本發(fā)明屬于生物酶領(lǐng)域，具體地，涉及一種羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酶（enzyme）的本質(zhì)大部分是蛋白質(zhì)，少數(shù)為非蛋白質(zhì)，酶具有高效性、專一性、溫和性，是一類特殊的催化劑，也稱生物催化劑。但游離的酶穩(wěn)定性差，極易在高溫、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中被破壞結(jié)構(gòu)而變性失活，因此大大的限制了酶的大量重復(fù)使用。為了提高酶的穩(wěn)定性，1953年由德國科學(xué)家（gubhofen）提出“固定化酶”，固定化酶是使用特殊的固體材料將酶固定在一定的區(qū)域內(nèi)，但其仍然能夠進(jìn)行催化反應(yīng)，且該酶可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。固定化酶的基本方法有包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)鍵合法等，其中交聯(lián)法是利用一類特殊的試劑在酶與載體間進(jìn)行交聯(lián)而形成共價(jià)鍵，從而得到交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。

木瓜蛋白酶（papain）通常為白色的粉末狀，溶于磷酸緩沖液、微溶于水，有特殊的氣味。由于木瓜蛋白酶活性中心是含有半胱氨酸的巰基蛋白酶，具有較強(qiáng)的水解多種蛋白酶的能力，且熱穩(wěn)定性好以及來源豐富等特點(diǎn)，因此在醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶與胃蛋白酶的作用性能很相似，在一定程度上可以使用木瓜蛋白酶來幫助機(jī)體水解蛋白質(zhì)。因此，在對于機(jī)體組織壞死的癥狀可用木瓜蛋白酶進(jìn)行治療，尤其是對于難以水解的蛋白質(zhì)的水解效果更為有效，因此木瓜蛋白酶在醫(yī)學(xué)上被稱為“生物性解剖刀”。rakhimov做過大量的研究發(fā)現(xiàn)，對于燒傷、燙傷等普遍發(fā)生的創(chuàng)傷中，木瓜蛋白酶作為燒傷敷料可以有效地消除傷口紅腫發(fā)炎，加快傷口愈合，并且對正常的組織細(xì)胞無副作用?；谀竟系鞍酌傅母钊胙芯?，在不久的將來木瓜蛋白酶會(huì)在更多的領(lǐng)域行業(yè)得到更加廣泛的應(yīng)用。

現(xiàn)有技術(shù)中，通常以殼聚糖、樹脂、纖維素納米晶基材等為載體，通過交聯(lián)法對木瓜蛋白酶進(jìn)行固定化，載體的選擇是影響固定化木瓜蛋白酶的穩(wěn)定性和酶活力回收率的關(guān)鍵因素。目前以羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿為固定化載體，利用交聯(lián)法固定木瓜蛋白酶還未見報(bào)導(dǎo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中的研究空白，提供一種羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶。本發(fā)明以羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿為固定化載體，得到的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶具有較好的穩(wěn)定性和酶活力回收率。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶在醫(yī)藥或食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶，所述固定化木瓜蛋白酶的制備方法如下：

s1：將羧甲基殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液混合得混合溶液，備用；用磷酸緩沖溶液溶解木瓜蛋白酶得木瓜蛋白酶溶液，備用；

s2：于攪拌狀態(tài)下將木瓜蛋白酶溶液加入所述混合溶液中，然后加入戊二醛溶液攪拌10～30min，然后再加入cacl2溶液并攪拌10～30min，得固化混合液備用；

s3：將s2所得固化混合溶液真空冷凍干燥，即得所述羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶；

其中，s1中，所述木瓜蛋白酶溶液的酶活為500～700u/ml；s2中，所述戊二醛溶液的濃度為1.0～1.6%。

殼聚糖本身不溶于水，但在引入親水基團(tuán)羧甲基后，殼聚糖內(nèi)部的晶體結(jié)構(gòu)被破壞致使羧甲基殼聚糖的水溶性顯著提高。另外羧甲基殼聚糖分子中大量的氨基和羧基在交聯(lián)劑戊二醛的作用下，分子內(nèi)和分子間都可以發(fā)生交聯(lián)作用而形成凝膠，經(jīng)冷凍干燥后可形成優(yōu)良的孔隙性和透氣性的膜；同時(shí)羧甲基殼聚糖具有比殼聚糖更為優(yōu)異的抑菌抗菌功效。

海藻酸鈉(sodiumalginate,naalg,簡稱ags)是一種天然高分子多糖類化合物，一種白色或淡黃色粉末，廣泛存在于各類棕色海藻中，具有較好的水溶性，充分吸水后體積可膨脹至10倍；具有較好的穩(wěn)定性，在酸性、堿性以及高溫的環(huán)境中都比較穩(wěn)定；具有較好的凝膠成膜性，在少量含有ca²⁺的堿性溶液，ca²⁺可以迅速置換出凝膠中的na⁺形成海藻酸鈣凝膠，這種凝膠的強(qiáng)度較好且為熱不可逆的，冷凍干燥后形成薄膜，適用于作載體海綿或者止血海綿性等。

本發(fā)明提供的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶，充分利用羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉在交聯(lián)劑作用下可互相交聯(lián)成膜的特性，得到具有較大比表面積和孔隙性的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)；木瓜蛋白酶一方面通過其非活性中心的氨基與戊二醛上的醛基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)形成席夫堿結(jié)構(gòu)，吸附在復(fù)合海綿上；另一方面通過物理作用吸附在復(fù)合海綿上，從而使得本發(fā)明制備得到的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶在較好的酶活力回收率的基礎(chǔ)上，具有更好的穩(wěn)定性；另外復(fù)合海綿還可增強(qiáng)固定化蛋白酶的殺菌抑菌功效。

優(yōu)選地，s1中，所述木瓜蛋白酶溶液的酶活為600u/ml。研究表明，木瓜蛋白酶在復(fù)合海綿上的吸附量會(huì)隨著固定化木瓜蛋白酶的增加而增加，此時(shí)酶活力回收率也隨之增大；但當(dāng)木瓜蛋白酶增加到一定量以后，木瓜蛋白酶的吸附已經(jīng)接近飽和，此時(shí)多余的酶并不能吸附到復(fù)合海綿上，只能以游離的狀態(tài)存在。

優(yōu)選地，s2中，所述戊二醛溶液的濃度為1.0%。戊二醛在固定化反應(yīng)中起交聯(lián)的作用，但是戊二醛又會(huì)破壞酶的活性基團(tuán)導(dǎo)致酶失活。發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，隨著戊二醛量的增加，在羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿形成了更多的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)使木瓜蛋白酶更多地結(jié)合在海綿上，但戊二醛用量到一定量之后，戊二醛與木瓜蛋白酶活性中心的氨基反應(yīng)增加，使木瓜蛋白酶活性降低或失活，因此選用適合的戊二醛濃度是保證固定化木瓜蛋白酶固定效果和酶活力回收率的關(guān)鍵。

優(yōu)選地，所述羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉與木瓜蛋白酶的質(zhì)量體積比為1:3～8；即每克羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉載體固化的木瓜蛋白酶的活力單位為2000～4000u。

優(yōu)選地，所述戊二醛與羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉的質(zhì)量比為2:5～25。

優(yōu)選地，所述混合溶液中羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的質(zhì)量比為3:7～7:3。

羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉作為不同的海綿材料，其配比不同，在戊二醛和氯化鈣的交聯(lián)作用下，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也不同，木瓜蛋白酶與海綿的結(jié)合量也不同，進(jìn)而也影響了酶活力回收率的高低。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的質(zhì)量比在本方案范圍內(nèi)時(shí)，具有更為優(yōu)異的酶活力回收率。

優(yōu)選地，所述混合溶液中羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的摩爾比為4:6。

優(yōu)選地，s2中的反應(yīng)溫度為20～40℃

優(yōu)選地，s2中的反應(yīng)溫度為25℃。

上述羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶為網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)，具有比表面積大、孔隙性和吸水性好的優(yōu)點(diǎn)；木瓜蛋白酶可通過化學(xué)作用和物理吸附與復(fù)合海綿結(jié)合。本發(fā)明提供的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶在具有較好的酶活力回收率的同時(shí)還具有較好的穩(wěn)定性。另外，該固定化木瓜蛋白酶還具有較好的殺菌抑菌功效。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶；

圖2為本發(fā)明提供的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶的顯微結(jié)構(gòu)（40×）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。這些實(shí)施例僅是對本發(fā)明的典型描述，但本發(fā)明不限于此。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的原料，試劑等，如無特殊說明，均為可從常規(guī)市場等商業(yè)途徑得到的原料和試劑。

實(shí)施例1~10

實(shí)施例1~10中的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶由如下制備方法制得：

s1：將羧甲基殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液混合得混合溶液，備用；同時(shí)用磷酸緩沖溶液溶解木瓜蛋白酶得木瓜蛋白酶溶液，備用；

s2：于攪拌狀態(tài)下將木瓜蛋白酶溶液加入所述混合溶液中，然后加入戊二醛溶液攪拌10min后加入cacl2溶液攪拌10min，得固化混合液備用；

s3：將s2所得固化混合溶液真空冷凍干燥，即得所述羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶。

實(shí)施例1~10中羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉的質(zhì)量配比、木瓜蛋白酶溶液的酶活、戊二醛的用量及s2中反應(yīng)溫度如下表1，實(shí)施例1~10中羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉溶液的總質(zhì)量為10g，木瓜蛋白酶溶液的用量為1ml，戊二醛溶液的用量為0.5ml。

表1實(shí)施例1~10中物料和控制條件

對比例1~4

對比例1~4中各物料用量和條件控制如下：

表2對比例1~4中各物料用量和條件控制

對比例1和對比例2為不同戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下制備得到的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶，其余條件及制備方法與實(shí)施例1一致。其中對比例1中戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%；對比例2中戊二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%。

對比例3為僅選用殼聚糖對木瓜蛋白酶進(jìn)行固定，得到殼聚糖固定化木瓜蛋白酶，其中殼聚糖的用量與羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉的總質(zhì)量相同，其余條件及制備方法與實(shí)施例1中的一致。

對比例4為選用殼聚糖/海藻酸鈉為載體，得到殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶，其中殼聚糖/海藻酸鈉的配比與實(shí)施例1中一致，殼聚糖/海藻酸鈉的用量與羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉的用量相同，其余條件及制備方法與實(shí)施例1中的一致。

性能測定

（1）羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶形貌分析

圖1為本發(fā)明制備得到的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶，由圖1可觀察到其呈白色，質(zhì)地柔軟，表面平整；該固定化木瓜蛋白酶的顯微結(jié)構(gòu)如圖2，從圖中可以看出，復(fù)合海綿的表面為不規(guī)則的多孔結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)良的孔隙性和透氣性，適合用于作木瓜蛋白酶的固定化的載體。

（2）羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶的活性測定

測試方法：

精密稱取1/5制備好的海綿，放置10ml具塞的試管中，加入2ml配制好的酶稀釋液，完全浸沒2h，充分膨脹后，置37±0.2℃的水浴中保溫10min，加入5.00ml已預(yù)熱的酪蛋白溶液，充分震蕩，放回水浴中反應(yīng)10min，再加入5.00ml已預(yù)熱的三氯乙酸溶液，充分震蕩，最后放置水浴中40min。用干凈的濾紙過濾上述反應(yīng)物，取濾液。于2h內(nèi)，用蒸餾水作為參比溶液，在紫外分光光度計(jì)波長為275nm測出吸光度a1。

空白實(shí)驗(yàn)：精密稱取1/5制備好的海綿，放置10ml具塞的試管中，加入2ml配制好的酶稀釋液，完全浸沒2h，充分膨脹后，置37±0.2℃的水浴中保溫10min，加入5.00ml已預(yù)熱的三氯乙酸溶液，充分震蕩，放回水浴中反應(yīng)10min，再加入5.00ml已預(yù)熱的酪蛋白溶液，充分震蕩，最后放置水浴中40min。用干凈的濾紙過濾上述反應(yīng)物，取濾液。于2h內(nèi)，用蒸餾水作為參比溶液，在紫外分光光度計(jì)波長為275nm測出吸光度a2。

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度：在紫外分光光度計(jì)波長為275nm處，以蒸餾水作為參比溶液，測出50ug/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度a3。

根據(jù)以下公式計(jì)算結(jié)果：

試樣中木瓜蛋白酶活力x1（u/g）按式（1）計(jì)算：

（1）

式中：a1——試樣溶液的吸光度；

a2——空白試驗(yàn)的吸光度；

a3——酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度；

m1——對照品溶液中每毫升含酪氨酸的量，單位為微克（μg）；

m2——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

n——試樣溶液的稀釋倍數(shù)。

u/g表示固定化酶活力，回收率按下式計(jì)算：

固定化酶活力回收率（%）=固定化酶活力（u）/溶液酶總活力（u）×100%。其中，固定化酶活力是指酶被固定化后測得的固定化酶的活力，溶液酶總活力是指固定化前酶溶液中酶的活力。

測試結(jié)果如表3。

表3實(shí)施例1~10和對照例1~2酶活力回收率測定結(jié)果

由上述可知，實(shí)施例1~10中的羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶的回收率均在51%~65%范圍內(nèi)，回收率較高。

（3）羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶熱穩(wěn)定性研究

在不同溫度條件保存一定的時(shí)間后測試羧甲基殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合海綿固定化木瓜蛋白酶的活性并計(jì)算酶的活性回收率，從而得到熱穩(wěn)定性測試結(jié)果。選取的溫度分別為：低溫（0℃以下）、室溫（25±2℃）、高溫（40±1℃）；保存時(shí)間分別為：1d、3d、5d、10d、15d；每一個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次后取平均值。

測定結(jié)果如下表4。

表4實(shí)施例1~10和對照例1~2熱穩(wěn)定性研究結(jié)果

由上述結(jié)果可知，實(shí)施例1中的固定化蛋白酶在低溫、常溫、高溫條件下分別保存15d后與新制備的相比，總體上保持相對穩(wěn)定，穩(wěn)定性較好。