一種丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種丙型肝炎病毒基因分型檢測的試劑盒，可用于檢測國內(nèi)發(fā)生的丙型肝炎病毒的1a、1b、2a、2b、3a、3b和6a型別感染的輔助診斷。本發(fā)明采用尼龍膜載體，針對HCV不同基因型設(shè)計寡核苷酸探針，制備成基因芯片，再配以PCR引物以及其他組分，可以快速準(zhǔn)確對血液樣品中丙型肝炎病毒進(jìn)行分型。本發(fā)明的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、高通量的特點，一次雜交反應(yīng)可以檢測多種靶序列，取材方便，無需特殊設(shè)備，儀器投入低，具有快速簡便、敏感度高和特異性強(qiáng)的特點。
【專利說明】—種丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測技術(shù)，尤其涉及一種丙型肝炎病毒基因分型檢測的試劑盒，用于檢測國內(nèi)發(fā)生的丙型肝炎病毒的la、lb、2a、2b、3a、3b和6a型別感染的輔助診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎呈世界性分布，人群普遍易感，是嚴(yán)重危害人類健康、流行范圍廣泛的傳染病，其病原體為丙型肝炎病毒(h印atitis C virus，HCV)。目前，其感染率為0.1 %-10%，平均為3%。全球有超過1.7億人感染HCV，其中每年有超過10萬例HCV患者發(fā)展為肝癌，進(jìn)而出現(xiàn)消化道出血及腹水。根據(jù)WH02002年年報，在2001年，慢性肝病引起1400萬例死亡，包括79.6萬例由肝硬化引起、61.6萬例由原發(fā)性肝癌引起。HCV是正性單鏈RNA病毒，包括9400左右核苷酸數(shù)目。HCV基因組具有一個單獨的開放閱讀框，基因結(jié)構(gòu)由5’-NCR-C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3’組成，編碼一具有3010個氨基酸的多聚蛋白體，翻譯后被分為病毒復(fù)制和病毒粒形成所必須的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV具有高度的變異性和本身具有負(fù)選擇作用的特征，高突變是由于復(fù)制酶無校正功能；易誤性RDRP(error-proneRDRP, EP-RDRP)的存在以及正選擇作用等原因。而其本身具有負(fù)選擇作用又表現(xiàn)為:病毒基因組中各種基因結(jié)構(gòu)及功能不同，有些區(qū)域高度保守。根據(jù)全世界不同地區(qū)分離的HCV不同株的全部或部分基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析，HCV分為6種主要的基因型(以1-6表示)，各型又分亞型(以a、b、c等表示)。HCV亞型已經(jīng)超過100個，其中最常見的是la，lb，2a，2b，3a，3b，6a，各型核酸序列之間相差31 — 34%，氨基酸序列相差大約30%，而亞型序列之間相差約20 — 23%。有幾種HCV病毒株主要從東南亞被分離出，被命名為HCV7，8，9，10，11型，除了 HCVlOa型(目 前被列入HCV3型)，由于其系統(tǒng)進(jìn)化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。
[0003]研究表明，HCV不同型別之間對干擾素治療的敏感度不一，特別是I型較其它型別敏感度尤為差。不同型別HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原發(fā)性肝癌發(fā)生率都有不同，HCV基因型與丙型肝炎患者臨床病情及其嚴(yán)重程度密切相關(guān)。鑒于不同HCV基因型感染者的臨床表現(xiàn)、肝病嚴(yán)重程度及慢性化病程進(jìn)展均有差異，抗病毒治療的效果也不同。因此檢測HCV基因型有助于判斷治療的難易程度、制定個體化抗病毒治療方案。
[0004]目前對HCV基因分型方法主要有:限制性長度多態(tài)性分析法(RFLP)，基因型特異性引物PCR法，基因型特異性探針核酸雜交分析法，直接測序法等方法，但是這些方法大多存在操作繁瑣，對設(shè)備要求高，檢測時間長，通量低，還存在靈敏度低，特異性不高等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測的時間短、通量高、靈敏度高、特異性高的HCV基因分型的試劑盒。[0006]為解決上述問題，本發(fā)明公開一種丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，一種丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液和DNA雜交膜條，所述DNA雜交膜條包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為分別與丙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示:
[0007]針對HCVla 型設(shè)計探針 Yl:5’ -GCAGGGGCCCTAGATTGGGT-3’ ；
[0008]針對HCVlb 型設(shè)計探針 Y2:5’ -CGTGGAAGGCGACAACCTA-3’ ；
[0009]針對HCVlb 型設(shè)計探針 Y3:5’ -AACCTCGTGGAAGGCGACAACC-3’ ；
[0010]針對HCV2a 型設(shè)計探針 Y4:5’ -ATTGCCGGGAAGACTGGGTC-3’ ；
[0011]針對HCV2a 型設(shè)計探針 Y5:5 ’ -ACTTCGGAGCGGTCCCA-3 ’ ；
[0012]針對HCV2b 型設(shè)計探針 Y6:5’ -CAGCCCATCCCGAAAGATCGG-3’ ；
[0013]針對HCV2b 型設(shè)計探針 Y7:5’ -GAATTACCGGAAAGACTGGGT-3’ ；
[0014]針對HCV3a 型設(shè)計探針 Y8:5’ -AATCGCTGGGGTGACCGG-3’ ；
[0015]針對HCV3a 型設(shè)計探針 Y9:5 ’ -TCTGAACGGTCACAGCCTC-3 ’ ；
[0016]針對HCV3a 型設(shè)計探針 YlO:5’ -CCCGCGAGATCACTAGCC-3’ ； [0017]針對HCV3b 型設(shè)計探針 Yll:5’ -CGCTCAATGCCCGGAAATT-3’ ；
[0018]針對HCV6a 型設(shè)計探針 Y12:5’ -GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3’ ；
[0019]針對HCV6a 型設(shè)計探針 Y13:5’ -GAGCGATCCCAGCCCAGAG-3’ ；
[0020]針對HCV6a 型設(shè)計探針 Y14:5’ -GAACGGTCCCAGCCCAGAG-3’ ；
[0021]針對HCV1-6 型設(shè)計通用探針 Y15:5’ -TTGGGTGTGCGCGCGAC-3’ ；
[0022]陰性探針HN: 5 ’ -GGTCCTGTTTAACTGGCG-3 ’ ；
[0023]所述探針5’端進(jìn)行氨基標(biāo)記以與尼龍膜偶聯(lián)。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的HCV檢測探針的設(shè)計在臨床大樣本驗證下，靈敏度為(真陽性率)99.00%，特異度(真陰性率)為100%，準(zhǔn)確度為99.63%，假陽性率為0，假陰性率為1.00%，具有靈敏度高、特異性高、準(zhǔn)確性高、零假陽性率、低假陰性率、診斷一致性極好的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1:本發(fā)明的HCV探針在尼龍膜上的排列示意圖；
[0026]圖2 =HCVla型病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖；
[0027]圖3:HCV2a型病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖；
[0028]圖4:HCV3a型病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖；
[0029]圖5:HCV6a型病毒樣本檢測結(jié)果掃描圖。
【具體實施方式】
[0030]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附圖詳予說明。
[0031]本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于:設(shè)計具有聞特異性的探針序列，從引物擴(kuò)增和探針特異性識別的根源上保證HCV檢測的高靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性。
[0032]本發(fā)明公開一種丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液和DNA雜交膜條，所述DNA雜交膜條包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為分別與丙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示:
[0033]針對HCVla 型設(shè)計探針 Yl:5’ -GCAGGGGCCCTAGATTGGGT-3’ ；
[0034]針對HCVlb 型設(shè)計探針 Y2:5’ -CGTGGAAGGCGACAACCTA-3’ ；
[0035]針對HCVlb 型設(shè)計探針 Y3:5’ -AACCTCGTGGAAGGCGACAACC-3’ ；
[0036]針對HCV2a 型設(shè)計探針 Y4:5’ -ATTGCCGGGAAGACTGGGTC-3’ ；
[0037]針對HCV2a 型設(shè)計探針 Y5:5’ -ACTTCGGAGCGGTCCCA-3’ ；
[0038]針對HCV2b 型設(shè)計探針 Y6:5’ -CAGCCCATCCCGAAAGATCGG-3’ ；
[0039]針對HCV2b 型設(shè)計探針 Y7:5’ -GAATTACCGGAAAGACTGGGT-3’ ；
[0040]針對HCV3a 型設(shè)計探針 Y8:5’ -AATCGCTGGGGTGACCGG-3’ ；
[0041 ]針對 HCV3a 型設(shè)計探針 Y9:5 ’ -TCTGAACGGTCACAGCCTC-3 ’ ；
[0042]針對HCV3a 型設(shè)計探針 YlO:5’ -CCCGCGAGATCACTAGCC-3’ ；
[0043]針對HCV3b 型設(shè)計探針 Yll:5’ -CGCTCAATGCCCGGAAATT-3’ ；
[0044]針對HCV6a 型設(shè)計探針 Y12:5’ -GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3’ ；
[0045]針對HCV6a 型設(shè)計探針 Y13:5’ -GAGCGATCCCAGCCCAGAG-3’ ；
[0046]針對HCV6a 型設(shè)計探針 Y14:5’ -GAACGGTCCCAGCCCAGAG-3’ ；
[0047]針對HCV1-6 型設(shè)計通用探針 Y15:5’ -TTGGGTGTGCGCGCGAC-3’ ；
[0048]陰性探針HN: 5，-GGTCCTGTTTAACTGGCG-3 ’ ；
[0049]所述探針5’端進(jìn)行氨基標(biāo)記以與尼龍膜偶聯(lián)。
[0050]所述通用探針Y15即陽性探針HP。
[0051]從上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明采用反向點雜交技術(shù)(ReverseDot Blot，RDB)，用尼龍膜作為固相載體，針對HCV不同基因型設(shè)計的特異性寡核苷酸探針，將HCV各特異性探針以圓點的方式固定在膜條上，制備成DNA雜交膜條，以生物素標(biāo)記引物，擴(kuò)增待檢樣本的目的核酸片斷，獲得帶有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物；再與固定各種寡核甘酸探針的膜條雜交，通過酶聯(lián)反應(yīng)和顯色，掃描后以專業(yè)的斑點分析軟件對圖像進(jìn)行識別、去除背景、進(jìn)行客觀的信號值分析，從而判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有針對各種寡核甘酸探針的基因序列，在結(jié)果判斷中減少了人為識別的主觀性因素，更適用于臨床檢測應(yīng)用。
[0052]本發(fā)明針對HCV不同型別的基因序列，設(shè)計一套特異性寡核苷酸探針(如表1所示為寡核苷酸探針序列以及所檢測的型別)，采用自動點樣儀，將探針印制在一張尼龍膜的特定區(qū)域，根據(jù)顯色位點的不同來判斷HCV的型別。
[0053]在上述的DNA雜交膜條的基礎(chǔ)上再配以其它必要的組份，如PCR引物(如表2所示為本發(fā)明所用的引物序列)，即組成完整的產(chǎn)品。在實際檢測時，取提取的HCV核酸樣本溶液，采用生物素標(biāo)記引物和不對稱PCR方法，擴(kuò)增出可能存在的HCV基因組生物素標(biāo)記靶標(biāo)片段。取DNA雜交膜條一張，加入PCR產(chǎn)物45 μ L進(jìn)行雜交，雜交溫度設(shè)定為45°C，雜交時間60分鐘，經(jīng)過雜交-洗滌-顯色。取出膜條晾干，放入掃描儀進(jìn)行掃描，使用分析軟件對掃描圖像信號進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換處理，并分析產(chǎn)生樣本HCV型別結(jié)果。
[0054]根據(jù)本發(fā) 明的另一個優(yōu)選實施方案，在用于樣本擴(kuò)增的PCR體系中引入了內(nèi)參引物，以及內(nèi)參模板，并在膜條制備時引入了可與內(nèi)參模板進(jìn)行雜交的探針，可以對PCR過程進(jìn)行有效質(zhì)量控制。[0055]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案，在制備膜條時引入了顯色控制探針(CC)，即在探針的一端標(biāo)記-NH2，以與尼龍膜偶聯(lián)，另一端引入生物素標(biāo)記，可直接進(jìn)行顯色。CC的引入可以對顯色過程進(jìn)行有效質(zhì)量控制。
[0056]根據(jù)本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案，DNA雜交膜條的片基載體可以是玻片、尼龍膜或其它可以附著探針的載體。
[0057]表1
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液和DNA雜交膜條，其特征在于，所述DNA雜交膜條包括尼龍膜，所述尼龍膜上固定有探針，所述探針為分別與丙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸雜交的核苷酸，所述探針序列如下所示: 針對 HCVla 型設(shè)計探針 Yl:5’ -GCAGGGGCCCTAGATTGGGT-3’ ； 針對 HCVlb 型設(shè)計探針 Y2:5’ -CGTGGAAGGCGACAACCTA-3’ ； 針對 HCVlb 型設(shè)計探針 Y3:5’ -AACCTCGTGGAAGGCGACAACC-3’ ； 針對 HCV2a 型設(shè)計探針 Y4:5’ -ATTGCCGGGAAGACTGGGTC-3’ ； 針對 HCV2a 型設(shè)計探針 Y5:5’ -ACTTCGGAGCGGTCCCA-3’ ； 針對 HCV2b 型設(shè)計探針 Y6:5’ -CAGCCCATCCCGAAAGATCGG-3’ ； 針對 HCV2b 型設(shè)計探針 Y7:5’ -GAATTACCGGAAAGACTGGGT-3’ ； 針對 HCV3a 型 設(shè)計探針 Y8:5’ -AATCGCTGGGGTGACCGG-3’ ； 針對 HCV3a 型設(shè)計探針 Y9:5’ -TCTGAACGGTCACAGCCTC-3’ ； 針對 HCV3a 型設(shè)計探針 YlO:5’ -CCCGCGAGATCACTAGCC-3’ ； 針對 HCV3b 型設(shè)計探針 Yll:5’ -CGCTCAATGCCCGGAAATT-3’ ； 針對 HCV6a 型設(shè)計探針 Y12:5’ -GACCGGGTCCTTTCCATTGG-3’ ； 針對 HCV6a 型設(shè)計探針 Y13:5’ -GAGCGATCCCAGCCCAGAG-3’ ； 針對 HCV6a 型設(shè)計探針 Y14:5’ -GAACGGTCCCAGCCCAGAG-3’ ； 針對 HCV1-6 型設(shè)計通用探針 Y15:5’ -TTGGGTGTGCGCGCGAC-3’ ；
陰性探針 HN: 5’ -GGTCCTGTTTAACTGGCG-3’ ； 所述探針5’端進(jìn)行氨基標(biāo)記以與尼龍膜偶聯(lián)。
2.如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括擴(kuò)增丙型肝炎病毒各種亞型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示: 逆轉(zhuǎn)錄引物 RT:5’ -GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ；
上游引物 Fl:5’ -GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ；
下游引物 Rl:5’ -CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’ ；
上游引物 F2:5’ -TGGTCAGATCGTYGGYGGAGT-3’ ；
下游引物 R2:5’ -ACGAGCGGAATGTACCCCATGAG-3’ ； 所述下游引物R1、R2的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求2所述的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述上游引物F2中Y為簡并引物，所述Y = T/C。
4.如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述尼龍膜上還設(shè)置有顯色控制探針CC，所述顯色控制探針CC序列如下所示:5’ -GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述顯色控制探針CC的5’端進(jìn)行氨基標(biāo)記，3’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液還包括內(nèi)參系統(tǒng)，所述內(nèi)參照系統(tǒng)為擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)，所述內(nèi)參照系統(tǒng)包括: 內(nèi)參引物 F:5’ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3，；
內(nèi)參引物 R:5’ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3’ ；
內(nèi)參探針 PC:5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’ ；所述內(nèi)參引物F的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述探針濃度為 5-20 μ Mo
7.如權(quán)利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液還包括10倍PCR緩沖液 、25mM MgC12、10mM dNTP和酶類，所述酶類為逆轉(zhuǎn)錄酶或Taq酶。
【文檔編號】C12Q1/70GK103966363SQ201410208083
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】彭春梅, 謝佐福, 姚銘鋒 申請人:福州泰普生物科學(xué)有限公司