)后，母本chkred20轉(zhuǎn)化35g/l底物15a的轉(zhuǎn)化率為6.8％，而這些突變子中h145a和m201a轉(zhuǎn)化率高于母本，分別為21.7％和24.4％；在轉(zhuǎn)化16a的實(shí)驗(yàn)中，h145a的轉(zhuǎn)化率為27.4％，而m201a與母本均不能轉(zhuǎn)化該底物。然后，我們以母本chkred20基因?yàn)槟０?，?duì)所獲得的兩個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行整合，將第145位和第201位氨基酸殘基同時(shí)進(jìn)行雙位點(diǎn)飽和突變。
2.2雙位點(diǎn)飽和突變文庫的構(gòu)建方法
我們對(duì)羰基還原酶chkred20的第145位和第205位氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，該文庫構(gòu)建以羰基還原酶chkred20基因?yàn)槟０澹靡镆姳?。
表2雙位點(diǎn)飽和突變的兼并引物序列
pcr條件為：10×hfbuffer10μl，mgcl21μl，引物(50ng/μl)各1.5μl，(145和201位點(diǎn)隨機(jī)化引物vhg:nrt:wtt:tgg＝9：8：2：1)，dntp(2.5mm)4μl，pfusion(2.5u/ml)1μl，質(zhì)粒10ng，超純水補(bǔ)足50μl。pcr程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16個(gè)循環(huán)。pcr產(chǎn)物用1μldpni酶于37℃處理1h。pcr產(chǎn)物10μl化學(xué)法轉(zhuǎn)入e.colidh5α，所建突變庫容應(yīng)大于1200。送于上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株e.colibl21-de3，挑取1200個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)。
2.3雙位點(diǎn)飽和突變文庫的高通量篩選方法
飽和突變文庫的高通量篩選方法：挑取單克隆于96孔板，每孔含有200μltb培養(yǎng)基(含有50μg/ml卡那霉素，0.5mmiptg)，30℃，180rpm，震蕩培養(yǎng)18h。用96孔板復(fù)制器復(fù)制各單克隆于lb固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)12h后，4℃冰箱保存。將菌體誘導(dǎo)表達(dá)后的96孔板在4℃、4000rpm下離心10min，棄去上清，各孔加入200μl的溶菌緩沖液重懸細(xì)胞(溶菌緩沖液的配置：0.1m、ph8.0的磷酸鉀緩沖液，10mg/ml溶菌酶，1μg/mldnasei，10mmmgcl2)。將加有溶菌液的96孔板在37℃放置60min后，在4℃、4000rpm下離心10min，取上清。用排槍輕輕吸出96孔板各孔中的上清液到新的96孔板上(50μl)，在其各孔中加入150μl反應(yīng)液(1mm的nadh，0.1m、ph8.0的磷酸鉀緩沖液和0.02倍體積的含有1mm16a的二甲基亞砜溶液)；30℃反應(yīng)1h后，在340nm下測(cè)定nadh的吸光度。
表3丙氨酸掃描突變體對(duì)底物15a及16a的轉(zhuǎn)化情況
如表3所示，以底物16a篩選到的突變體h145a/m201a具有比單點(diǎn)突變體h145a和m201a更高的活力，該突變子對(duì)254mm的15a和227mm的16a的轉(zhuǎn)化活力分別為43.7％及40.3％，ee值均>99％。
實(shí)施例3距離第145位組氨酸
3.1距離第145組氨酸
分別對(duì)突變體h145a/m201a上的第143、144、151、153、160、186、188、196、205位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。以突變體h145a/m201a為模板，利用nns兼并性引物(n代表a，t，c，g；s代表g，c)，所用的兼并引物見表4。
表4第一輪單位點(diǎn)飽和突變兼并引物
pcr條件為：10×buffer5μl，引物(10mm)各6μl，dntp(2.5mm)4μl，pfu酶(2.5u/ml)1μl，質(zhì)粒10ng，超純水補(bǔ)足50μl。條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸6min，共16個(gè)循環(huán)。pcr產(chǎn)物用1μldpni酶于37℃處理1h。pcr產(chǎn)物10μl化學(xué)法轉(zhuǎn)入e.colidh5α，所建突變庫容應(yīng)大于100。送于上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株e.colibl21-de3，挑取100個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)。
3.2第一輪飽和突變文庫的高通量篩選方法
高通量篩選方法同實(shí)施例2.3。
在底物16a的高通量篩選中，獲得活力比對(duì)照h145a/m201a高出50％的菌株h145a/m201a/s153r、h145a/m201a/y188l，通過進(jìn)一步粗酶液復(fù)篩(方法同實(shí)施例1.2)，測(cè)得其對(duì)底物15a以及16a的活力相對(duì)于突變體h145a/m201a有不同程度的提高。另外，h145a/m201a/y188l所生成的相應(yīng)醇的構(gòu)型與突變體h145a/m201a/s153r為互補(bǔ)構(gòu)型。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試?yán)靡吧蚦hkred20及突變體h145a/m201a、h145a/m201a/s153r、h145a/m201a/y188l對(duì)底物1a-20a的轉(zhuǎn)化活力進(jìn)行測(cè)定，如表6所示。
實(shí)施例4chkred20催化口袋進(jìn)出口的位點(diǎn)隨機(jī)化
4.1chkred20催化口袋進(jìn)出口的位點(diǎn)飽和突變文庫構(gòu)建方法
分別對(duì)突變體h145a/m201a/s153r上的第38、39、42、97、152、193、194位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。以突變體h145a/m201a/s153r為模板，利用nns兼并性引物(n代表a，t，c，g；s代表g，c)，pcr條件及建庫方法同實(shí)例3，所用的兼并引物見表5。
表5第二輪單位點(diǎn)飽和突變兼并引物序列
4.2第二輪飽和突變文庫的高通量篩選方法
高通量篩選方法同實(shí)施例2.3，底物為5a。
由于h145a/m201a/s153r符合“anti-prelog”法則，我們將此突變體作為飽和突變文庫構(gòu)建模板，并以5a為底物進(jìn)行高通量篩選，獲得活力比對(duì)照h145a/m201a/s153r高出50％的菌株有h145a/m201a/s153r/q97a，h145a/m201a/s153r/l152m和h145a/m201a/s153r/n39d。在進(jìn)一步粗酶液復(fù)篩中，其對(duì)濃度為15mm的底物5a轉(zhuǎn)化率分別為96.4％、91.6％和92％，而對(duì)照h145a/m201a/s153r的轉(zhuǎn)化率為62.8％。我們通過定點(diǎn)突變對(duì)新篩選出的三個(gè)突變體進(jìn)行隨機(jī)組合，最終得到對(duì)底物5a活力最高的突變子h145a/m201a/s153r/q97a/n39d，該突變子對(duì)底物2a-6a、15a、16a、17a、19a的催化活力也大幅度提高(如表6所示)。
突變體h145a/m201a/s153r/q97a/n39d對(duì)1-(2，4-二甲基苯基)乙酮的轉(zhuǎn)化活力最高，可在18小時(shí)轉(zhuǎn)化93.9％的340mm(50g/l)該底物，并且對(duì)2a-6a、15a、16a、17a、19a的催化活力也大幅度提高。突變體h145a/m201a/s153r/q97a/n39d不對(duì)稱還原多個(gè)底物均具有很高的立體選擇性(表7)，但是對(duì)6a和19a所生成的相應(yīng)產(chǎn)物醇ee值不高。然而，我們前面幾輪突變所獲得其他突變體對(duì)6a和19a卻有較高的選擇性。例如，突變體h145a/m201a/y188l對(duì)催化底物6a和19a生成的產(chǎn)物(s)-6b、(s)-17b，ee值都>99％。
表6野生型chkred20和突變子對(duì)底物1a-20a的催化情況
注：con表示轉(zhuǎn)化率；nd表示未檢測(cè)到。
表7野生型chkred20和突變子h145a/m201a/s153r/q97a/n39d對(duì)多種酮的催化情況