本發(fā)明涉及一種羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物，以及該羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物的合成工藝。

背景技術(shù)：

紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是從中藥紅豆杉中提取分離得到的二萜類化合物，其獨(dú)特的微管解聚抑制作用機(jī)制使其成為過去數(shù)十年里發(fā)現(xiàn)的最好的抗癌藥物之一。由于紫杉醇在水中溶解度極低(<6μg·mL^-1)，現(xiàn)用于臨床的紫杉醇制劑多用聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)-乙醇(1∶1)配制的注射劑，臨用前稀釋使用(久置紫杉醇會沉淀析出)，應(yīng)用極不方便，且所采用的增溶輔料聚氧乙烯蓖麻油不僅易產(chǎn)生神經(jīng)毒性、腎毒性、心臟毒性等不良反應(yīng)，而且在給藥過程中能溶解輸液管中的增塑劑，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，大大限制了其臨床應(yīng)用。并且長期應(yīng)用后，顯示藥物耐受，最終導(dǎo)致治療失敗。

由于紫杉醇在胃腸道中溶解性差、滲透性差，肝臟首過效應(yīng)以及腸道內(nèi)大量P-gp的外排作用，所以口服生物利用度低(<10％)，口服給藥存在嚴(yán)重問題。近年來，國內(nèi)外許多研究者利用新劑型和新技術(shù)來解決這個問題，如前藥，脂質(zhì)體，納米乳，膠束，納米粒等，取得了一定的效果，但大多處于研究階段，也仍然存在一些缺陷，例如，脂質(zhì)體載藥量偏低，穩(wěn)定性稍差；納米乳屬熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，并需用大量的表面活性劑和助表面活性劑；一些納米粒制備復(fù)雜，除遞送藥物外功能性較差。相比較而言，聚合物膠束載藥量大，能在水及水性溶液中自組裝等優(yōu)勢成為解決難溶性藥物用藥缺陷的有效的解決辦法。

高分子聚合物是近年來新劑型的重要輔料之一。兩親性高分子聚合物在水性溶液中能夠自組裝成納米級殼－核結(jié)構(gòu)的聚合物膠束(Polymeric Micelles)。其疏水內(nèi)核可作為難溶性藥物的儲庫，增溶并緩釋藥物；其親水性外殼決定膠束在水溶液中的穩(wěn)定性，并能保護(hù)藥物在胃腸道復(fù)雜環(huán)境中免受胃酸、酶類等的破壞，減少藥物對胃腸道的刺激性；其納米級粒徑使其易于被吸收，能夠躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的識別與吞噬，易實(shí)現(xiàn)長循環(huán)，并可通過EPR效應(yīng)被動靶向腫瘤。近年來，國內(nèi)外多種高分子聚合物被研發(fā)用于口服給藥系統(tǒng)。

在新型高分子聚合物材料的研發(fā)過程中，殼聚糖成為研究者關(guān)注的目標(biāo)之一。殼聚糖(Chitosan)是一種含氨基的天然多糖，化學(xué)名為β-(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡聚糖，無毒、來源豐富、生物相容性和生物可降解性良好，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著極廣闊的應(yīng)用前景。殼聚糖及其水溶性衍生物羧甲基殼聚糖具有黏膜黏附性，能通過調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞的緊密連接，對藥物透過腸壁有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。多種兩親性殼聚糖衍生物，能促進(jìn)藥物口服吸收，提高療效并降低毒副作用。

大黃酸(Rhein)是中藥蘆薈、大黃等的主要有效成分，屬1,8-二羥基蒽醌衍生物，溶于堿液，不溶于水及很多有機(jī)溶劑。藥理學(xué)研究證明，大黃酸能通過抗血管生成、影響線粒體、調(diào)控細(xì)胞周期素等機(jī)理抗癌，并能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，其作用機(jī)制可能與下調(diào)P-gp及MRP-1蛋白表達(dá)有關(guān)。大黃酸能保護(hù)腸粘膜。水溶性賴氨大黃酸抗肺癌并增強(qiáng)紫杉醇對肺癌細(xì)胞的殺傷和誘導(dǎo)凋亡，減少毒副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一，在于提供一種羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物的合成工藝。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物的合成工藝，包括以下步驟：

(1)稱取羧甲基殼聚糖于反應(yīng)瓶中，加入10mL蒸餾水溶脹30min；取大黃酸粉末于廣口瓶中，加入10mL 1％NaHCO₃溶液，加熱使大黃酸完全溶解，冷卻至室溫，加入EDC·HCl，活化20min，再加入NHS；然后邊攪拌邊將混合液加入到羧甲基殼聚糖溶液中，避光攪拌反應(yīng)24h；其中，各物質(zhì)的摩爾比為羧甲基殼聚糖:大黃酸:EDC·HCl:NHS＝1:1:3:1；

(2)用95％乙醇沉淀反應(yīng)液，靜置后抽濾，并用95％乙醇洗滌沉淀物至洗滌液無色；將抽干后的沉淀物溶解于水中，冰水浴條件下探頭超聲20min后，3000rpm離心10min，取上清液過0.8μm的濾膜，取濾液置于透析袋中透析72h；

(3)透析結(jié)束后，將所述濾液再置于冰水浴中探頭超聲20min后，3000rpm離心10min，取上清液過0.8μm的濾膜，濾液冷凍干燥，即得羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二，在于提供一種羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種所述的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物，所述羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式如下：

n＝361～459。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：反應(yīng)條件溫和；所用溶劑毒性小，有機(jī)溶劑僅用乙醇；操作簡單易行，無須使用大型儀器，也無需控制反應(yīng)溫度及氣體保護(hù)。

附圖說明

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

圖1是本發(fā)明中各紫杉醇制劑在腸道中的吸收速度常數(shù)示意圖。

圖2是本發(fā)明中各紫杉醇制劑在腸道中的表觀滲透系數(shù)示意圖。

圖3是本發(fā)明中口服給予各紫杉醇制劑的血藥濃度-時間曲線圖。

圖4是本發(fā)明中給予各紫杉醇制劑后荷瘤小鼠的腫瘤體積變化曲線圖。

圖5是本發(fā)明中給予各制劑后荷瘤小鼠的體重變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

一種羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物的合成工藝，包括以下步驟：

(1)稱取羧甲基殼聚糖(CMCS)于反應(yīng)瓶中，加入10mL蒸餾水溶脹30min；取大黃酸粉末于廣口瓶中，加入10mL 1％NaHCO₃溶液，加熱使大黃酸完全溶解，冷卻至室溫，加入EDC·HCl(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，活化20min，再加入NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)；然后邊攪拌邊將混合液加入到羧甲基殼聚糖溶液中，避光攪拌反應(yīng)24h；其中，各物質(zhì)的摩爾比為羧甲基殼聚糖:大黃酸:EDC·HCl:NHS＝1:1:3:1；大黃酸在加熱下可溶解在1％的NaHCO₃溶液中，且冷卻至室溫后也不會有沉淀析出。

(2)用95％乙醇沉淀反應(yīng)液，靜置后抽濾，并用95％乙醇洗滌沉淀物至洗滌液無色；將抽干后的沉淀物溶解于水中，冰水浴條件下探頭超聲20min后，3000rpm離心10min，取上清液過0.8μm的濾膜，取濾液置于透析袋(MWCO14000)中透析72h。

(3)透析結(jié)束后，將所述濾液再置于冰水浴中探頭超聲20min后，3000rpm離心10min，取上清液過0.8μm的濾膜，濾液冷凍干燥，即得羧甲基殼聚糖-大黃酸(CR)偶聯(lián)物。

所述羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式如下：

n＝361～459。

羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl Chitosan，CMCS)和大黃酸(Rhein，Rh)，兩個部分以酰胺鍵連接，合成路線如下：

將本發(fā)明制得的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物(羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物在下文簡稱為CR偶聯(lián)物)進(jìn)行促吸收及輔助抗腫瘤效果實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

(1)在體腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠在體腸吸收實(shí)驗(yàn)顯示，各制劑組在大鼠腸道內(nèi)吸收的情況見圖1和圖2，圖1和圖2中各標(biāo)識指代含義如下：

A—十二指腸，B—空腸，C—回腸，D—結(jié)腸；

1—泰素(紫杉醇的市售制劑)，2—泰素+維拉帕米，3—泰素+CR偶聯(lián)物，4—載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束，5—載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束+維拉帕米。

載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束組中的紫杉醇在全腸段吸收速率常數(shù)K_a和表觀滲透系數(shù)P_eff均有不同程度提高，十二指腸、空腸、結(jié)腸、回腸的吸收速率常數(shù)K_a相比泰素(紫杉醇的市售制劑)組分別提高2.87、2.62、2.26、1.44倍，載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束在回腸部位吸收最快(p<0.01)，其次是十二指腸(p<0.01)，結(jié)腸、空腸部位吸收稍慢。載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束組在十二指腸的表觀滲透系數(shù)P_eff相比泰素(紫杉醇的市售制劑)組提高3.09倍；在回腸和結(jié)腸段分別提高2.73、2.34倍，說明載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束對紫杉醇有很好的促吸收作用。

在載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束中加入維拉帕米后，在全腸段的吸收速率常數(shù)K_a和表觀滲透系數(shù)P_eff無明顯變化，推測載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束進(jìn)入腸道的途徑與P-糖蛋白無關(guān)。

(2)藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

30只大鼠，隨機(jī)分為6組，每組5只，禁食12h，不禁水。分別灌胃給予各種紫杉醇制劑后，分別于設(shè)定時間點(diǎn)于大鼠眼底靜脈叢取血，血樣經(jīng)處理后用UPLC-MS分析，所測得血藥濃度-時間曲線如圖3所示，圖3中各標(biāo)識所指代的實(shí)驗(yàn)組如下：

1—泰素(紫杉醇的市售制劑)，2—泰素+維拉帕米，3—載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束，4—泰素+CR偶聯(lián)物，5—泰素+羧甲基殼聚糖。

根據(jù)藥動學(xué)數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果可知，大鼠口服給予各紫杉醇制劑后，泰素+維拉帕米、載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束、泰素+CR偶聯(lián)物、泰素+羧甲基殼聚糖組的AUC_0-48h分別是泰素(紫杉醇的市售制劑)對照組的3.14、7.66、1.05、1.02倍，載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束組具有極顯著性；C_max分別是泰素對照組的4.35、26.00、1.14、1.13倍，T_max分別是泰素對照組的0.78、2、1.62、0.63倍。結(jié)果表明，載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束能夠顯著提高紫杉醇的口服生物利用度，延長在血液中的循環(huán)時間，達(dá)到緩釋效果。

(4)CR偶聯(lián)物的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用GraphPad Prism軟件計(jì)算CR偶聯(lián)物的IC₅₀值結(jié)果見表1。CR偶聯(lián)物在24、48、72h的IC₅₀值均大于100μg/mL，說明CR偶聯(lián)物安全性較高，可以作為一種安全的藥用輔料使用。

表1CR偶聯(lián)物在24、48、72h對Caco-2細(xì)胞的IC₅₀值(n＝3)

注：Blank vehicle是泰素的溶劑聚氧乙烯蓖麻油-乙醇(1∶1)。

(5)體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

荷瘤小鼠分別給予各組紫杉醇制劑(20mg/kg)后，隔天給藥，給藥5次，腫瘤生長曲線見圖4，圖4中各標(biāo)識所指代的實(shí)驗(yàn)組如下：

1—生理鹽水，2—泰素(紫杉醇的市售制劑)，3—泰素+維拉帕米，4—泰素+CR偶聯(lián)物，5—載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束。

由圖4可知，泰素組、泰素+維拉帕米組、泰素+CR偶聯(lián)物組和載紫杉醇的CR偶聯(lián)物膠束組的腫瘤生長速度和生長趨勢明顯小于生理鹽水組。載紫杉醇的CR偶聯(lián)物膠束組與泰素+維拉帕米組的腫瘤生長速度和生長趨勢相近。泰素組、泰素+維拉帕米組、泰素+CR偶聯(lián)物組和載紫杉醇的CR偶聯(lián)物膠束組腫瘤體積分別是生理鹽水組的59.46％、41.12％、54.49％、39.98％。載紫杉醇的CR偶聯(lián)物膠束組與泰素組比具有顯著性意義，腫瘤體積是泰素組的67.24％，說明載紫杉醇的CR偶聯(lián)物膠束對腫瘤有較強(qiáng)的抑制作用。

給藥5次后，第10天剖取腫瘤組織，稱重，解剖后的瘤重及抑瘤率見表2。從表2中可以看出，各給藥組對腫瘤的治療均有一定的效果，與生理鹽水組相比，泰素+CR偶聯(lián)物組瘤重明顯減少(P＜0.05)，泰素+維拉帕米組和載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束組瘤重減少更明顯(P＜0.01)。各紫杉醇制劑組中，載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束組瘤重最小，抑瘤率達(dá)到45.76％(P＜0.05)，是泰素組抑瘤率的1.83倍，抑瘤效果最好，表2的結(jié)果與腫瘤生長曲線的結(jié)果相一致。

表2荷瘤小鼠的腫瘤重量和抑瘤率(n＝10)

^*P＜0.05vs.生理鹽水，^**P＜0.01vs.生理鹽水，^#P＜0.05vs.泰素.

給藥后，每天給小鼠稱重一次，繪制荷瘤小鼠體重變化曲線見圖5，圖5中各標(biāo)識所指代的實(shí)驗(yàn)組如下：

1—生理鹽水，2—泰素(紫杉醇的市售制劑)，3—泰素+維拉帕米，

4—泰素+CR偶聯(lián)物，5—載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束。

由圖5可知，載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束組小鼠體重一直處于增加狀態(tài)，較泰素組、泰素+維拉帕米組體重增加明顯(P＜0.05)，說明荷瘤小鼠在經(jīng)過載紫杉醇的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物膠束治療后，不僅腫瘤生長得到抑制，并且生長狀態(tài)得到改善，在提高紫杉醇的抗腫瘤效應(yīng)的同時還能減輕紫杉醇帶來的毒副作用。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、具有增溶作用，能增加紫杉醇溶解度，同時也增加大黃酸溶解度；

2、促進(jìn)藥物即紫杉醇的口服吸收；

3、形成納米膠束，遞送抗腫瘤藥物，提高藥效；

4、具有增強(qiáng)紫杉醇抗腫瘤作用；

5、可作為前藥：大黃酸本身有抗腫瘤作用，當(dāng)CR偶聯(lián)物在體內(nèi)酰胺鍵斷裂后可釋放出大黃酸。

本發(fā)明由羧甲基殼聚糖和大黃酸構(gòu)成高分子偶聯(lián)物，是兩親性高分子聚合物，能在水性溶液中自組裝成納米膠束，包載紫杉醇，增加紫杉醇的水溶性，解決紫杉醇水溶性差的問題，并減少紫杉醇對胃腸道的損傷；借助羧甲基殼聚糖口服促吸收作用，及大黃酸保護(hù)腸粘膜作用，促進(jìn)紫杉醇在腸道的吸收，提高紫杉醇的口服生物利用度，并減少對胃腸道的刺激；大黃酸抗腫瘤與紫杉醇協(xié)同作用、并能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，提高腫瘤細(xì)胞的敏感度，該羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物形成的納米膠束對紫杉醇在體內(nèi)的傳遞和EPR效應(yīng)被動靶向腫瘤。綜合以上，羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物作為一個功能性口服促吸收的輔料，對紫杉醇等水溶性差、滲透性差的抗腫瘤藥物起到口服遞送、提高其抗腫瘤效果的作用。