本發(fā)明涉及促進細胞外基質(zhì)分泌的方法，特別是一種強脈沖光促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

衰老(aging，senescence)是一個由遺傳和環(huán)境因素共同調(diào)節(jié)的、生物體必然發(fā)生的、程序化控制的生理學(xué)過程，既是生物體的整體衰老，更是每個器官、組織的老化及功能衰退。衰老的進程包含有多個生理學(xué)現(xiàn)象，例如：細胞外基質(zhì)分泌的減少，細胞數(shù)目的減少、組織蛋白的退化、組織的萎縮、代謝率的下降、鈣代謝的紊亂等等，這些生理學(xué)發(fā)生的過程中又可能伴隨有各種病理學(xué)過程的發(fā)生。衰老發(fā)生的原因及機制是多方面的，很多方面尚不明確。

皮膚的衰老反映在細胞水平上即為細胞衰老。成纖維細胞是皮膚真皮組織中的主要細胞成分，它可以分泌膠原纖維、彈性纖維及細胞外基質(zhì)成分，與成纖維細胞一道構(gòu)成了真皮的主體成分。大量的研究表明，成纖維細胞因其所特有的生物學(xué)特性發(fā)生改變，在皮膚衰老的過程中扮演著十分重要的角色。并且由于皮膚成纖維細胞容易獲取，又易于在體外培養(yǎng)生長，目前皮膚成纖維細胞已在皮膚老化相關(guān)研究中得到廣泛的運用。

cn101648010a公開了一種促進成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)成分的制劑，包括組分a)、組分b)和組分c)；其中所述組分a)為禽蛋的蛋清，組分b)為蛋清溶菌酶，組分c)為丙酮酸或丙酮酸鹽。

cn105998037a公開了多西環(huán)素在制備治療和/或預(yù)防衰老性疾病的藥物中的用途，其中所述多西環(huán)素以等于或小于2μg/ml的劑量施用；其中所述衰老性疾病包括皮膚老化、神經(jīng)退行性疾病、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病。

cn104473834a公開了螞蟻提取物作為有效成分在制備化妝品中的應(yīng)用，所述螞蟻提取物能夠抑制黑色素瘤細胞增殖，具有一定的祛斑美白作用；螞蟻提取物還能保護皮膚成纖維細胞活力，顯著增加皮膚中膠原蛋白和羥脯氨酸的分泌，增強皮膚彈性，具有一定的抗衰老作用；同時螞蟻提取物能提升超氧化物歧化酶(sod)活力并減少活性氧(ros)的產(chǎn)生，具有一定的抗氧化作用。

cn1661010a公開了一種制備軟骨細胞的方法，包括步驟：(a)在適合生長的條件下，將成纖維細胞在含軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白的成纖維細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-30天，從而使成纖維細胞誘導(dǎo)形成軟骨細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出軟骨細胞。

cn103396982a公開了一種骨髓間充質(zhì)干細胞自分泌細胞外基質(zhì)并誘導(dǎo)其成為肝細胞方法的應(yīng)用，所述的細胞外基質(zhì)為誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞所分泌的并且去除了骨髓間充質(zhì)干細胞的基質(zhì)。

cn105274051a公開了一種用于培養(yǎng)間質(zhì)基質(zhì)細胞的方法，所述方法包括以下步驟：a.在包括堿性成纖維細胞生長因子bfgf的培養(yǎng)基存在下，允許培養(yǎng)直至第一預(yù)定傳代的所述間質(zhì)基質(zhì)細胞擴增至第二預(yù)定傳代；其中，當所述細胞實現(xiàn)至少一個預(yù)定匯合時，通過使所述細胞與所述培養(yǎng)基接觸進行所述擴增；并且其中，當與所述第一預(yù)定傳代的細胞數(shù)目相比，所述方法在所述第二預(yù)定傳代結(jié)束時使所述細胞的數(shù)目增加了2000倍。

cn104928237a公開了一種刺激軟骨細胞外基質(zhì)分泌的培養(yǎng)基，該用于刺激軟骨細胞分泌軟骨細胞外基質(zhì)包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、骨形成蛋白bmp-2或者其類似物、多西環(huán)素和地塞米松。

us2009/059015a公開了一種液體組合物，其含有心臟來源的脫細胞化細胞外基質(zhì)，其中所述液體組合物是中和溶液，所述脫細胞化細胞外基質(zhì)在所述溶液中的濃度在2mg/ml～10mg/ml的范圍內(nèi)，且所述液體組合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z形式，且其中所述液體組合物能通過注射導(dǎo)管以合適的阻力輸送且不阻塞導(dǎo)管，且其中所述組合物通過以下方法獲得，所述方法包括：(a)獲取具有細胞外基質(zhì)組分和非細胞外基質(zhì)組分的心臟組織樣品；(b)以洗滌劑處理組織樣品以去除非細胞外基質(zhì)組分，從而得到脫細胞化細胞外基質(zhì)；(c)將脫細胞化細胞外基質(zhì)研磨成粉末；(d)以胃蛋白酶消化步驟(c)的脫細胞化細胞外基質(zhì)；以及(e)將步驟(d)的經(jīng)消化的脫細胞化細胞外基質(zhì)的ph中和以產(chǎn)生所述液體組合物。

“蟲草多糖對8-mop/uva誘導(dǎo)光老化皮膚成纖維細胞膠原的影響”，李華等，《上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報》，2009年04期，探討了蟲草多糖(cp)對皮膚成纖維細胞光老化保護作用中對膠原的影響，其中用8-甲氧補骨脂素聯(lián)合uva(8-mop/uva)誘導(dǎo)皮膚成纖維細胞光老化，用電鏡觀察、羥脯氨酸含量、丙二醛含量測定及免疫細胞化學(xué)等方法觀察蟲草多糖對成纖維細胞光老化過程中膠原的影響。

然而，在上述文獻和其它現(xiàn)有技術(shù)中，缺少一種促進衰老成纖維細胞的細胞外基質(zhì)分泌的有效手段。本領(lǐng)域需要一種能夠以高效率方式促進衰老成纖維細胞外基質(zhì)分泌的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明人經(jīng)過深入研究和大量實驗，提供了以下技術(shù)方案。

在本發(fā)明的一方面，提供了一種強脈沖光促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)的方法，該方法包括用強脈沖光對衰老成纖維細胞進行輻照。

優(yōu)選地，所述強脈沖光的波長為600-1000nm，優(yōu)選700-950nm，更優(yōu)選800-900nm。

優(yōu)選地，所述強脈沖光為連續(xù)波長的強脈沖光，優(yōu)選在所述波長范圍內(nèi)的連續(xù)波長的強脈沖光。

優(yōu)選地，所述強脈沖光輻照是在21ms內(nèi)連續(xù)從10j/cm²、15j/cm²、20j/cm²、25j/cm²、30j/cm²、35j/cm²變換到40j/cm²，每種照射能量下平均分配時間，不斷循環(huán)，共輻照10min-2h，優(yōu)選1.5h。

在一個優(yōu)選實施方式中，在分泌促進劑存在下用強脈沖光對衰老成纖維細胞進行輻照。所述分泌促進劑優(yōu)選為葡糖苷類化合物。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種可用于促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)的分泌促進劑，其為葡糖苷類化合物。

本發(fā)明還提供了所述分泌促進劑的制備方法，其通過從天然物質(zhì)提取或提取后進一步改性得到。

在本發(fā)明的又一方面，提供了所述分泌促進劑在促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)中的用途，其用于強脈沖光輻照下促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)。

優(yōu)選地，所述衰老成纖維細胞為人體外或動物體外衰老成纖維細胞。

優(yōu)選地，所述衰老成纖維細胞為體外培養(yǎng)人或動物正?；蛩ダ侠w維細胞。

所述體外培養(yǎng)人正?；騽游锼ダ铣衫w維細胞通過如下方法得到：

(1)將皮膚組織切除皮下脂肪組織，然后切取1cm×0.3cm大小的一塊，置于含青霉素和鏈霉素各100u/ml的dmem培養(yǎng)基中浸泡15min；

(2)用pbs緩沖液反復(fù)沖洗后，剪切成1～2mm的小塊，然后加入0.25wt.％胰蛋白酶，于37℃條件下繼續(xù)消化5～8小時；

(3)在消化的同時進行振蕩，隨時在顯微鏡下觀察消化結(jié)果，當成纖維細胞大部分從包裹的細胞外基質(zhì)纖維中分離出來時，用含10％小牛血清的dmem培養(yǎng)基終止消化。

(4)用100目不銹鋼網(wǎng)過濾，去除大的組織塊殘渣，將濾液慢速離心(優(yōu)選800-1000r/5～10min)，取上清液，將上清液以1000rpm離心3～6min，棄上清，加pbs5ml，重懸后以1000rpm再離心5～8min，棄上清，然后加入含20wt.％小牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)后以2.5～3×10⁵細胞/50ml一次性培養(yǎng)瓶接種；

(5)然后每隔3天換一次培養(yǎng)液，待細胞融合后，用胰酶消化后傳代，體外培養(yǎng)3～6代細胞，即得所需的衰老成纖維細胞。

所述皮膚組織可以例如為人施行眼袋切除術(shù)的眼瞼周圍的正常皮膚，或者為人體耳后切除的皮膚，或者可以為小鼠腹部皮膚。在獲得人體相關(guān)皮膚組織之前與患者簽訂了相關(guān)知情協(xié)議。

通過所述方法獲得的成纖維細胞生長狀態(tài)非常良好，具有良好的活性，適合進行脈沖光促進細胞外基質(zhì)分泌?？梢酝ㄟ^mtt比色法測定對細胞活性進行測量，檢測發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)方法獲得的成纖維細胞比本領(lǐng)域普通方法獲得的成纖維細胞生長狀態(tài)要好很多。

在用強脈沖光對衰老成纖維細胞進行輻照之前，用分泌促進劑將成纖維細胞進行預(yù)處理，該預(yù)處理可以包括以下步驟：向上述方法獲得的成纖維細胞加入含10％小牛血清的emdm培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基預(yù)先加入有基于該培養(yǎng)基重量計0.01-1.0wt.％的分泌促進劑。emdm培養(yǎng)基的加入量沒有嚴格限制，可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)加入量。

將預(yù)處理后的成纖維細胞接種于孔板中，然后用強脈沖光照射。

優(yōu)選地，所述照射調(diào)節(jié)為：波長范圍：600-1000nm，優(yōu)選700-950nm，更優(yōu)選800-900nm；光斑面積為25mm×40mm；脈沖寬度：21ms，從1檔至7檔分別為，能量分別是10j/cm²、15j/cm²、20j/cm²、25j/cm²、30j/cm²、35j/cm²、40j/cm²，每種照射能量下平均分配時間(即，每個檔位保持3ms)，不斷循環(huán)，共輻照10min-2h。

可以采用mtt染色法測定其細胞外基質(zhì)分泌情況。

優(yōu)選地，所述分泌促進劑為葡糖苷類化合物。更優(yōu)選地，所述葡糖苷類化合物為下式(i)所示的化合物：

其中r為-ch3或-oh。

該分泌促進劑含有黃酮結(jié)構(gòu)，可以通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷，保護或修復(fù)了dna，促進細胞增殖和基質(zhì)分泌，抑制損傷細胞凋亡，誘導(dǎo)細胞修復(fù)或增殖，其發(fā)揮作用的機制在進一步研究中。此外，該黃酮化合物與一般黃酮化合物或多酚化合物相比，由于葡糖基的存在，具有較小的免疫毒性。

所述分泌促進劑的制備方法可以包括以下步驟：

(1)取白菊花(例如來自杭州桐廬的杭白菊)500g，將其在-80℃下凍干，然后研磨成細粉末，裝入到具有teflon旋塞的玻璃柱中(80cm長，直徑為10cm)，然后依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇(三種溶劑的量均為1.0l)流動萃取，每種溶劑循環(huán)3-6次，將所述提取液合并，在減壓條件下將上述合并的提取液于30-45℃分別蒸發(fā)基本至干，得到濃縮物；

(2)將所述濃縮物溶解在100ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脫色，然后在-80℃下凍干得到固體粉末。再將所述固體粉末溶解在300ml甲醇-水(5∶1v∶v)中，過sephadexlh-20柱，進行柱層析分離，用甲醇作為洗脫液，通過紫外燈下檢測收集各個洗脫液部分(例如采用本領(lǐng)域技術(shù)人員樹脂的硅膠板)，其中具體收集第2和第5部分洗脫液，在30-45℃分別蒸發(fā)基本至干，得到濃縮物；

(3)將第2和第5部分洗脫液對應(yīng)的濃縮物分別溶解在500ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脫色，然后在-80℃下凍干分別得到固體粉末1和2。

固體粉末1為上述式(i)化合物中r為甲基的情形，固體粉末2為上述式(i)化合物中r為羥基的情形。

在本發(fā)明中，可以將固體粉末1和2按照1∶5-5∶1的重量比混合使用，也可以單獨使用。研究發(fā)現(xiàn)，混合使用比單獨使用具有更好的效果。

當r為羥基(-oh)時，可以通過常規(guī)反應(yīng)使其與嘌呤上的亞氨基反應(yīng)而與嘌呤相連，所述亞氨基即下式中9位的氫：

嘌呤基團的引入可以進一步增強該分泌促進劑與成纖維細胞的生物相容性，從而更有利于分泌促進劑進入細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)內(nèi)，且不會引起特異反應(yīng)。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分泌促進劑，其結(jié)構(gòu)式同上文所述。

在本發(fā)明的又一方面，提供了上述分泌促進劑在促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)中的用途。優(yōu)選地，其用于強脈沖光促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)，其中用所述分泌促進劑將成纖維細胞進行預(yù)處理，然后用強脈沖光輻照，促進衰老成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)。

本發(fā)明的方法可以促進成纖維細胞膠原蛋白及彈性蛋白的合成，提高超氧化物歧化酶活力，清除自由基，延緩皮膚老化，為其應(yīng)用于皮膚老化的防治提供了實驗依據(jù)。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例2的方法輻照后衰老成纖維細胞的顯微鏡圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例2和對比例1測得的細胞外基質(zhì)隨輻照時間的變化曲線圖。

具體實施方案

下面結(jié)合以下實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

按照下述方法制備式(i)所示分泌促進劑：取來自杭州桐廬的杭白菊500g，將其在-80℃下凍干，然后研磨成細粉末，裝入到具有teflon旋塞的玻璃柱中(80cm長，直徑為10cm)，然后依次用正己烷、乙酸乙酯和甲醇(三種溶劑的量均為1.0l)流動萃取，每種溶劑循環(huán)3次，將所述提取液合并，在減壓條件下將上述合并的提取液于30℃分別蒸發(fā)基本至干，得到濃縮物；將所述濃縮物溶解在100ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脫色，然后在-80℃下凍干得到固體粉末。再將所述固體粉末溶解在300ml甲醇-水(5∶1v∶v)中，過sephadexlh-20柱，進行柱層析分離，用甲醇作為洗脫液，通過紫外燈下檢測收集各個洗脫液部分，具體收集第2和第5部分洗脫液，在30℃分別蒸發(fā)基本至干，得到濃縮物；將第2和第5部分洗脫液對應(yīng)的濃縮物分別溶解在500ml甲醇-水(1∶1v∶v)中，加入活性炭脫色，然后在-80℃下凍干分別得到固體粉末1和2，將固體粉末1和2按照1∶1的重量比混合，用作分泌促進劑。

實施例2

取大鼠腹部皮膚，按照前文所述方法進行培養(yǎng)，向培養(yǎng)獲得的成纖維細胞加入含10％小牛血清的emdm培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基預(yù)先加入有基于該培養(yǎng)基重量計0.02wt.％的實施例1分泌促進劑，然后接種于孔板中，用強脈沖光照射。所述照射調(diào)節(jié)為：波長范圍：700nm-900nm；光斑面積為25mm×40mm；脈沖寬度：21ms，從1檔至7檔分別為，能量分別是10j/cm²、15j/cm²、20j/cm²、25j/cm²、30j/cm²、35j/cm²、40j/cm²，每種照射能量下平均分配時間，不斷循環(huán)，共輻照1.5h。采用mtt染色比色法測定其細胞外基質(zhì)分泌情況。

對比例1

重復(fù)實施例1的操作，對比例1與實施例1的區(qū)別僅在于培養(yǎng)時不加入所述分泌促進劑。

由圖1可以看出，本發(fā)明的衰老成纖維細胞在經(jīng)過上述處理后細胞間融合的比較好，衰老成纖維細胞的形態(tài)發(fā)生了變化，細胞核變大尤其明顯。這表明本發(fā)明的促進方法能夠特別有效促進細胞外基質(zhì)的分泌。由圖2(橫坐標為時間，min，縱坐標為細胞外基質(zhì)的濃度，μg/ml，上面的曲線為根據(jù)實施例1測得，下面的曲線為根據(jù)對比例1測得)可以看出，當加入本發(fā)明的分泌促進劑時，細胞外基質(zhì)的分泌量增加較多，在90min時仍在持續(xù)增加，當不加入分泌促進劑時，從60min到90min，細胞外基質(zhì)的量幾乎沒有增長。

研究還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的分泌促進劑的加入，可以影響膠原蛋白的合成與分泌。另外，本發(fā)明的促進劑容易進入細胞內(nèi)，這種促進作用更為明顯。

本書面描述使用實例來公開本發(fā)明，包括最佳模式，且還使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制造和使用本發(fā)明。本發(fā)明的可授予專利的范圍由權(quán)利要求書限定，且可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的其它實例。如果這種其它實例具有不異于權(quán)利要求書的字面語言的結(jié)構(gòu)元素，或者如果這種其它實例包括與權(quán)利要求書的字面語言無實質(zhì)性差異的等效結(jié)構(gòu)元素，則這種其它實例意圖處于權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。在不會造成不一致的程度下，通過參考將本文中參考的所有引用之處并入本文中。