專利名稱：：丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測丙型肝炎病毒基因型的試劑盒，特別是涉及使用核酸反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，制備一種丙型肝炎病毒基因型檢測的試劑盒，用于快速準(zhǔn)確地區(qū)分臨床血液樣品中丙型肝炎病毒基因型。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)是嚴(yán)重危害人類健康的肝炎病毒之一，是重要的肝臟疾病致病因子。目前，全球有超過L7億人感染HCV，其中每年有超過10萬例HCV患者發(fā)展為肝癌，進(jìn)而出現(xiàn)消化道出血及腹水。根據(jù)WHO2002年年報(bào)，在2001年，慢性肝病引起1,400萬例死亡，包括79.6萬例由肝硬化引起、61.6萬例由原發(fā)性肝癌引起。而在2001年，因慢性肝病引起死亡的病例中就有20%(超過2.8萬)是由HCV感染引起。目前已經(jīng)有大量病例可以證明在大多數(shù)國家由肝癌引起的死亡數(shù)量的增加是由于丙型肝炎感染造成。丙型肝炎病毒是一種正性單鏈RNA黃病毒，包括9,400左右個(gè)核苷酸。HCV基因組具有一個(gè)單獨(dú)的開放閱讀框，編碼一具有3,010個(gè)氨基酸的多聚蛋白體，翻譯后被分為病毒復(fù)制和病毒粒形成所必須的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV具有高度的變異性(其變異率高達(dá)1.4-1.9X1(T3/核苷酸/年)和本身具有負(fù)選擇作用的特征，高突變是由于復(fù)制酶無校正功能；易誤性RDRP(error-proneRDRP,EP-RDRP)的存在以及正選擇作用等原因。而其本身具有負(fù)選擇作用又表現(xiàn)為病毒基因組中各種基因結(jié)構(gòu)及功能不同，有些區(qū)域高度保守。根據(jù)全世界不同地區(qū)分離的HCV不同株的全部或部分基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析，HCV至少可分為6型(HCV1—6型)，各型又分許多亞型(如la、lb、2a、2b等)。各型核酸序列之間相差31—34%，氨基酸序列相差大約30%,而亞型序列之間相差約20—23%。有幾種HCV病毒株主要從東南亞被分離出，被命名為HCV7，8，9，10，ll型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系統(tǒng)進(jìn)化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。目前對HCV基因分型方法主要有限制性長度多態(tài)性(RFLP)，型特異性引物PCR，型特異性探針核酸雜交分析，直接測序等方法，但是這些方法大多存在操作繁瑣，檢測時(shí)間長，價(jià)格昂貴，靈敏度低，特異性不高等缺點(diǎn)，不適合廣大基層醫(yī)院開展。因此本發(fā)明人結(jié)合已知的PCR-斑點(diǎn)雜交方法，制備了一種短時(shí)間內(nèi)檢測丙型肝炎基因型的試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及檢測臨床生物樣品中丙型肝炎病毒基因型的試劑盒，特別是提供了一種利用核酸反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速準(zhǔn)確的區(qū)分臨床血液樣品中丙型肝炎病毒基因型的試劑盒。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測臨床生物樣品中丙型肝炎病毒基因型的試劑盒，該試劑盒包括(1)待檢血清樣品RNA的提取試劑(2)逆轉(zhuǎn)錄試劑；(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑；(4)雜交膜及反向斑點(diǎn)雜交反應(yīng)試劑。其特征在于丙型肝炎(HCV)病毒核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物5'-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3'(SEQIDNO:l)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系中使用的上游和下游引物分別為PCR上游引物5'-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT隱3'(SEQIDNO:2)PCR下游引物5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3'(SEQIDNO:3)雜交反應(yīng)中使用的寡核甘酸探針分別是探針I(yè)C:5'-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3'(SEQIDNO:4)探針PC1:5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3'(SEQIDNO:5)探針PC2:5'-CGGAACCGGTGAGTACACC-3'(SEQIDNO:6)探針l:5-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3'(SEQIDNO:7)探針lb-l:5'-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3'(SEQIDNO:8)探針lb-2:5'-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3'(SEQIDNO:9)探針2-l:5'-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG■-3'(SEQIDNO:IO)探針2-2:5'-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3'(SEQIDNO:ll)探針2a-l::5'-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3'(SEQIDNO:12)探針2a-2:-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3'(SEQIDNO:13)探針3-l:5'-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3'(SEQIDNO:14)探針3-2:5'-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3'(SEQIDNO:15)探針3b:5，-CCCGCTCAATGCCCGGAAAT-3，(SEQIDNO:16)探針6:5，-GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3'(SEQIDNO:17)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施優(yōu)選方案，所設(shè)計(jì)的引物和探針是針對國際基因庫Genebank中已經(jīng)發(fā)表的HCV(1-6)，選取高度保守的5'UTR區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施優(yōu)選方案，針對1型的探針與已知的丙肝病毒2，3，4，5，6型相應(yīng)基因組序列差異不少于兩個(gè)堿基。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的待檢血清樣品RNA的提取試劑包括RNA提取液A，RNA提取液B,DEPC水。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的逆轉(zhuǎn)錄(rt)試劑包括逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的聚合酶鏈反應(yīng)試劑是由dNTPs、耐熱Taq酶等組成的PCR反應(yīng)混合液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的雜交反應(yīng)試劑包括雜交液iu.8xssc-o.i%sds)禾nn(o.5xssc-o.i%sds)、溶液i(250u/mi偶聯(lián)辣根過氧化物酶的鏈酶親和素溶液)、II(0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液)、III(2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液)和IV(3%的過氧化氫溶液)、雜交用膜條以及標(biāo)準(zhǔn)對照品。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的檢測是使用帶有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置、恒溫水浴或空氣浴裝置完成的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的標(biāo)記引物的小分子可以是生物素，地高辛等。'根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的基質(zhì)可以是尼龍膜、硝酸纖維素膜醋酸纖維素膜。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的將探針固定在膜條適當(dāng)為位置的方法，包括將探針通過紫外線交聯(lián)，以及用氨基標(biāo)記的探針交聯(lián)EDC(N-乙基-N'-[二甲基氨丙基]-碳二亞胺，Sigma公司)處理過的硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素等固相支持材料。傳統(tǒng)的印跡雜交方法是將靶DNA固定于尼龍膜或硝酸纖維素膜上，用標(biāo)記的探針與待檢靶DNA相互接觸并雜交，顯影或顯色后判定結(jié)果。用這種方法每次雜交反應(yīng)只能檢測一個(gè)待測DNA中是否含有某一種探針的互補(bǔ)序列，即一次只能判斷一種基因型。如果某個(gè)基因座位有多種等位基因(如HLA-A，HLA-B，HLA-DR位點(diǎn))或要檢測多個(gè)耙序列(如地中海貧血突變基因，ABO血型等)，用這種點(diǎn)雜交方法一次性檢測就很繁雜，甚至難以完成。而反向斑點(diǎn)雜交方法則是先設(shè)計(jì)針對各等位基因的特異性探針，并將探針點(diǎn)加到雜交基質(zhì)上，然后再將待測dna樣品(一般是使用5'-端標(biāo)記有生物素或地高辛等分子的引物pcr擴(kuò)增耙DNA片段后的產(chǎn)物)與之雜交，這樣待測樣本就會(huì)與具有互補(bǔ)序列的探針結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的DNA后，即可檢測到特異性結(jié)合的靶序列。因此，使用該方法可一次同時(shí)檢測某一位點(diǎn)的正常及其相關(guān)的多種突變形式，或不同位點(diǎn)的正?；蛲蛔?。為了完成本發(fā)明中所涉及試劑盒對丙型肝炎病毒的分型檢測，首先常規(guī)制備待檢者血液中的丙型肝炎病毒RNA。使用RNA提取試劑盒提取得到丙型肝炎病毒RNA。以此提取得到的RNA作為模板，并用合成的寡核苷酸逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA;然后用通過上述方法得到的cDNA作為模板，并用合成的PCR上游和下游寡核苷酸PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。變性處理所得到的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物后，使之分別與足以揭示不同的丙型肝炎病毒(HCV)基因型和亞型的寡核苷酸探針雜交。最后，根據(jù)雜交產(chǎn)物染色后的顏色變化判斷丙型肝炎病毒(HCV)不同的基因型和基因亞型。現(xiàn)針對本發(fā)明方法的幾個(gè)主要?dú)i驟，分別詳細(xì)描述如下。1、引物探針的設(shè)計(jì)相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)，HCV基因組中5'UTR區(qū)基因序列進(jìn)行分型可體現(xiàn)HCV全基因組分型狀況，本研究根據(jù)己知丙型肝炎病毒(HCV)的序列，比對后選取高度保守的5，UTR區(qū)作為目標(biāo)區(qū)域，設(shè)計(jì)出2條HCV通用探針，l條l型通用探針，2條lb亞型探針，2條2型通用探針，2條2a亞型，2條3型通用探針，l條3b型探針，l條6型探針；通過通用探針可以檢出是否有HCV感染，其它ll條探針則可檢測出具體型別和亞型感染；合成的探針經(jīng)20%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并純化。所有設(shè)計(jì)的型或亞型特異探針，都比其他型或亞型的丙肝病毒基因組全序列至少有兩個(gè)堿基以上的差異。這一設(shè)計(jì)，使得相應(yīng)型別或亞型探針與其他型或亞型丙肝病毒的目的擴(kuò)增片段雜交更為困難，從而最大程度的避免了非特異的產(chǎn)生。2、雜交載體的制備用作雜交載體的膜可以是由硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素等固相支持材料制成的。新合成的探針以適當(dāng)方式固定在膜條的適當(dāng)位置。其中兩條通用探針稀釋成一管，其中PC1濃度為10pmol/ul，PC2濃度為20pmol/yl，將合成一管后液體點(diǎn)至一個(gè)位置，形成通用探針點(diǎn)(PC點(diǎn))，將稀釋好探針點(diǎn)樣并涼干后用NaOH溶液處理膜條并用蒸餾水充分洗滌，然后保存于4'C備用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的適當(dāng)方式，包括將探針通過紫外線交聯(lián)，以及用氨基標(biāo)記的探針交聯(lián)EDC(N-乙基-N，-[二甲基氨丙基]-碳二亞胺，Sigma公司)處理過的硝酸纖維素、尼龍或醋酸纖維素等固相支持材料。3、核酸的提取采用常規(guī)RNA提取液提取人個(gè)體血液樣品中的丙型肝炎病毒RNA。例如，用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22~25°C)放置30~60分鐘或離心后析出血清。吸取上層血清lOOul，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管，并加入20lU充分混勻的的RNA提取液A，再加入400u1的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘，6000rpm，離心1分鐘，小心吸去上清，用75。/。的預(yù)冷乙醇(DEPC水配制)洗沉淀兩次。65攝氏度千燥沉淀IO分鐘。向沉淀管中加入18iU的丙型肝炎逆轉(zhuǎn)錄體系，便可進(jìn)行下一歩的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。4、RNA的逆轉(zhuǎn)錄體系及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化在逆轉(zhuǎn)錄體系及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化過程中，通過比較多個(gè)溫度的條件下逆轉(zhuǎn)錄的效率，優(yōu)化選擇出最佳的逆轉(zhuǎn)錄溫度條件，另外，我們對逆轉(zhuǎn)錄過程中使用的引物及其濃度，以及Mg2+、模板等其他反應(yīng)物的濃度均作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和最佳化。4、核酸擴(kuò)增體系的優(yōu)化在PCR擴(kuò)增中，首先利用降落PCR摸索退火溫度，以及摸索反應(yīng)條件借以提高核酸擴(kuò)增的特異性和高效性。特別是，我們對PCR擴(kuò)增中使用的引物和其濃度、以及Mgh、模板等其他反應(yīng)物的濃度均作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和最佳化。5、反向斑點(diǎn)雜交體系的優(yōu)化反向斑點(diǎn)雜交結(jié)合PCR-斑點(diǎn)印跡雜交技術(shù)和過濾雜交，其操作過程包括例如，首先將如前制備的HCV基因分型膜條放入裝有預(yù)熱雜交液I的2ml離心中，雜交時(shí)，先95'C變性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5分鐘，然后置冰中冷卻2分鐘以上，再在約56r預(yù)熱的雜交液I的存在下，在56'C的水浴搖床中，使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與5'端氨基標(biāo)記的探針雜交約60分鐘。雜交反應(yīng)完成后，經(jīng)洗膜和顯色歩驟以顯示雜交斑點(diǎn)的存在，并根據(jù)所顯色的探針類型來判斷各個(gè)體的基因型。由圖3所示的檢測實(shí)例可以看出，如果顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針4(SEQIDNO:8)和探針5(SEQIDNO:9)中一個(gè)點(diǎn)顯色或者同時(shí)顯色，可判定HCV基因型為lb型；顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針3(SEQIDNO:IO)顯色，可判定HCV基因型為1型；如果顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針6(SEQIDNO:IO)和探針7(SEQIDNO:ll)中一個(gè)點(diǎn)顯色或者同時(shí)顯色，可判定HCV基因型為2型；如果顯色反應(yīng)控制探針1(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針8(SEQIDNO:12)和探針9(SEQIDNO:13)中的一個(gè)點(diǎn)顯色或者同時(shí)顯色，可判定HCV基因型為2a型；如果顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針3(SEQIDNO:7)、探針6(SEQIDNO:IO)和探針10(SEQIDNO:17)也都顯色，可判定HCV基因型為6型；如果顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針ll(SEQIDNO:14)和探針12(SEQIDNO:15)中一個(gè)點(diǎn)顯色或者同時(shí)顯色，可判定HCV基因型為3型；如果顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:4)和探針2(SEQIDNO:5-6)均顯色的同時(shí)，探針13(SEQIDNO:16)也顯色，可判定HCV基因型為3b型；如果有顯色反應(yīng)控制探針l(SEQIDNO:7)和探針2(SEQIDNO:4-6)顯色，說明檢測的病原體為HCV;如果只有顯色反應(yīng)控制探針1(SEQIDNO:4)顯色，其它探針不顯色則說明HCV為陰性或PCR擴(kuò)增失??；如果有各型別探針:l型(3、4、5)、2型(6、7、8、9)、3型(11、12、13)、6型(10)中的型別點(diǎn)一種或幾種型別點(diǎn)同時(shí)顯色，則判斷為混合感染(山于HCV6型——探針10顯色時(shí),均伴有HCV1型——探針3和HCV2型——探針6的顯色，此種情況只能判定為HCV6型，而非混合感染)。(參見圖3)。在顯色反應(yīng)中，使用顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色，例如，使標(biāo)記物生物素與鏈霉素抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶結(jié)合物(POD)特異性結(jié)合，使底物四甲基鏈苯胺(TMB)生成藍(lán)色的沉淀。然后，借助計(jì)算機(jī)圖像分析或肉眼判讀結(jié)果。在雜交顯色過程中，若使用鏈酶親和素偶聯(lián)堿性磷酸酶同樣可以和生物素結(jié)合，并使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸對甲苯胺鹽(BCIP)生成深藍(lán)色沉淀而完成本發(fā)明中的顯色過程。另外，本發(fā)明通過反復(fù)摸索不同的雜交溫度和探針濃度(例如，將雜交溫度設(shè)定在56'C，探針濃度介于5pmol/L20pmol/L)，可使檢測的結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，并具有更好的檢測穩(wěn)定性(可重復(fù)性)。本發(fā)明中，由于發(fā)明人對靶核酸片段的擴(kuò)增體系和雜交體系進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)并合成了特異性強(qiáng)的探針和引物，同時(shí)檢測中使用水浴搖床作為反向點(diǎn)印跡雜交裝置，從而保證了方法的快捷和檢測結(jié)果的可靠性。如前所述，由于反向斑點(diǎn)雜交方法能夠同時(shí)檢測目的基因內(nèi)多個(gè)堿基的突變或多態(tài)性，所以在病原體及復(fù)雜遺傳性疾病的檢測中有著更為簡便的優(yōu)越性。在丙肝的診療中，丙型肝炎病毒基因型慢性肝炎和某些重癥肝病(肝硬化、肝癌等)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，且不同基因型對治療藥物(如a干擾素)也有一定的關(guān)系，因此HCV基因型檢測成為臨床醫(yī)務(wù)工作者研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明的HCV基因型檢測方法顯然可以為丙型肝炎的診斷提供一種快速、簡便、特異性和準(zhǔn)確性均較高的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手段。如前所說，為簡單快速地檢測個(gè)體血液樣品中丙型肝炎病毒(HCV)具體基因型和基因亞型，本發(fā)明提供了相應(yīng)的丙型肝炎病毒(HCV)基因分型反向斑點(diǎn)雜交檢測試劑盒。具體地說，本發(fā)明的試劑盒提供(1)由RNA提取液A、RNA提取液B、DEPC水組成的RNA提取試劑；(1)由逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄反映體系、陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品組成的逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑。(2)包括PCR反應(yīng)混合液(共10管，每管含PCR反應(yīng)緩沖液、Mgcl2(1.6mmol/L)、dNTPs(0.2mmoI/L)、正反向引物(0.1umol/L)，以及Taq酶(3u/lU，l管)的聚合酶鏈反應(yīng)試劑；(3)由常規(guī)的20XSSC、十二烷基磺酸鈉(SDS)、鏈霉素抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶結(jié)合物(POD)組成的雜交檢測試劑，另外還包括用作雜交反應(yīng)載體的膜條10張。本發(fā)明的試劑盒除提供了各位點(diǎn)所對應(yīng)的特異性探針外，還配有顯色反應(yīng)控制探針和標(biāo)準(zhǔn)對照品。本發(fā)明涉及的試劑盒中，由于使用了針對各型別或亞型HCV核酸序列所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增耙核酸序列，并設(shè)計(jì)了顯色對照探針及檢測HCV基因型或基因亞型寡核苷酸探針進(jìn)行核酸雜交分析，所以該試劑盒能夠準(zhǔn)確而有效地鑒別和區(qū)分HCV基因型和亞型。本發(fā)明涉及的試劑盒不僅能用于檢測單一HCV感染，而且能夠定性地檢測HCV的混合感染，從而為丙型肝炎的臨床個(gè)體化治療提供分子病毒學(xué)證據(jù)，為臨床用藥提供有意義的參考。一般說來，使用本發(fā)明中涉及的試劑盒，從樣本的處理到判讀基因型檢測結(jié)果僅需要約10小時(shí)的時(shí)間，與傳統(tǒng)的雜交方法相比，本方法的發(fā)明顯然還具有操作簡單、快速方便的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明的方法和試劑盒特別適用于臨床標(biāo)本的快速檢測和大量樣本的普查。表lHCV基因分型型別判定表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖l顯示所使用的探針在膜條上的排列圖。l號(hào)探針具有SEQIDNO:4所示的序列，為顯色探針，用于控制顯色反應(yīng)的整個(gè)過程；2號(hào)陽性控制探針具有SEQIDNO:5-6所示的序列，為陽性對照探針，如果顯色，則代表所檢測的生物樣本為HCV;3號(hào)探針有SEQIDNO:7所示的序列，為l型特異探針，顯色時(shí)判定為l型；4號(hào)探針具有SEQIDNO:8所示的序列，5號(hào)探針具有SEQIDNO:9所示的序列，均為lb型特異探針，單一或者同時(shí)顯示均判定為lb型；6號(hào)探針具有SEQIDNO:10所示的序列，7號(hào)探針具有SEQIDNO:ll所示的序列，均為2型特異探針，單一或者同時(shí)顯示均判定為2型；8號(hào)探針具有SEQIDNO:12所示的序列，9號(hào)探針具有SEQIDNO:13所示的序列，均為2a型特異探針，單一或者同時(shí)顯示均判定為2a型；IO號(hào)控制探針具有SEQIDNO:17所示的序列，為6型特異型探針，它與3號(hào)和6號(hào)探針同時(shí)顯色時(shí)判定為6型；ll號(hào)控制探針具有SEQIDNO:14所示的序列，12號(hào)控制探針具有SEQIDNO:15所示的序列，均為3型特異探針，單一或者同時(shí)顯示均判定為3型；13號(hào)控制探針具有SEQIDNO:16所示的序列，為3b型特異探針，顯色是判定為3b型。圖2顯示耙DNA擴(kuò)增片段經(jīng)2X的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中第1-6泳道為特異性耙DNA片段(220bp)，M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)志。圖3顯示五種不同基因型樣品的反向斑點(diǎn)雜交檢測結(jié)果。共有9例標(biāo)本的陽性檢測結(jié)果，其中l(wèi)、2、3號(hào)均為1型，1號(hào)為1型，2號(hào)和3號(hào)為lb型；4、5、6號(hào)均為2型，4號(hào)為2型，5號(hào)和6號(hào)為2a型；7號(hào)為3型，8號(hào)為3b型，9號(hào)為6型；(參見表1和圖3)。具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例h樣品靶核酸的制備用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(2225。C)放置30~60分鐘或離心后析出血清。吸取上層血清100tU，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管，并加入20u1充分混勻的的RNA提取液A，再加入400u1的RNA提取液B充分混勻。室溫放置5分鐘，6000卬m，離心1分鐘，小心吸去上清，用75。/。的預(yù)冷乙醇(DEPC水配制)洗沉淀兩次。65攝氏度干燥沉淀10分鐘。向沉淀管中加入18yl的丙型肝炎逆轉(zhuǎn)錄體系，便可進(jìn)行下一歩的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。實(shí)施例2:RNA的逆轉(zhuǎn)錄成cDNA取不含RNase的1.5mL離心管，按19pLX(N+l)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，再加入1^LX(N+l)逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻配制成逆轉(zhuǎn)錄體系，分裝到N(N^寺檢測樣品個(gè)數(shù)+2)個(gè)不含RNase空白0.2mL離心管中，然后向各分裝好逆轉(zhuǎn)錄體系的離心管中加入5iaL制備好的RNA模板，瞬時(shí)(3秒)離心后，將各反應(yīng)管放入PCR儀。按下列條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)4(TC恒溫60分鐘，而后95'C滅活3分鐘，然后4〔恒溫。實(shí)施例3:靶核酸的PCR擴(kuò)增取單管單人份PCR反應(yīng)液若干管，直接加入3ul逆轉(zhuǎn)錄好的cNDA模板，充分混勻，瞬時(shí)(3秒)離心后，將各反應(yīng)管放入PCR儀。按下列條件擴(kuò)增93'C預(yù)變性6分鐘，然后按93tM5秒，57。C45秒，72°C45秒擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，93°C30秒，55°C40秒，72°C45秒擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；最后72'C保溫7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(見附圖2)。實(shí)施例4:七種基因型的樣品反向斑點(diǎn)雜交檢測雜交前，取雜交液I(1.8XSSC-0.1%SDS)與雜交液II混合并預(yù)熱至56。C備用。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物98'C變性處理8分鐘后，置于冰水混合物中放置8-10分鐘。然后取1000yl雜交液l+2yl溶液I(1000:2)混合溶液作為結(jié)合液4。C保存?zhèn)溆?，并取溶液II:溶液III:溶液IV(1900:200:1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液ni+1(^1溶液^/)作為顯色液避光備用。雜交前先將水浴搖床溫度調(diào)至56t:,待水溫恒定后便可進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。首先根據(jù)待檢測樣品的數(shù)目(包括待檢測樣品和陰陽性對照)取相應(yīng)個(gè)數(shù)的2.0mL離心管，向各離心管中加入標(biāo)記好的的單人份膜條，然后向各管分別加入1.5mL預(yù)熱的雜交液I，再將變性后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入離心管中，加樣時(shí)要根據(jù)膜條標(biāo)記加入與之一一對應(yīng)的產(chǎn)物。關(guān)蓋后將離心管放入56'C水浴搖床中，溫育60分鐘，并伴有緩慢搖動(dòng)。棄雜交液I，將膜條放入50mL離心管中，用預(yù)熱好的雜交液II清洗膜條(每個(gè)50mL離心管中約加15mL雜交液n，清洗3次，每次3分鐘)。在室溫下加入結(jié)合液(每個(gè)50mL離心管中約加15mL結(jié)合液)，置于生化搖擺儀上結(jié)合IO分鐘，棄結(jié)合也，加入室溫雜交液I清洗膜條(每個(gè)50mL離心管中約加5mL雜交液I，清洗3次，每次3分鐘)。隨后加入溶液II(每個(gè)50mL離心管中約加15mL)，置于生化搖擺儀上結(jié)合5分鐘，棄溶液II，加入新鮮配制的顯色液(每個(gè)50mL離心管中約加15mL)，顯色大約10分鐘。棄顯色液，用純水洗滌2次，取出膜條，用紙巾吸干，就可以進(jìn)行掃描或直接讀取結(jié)果。由圖3所示的結(jié)果可以看出，發(fā)生特異性雜交的各探針的顯色情況均清晰可見?？筛鶕?jù)附圖一所示的排列格式判讀出單一和混合感染。實(shí)施例4:不同的恒溫裝置進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交檢測。采用配備有多孔濾板和減壓抽吸部件的反向點(diǎn)印跡雜交裝置和空氣浴雜交爐對上述七種不同基因型和基因亞型的樣本進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果同導(dǎo)流雜交儀的檢測結(jié)果一致，說明恒溫水浴和空氣浴裝置同樣可以用來對樣品進(jìn)行檢測。實(shí)施例5:不同基因型樣品的反向斑點(diǎn)雜交基因分型檢測結(jié)果判定使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對400份采自丙型肝炎患者的DNA樣品進(jìn)行HCV基因分型位點(diǎn)檢測，其中380例樣本得以正確的分型。為了進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性，對所有上述400例樣本進(jìn)行了序列測定。結(jié)果表明，使用本發(fā)明的試劑盒檢測的結(jié)果和測序結(jié)果基本吻合，特異性達(dá)95.3%，同時(shí)將標(biāo)本進(jìn)行定量拷貝數(shù)分析，其中有45例為10"copies/ml，4例為103COpieS/ml，均能準(zhǔn)確分型，將高拷貝血清進(jìn)行梯度稀釋后，發(fā)現(xiàn)各型標(biāo)本最低檢出量均可以達(dá)至!JlO"拷貝/ml。序列表<110>中山大學(xué)達(dá)安基閃股份有限公司<120>丙荊肝炎病毒基因分型檢測試劑盒<140><141><160>17<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>1GAGTATGCCCTGAGCCTGAG<210>2<211>22<212>DNA<213>人.T.序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>2TTTTTTTCCCGATCATCAGTTG<210>3<211>21<212>DNA<213>人T:序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>3TttttttCCCGACCACCAGTT<210>4<211>21<212>DNA<2i3>人i:序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>4GCCGTAACCGTCACAATCCGT<210>5<211>18<212>DNA<2i3>人r.序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>5ATTTGGGCGTGCCCCCGC<210>6<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核,酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>6CGGAACCGGTGAGTACACC<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>7CAATGCCTGGAGATTTGGGCG<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>8CCGCGAGACTGCTAGCCG<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>9GCGAGACCGCTAGCCGAGT<210>10<211>21<212>DNA<2i3>人:]:序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>10AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>11GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC<210>12<211>19<212>DNA<213>人T:序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>12GCCGGGAAGACTGGGTCCT<210>13<2">19<212>DNA<2i3>人:r.序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>13CCCACTCTATGCCCGGCCA<210>14<211>19<212>DNA<213>人T.序列<220><223>根據(jù)特定核甘酸序列設(shè)計(jì)，以川作雜交探針。<400>14CCCGCGAGATCACTAGCCG<210>15<211>19<22>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>15AATCGCTGGGGTGACCGGG<210>16<211>20<212>DNA<2i3>人.r.序列<220><223>根據(jù)特定核昔酸序列設(shè)計(jì)，以用作雜交探針。<400>16CCCGCTCAATGCCCGGAAAT<210>17<21>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以W作雜交探針。<400>17GACCGGGTCCTTTCCATTGG權(quán)利要求1、一種用于檢測丙型肝炎病毒基因型的試劑盒，該試劑盒包括:(1)RNA提取試劑；(2)逆轉(zhuǎn)錄試劑；(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑；(4)雜交膜及反向斑點(diǎn)雜交反應(yīng)試劑，其特征在于試劑盒所應(yīng)用的引物分別為:逆轉(zhuǎn)錄(RT)引物:5′-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3′(SEQIDNO:1)PCR上游引物:5′-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT-3′(SEQIDNO:2)PCR下游引物:5′-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3′(SEQIDNO:3)。2、根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于所使用的寡核苷酸探針為探針I(yè)C:5'-GCCGTAACCGTCACMTCCGT-3'(SEQIDNO:4)探針PC1:5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3'(SEQIDNO:5)探針PC2:5'-CGGAACCGGTGAGTACACC-3'(SEQIDNO:6)探針l:5'-CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3'(SEQIDNO:7〉探針lb-l:5'-CCGCGAGACTGCTAGCCG-3'(SEQIDNO:8)探針lb-2:5'-GCGAGACCGCTAGCCGAGT-3'(SEQIDNO:9)探針2-l:5'-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG-3'{SEQIDNO:10)探針2-2:5'-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3'(SEQIDNO:11)探針2a-1:5'-GCCGGGAAGACTGGGTCCT-3'(SEQIDNO:12)探針2a-2:5'-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3'(SEQIDNO:13)探針3-1:5'-CCCGCGAGATCACTAGCCG-3'(SEQIDNO:14)探針3-2:5'-AATCGCTGGGGTGACCGGG-3'(SEQIDNO:15)探針3b:5'-CCCGCTCAATGCCCGGAAAT-3'(SEQIDNO:16)探針6:5'-GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3'(SEQIDNO:17)。3、根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于標(biāo)記引物的小分子選自于生物素、地高辛等。全文摘要本發(fā)明涉及檢測丙型肝炎病毒基因型的試劑盒，特別是涉及使用核酸反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，制備一種丙型肝炎病毒基因型檢測的試劑盒，用于快速準(zhǔn)確地區(qū)分臨床血液樣品中丙型肝炎病毒基因型。文檔編號(hào)G01N33/50GK101377486SQ20071002994公開日2009年3月4日申請日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者何蘊(yùn)韶,明李,敏王,王會(huì)龍,鋼程,麗馬申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司