高效合成s-腺苷同型半胱氨酸的雙酶體系及其應用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域；具體涉及分子生物技術(shù)、基因工程、酶工程、制藥工程等【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體涉及極耐熱性重組酶的高效表達和酶學定性，以及應用這些酶在高溫的反應條件下高效生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的方法。SAH是一類有效的鎮(zhèn)靜劑和抗病毒因子。本發(fā)明的要點包括：（1）發(fā)現(xiàn)海棲熱袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的最適反應條件和最高催化活性，為SAH的酶法生產(chǎn)獲得活性和穩(wěn)定性俱佳的酶種；（2）將SAH合成反應與輔酶再生反應相偶聯(lián)，建立高效生產(chǎn)SAH的雙酶系統(tǒng)與技術(shù)；（3）用重組海棲熱袍菌乳酸脫氫酶作輔酶再生反應催化劑，實現(xiàn)主體產(chǎn)物的高產(chǎn)低消耗；（4）根據(jù)海棲熱袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的性質(zhì)建立高效生產(chǎn)SAH的獨特的工藝條件。
【專利說明】高效合成S-腺苷同型半胱氨酸的雙酶體系及其應用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域；具體涉及分子生物技術(shù)、基因工程、酶工程、制藥工程等【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體涉及極耐熱性重組酶的高效表達和酶學定性，以及應用這些酶在高溫下高效生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)是一種氨基酸衍生物，在生物體內(nèi)與抗病性相關(guān)，是對相關(guān)病理障礙進行早期診斷的重要指標。外源SAH有鎮(zhèn)靜劑作用，是有效的安眠藥和抗驚厥藥物，同時也是I種抗病毒因子。隨著SAH在醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛研究與應用，其高效生產(chǎn)制備技術(shù)也備受關(guān)注。
[0003]SAH可通過化學方法進行合成，但化學合成方法存在生產(chǎn)條件苛刻，污染環(huán)境等缺陷。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)能夠催化腺苷和同型半胱氨酸的合成反應，有效地產(chǎn)生SAH ;通過酶法制備SAH可提高生產(chǎn)的可操作性和簡化產(chǎn)物的下游加工過程。但是，已報道的SAHase的活性和穩(wěn)定性都不能滿足生產(chǎn)的要求。
[0004]極端嗜熱微生物產(chǎn)生的一類熱穩(wěn)定性酶的高溫酶，在酶的生產(chǎn)和應用過程中克服了中溫酶(20°C -65°C)及 低溫酶(2°C -20°C)易于失活的難題，從而極大地降低酶的應用成本，提高生產(chǎn)效率。同時，高溫酶基因在常溫菌細胞內(nèi)重組表達后，可通過熱處理的方式使宿主細胞的蛋白變性，重組酶得到快速分離純化。用高溫酶在較高的溫度下進行生物合成或加工，還有助于提高底物或產(chǎn)物的溶解性，從而加快反應速度、提高產(chǎn)物提取效率。此前，國際上發(fā)表過I篇關(guān)于海棲熱袍菌SAHase的研究論文(Lozada-Ramirez et al.2013,Appl Biochem Biotechnol 170(3): 639-653)。該文作者沒有發(fā)現(xiàn)該酶需要輔酶參與催化反應，所報道的SAHase最高活性只有2.45 U/mg，最適反應條件為75°C，pH 6.5 ；pH 7.0時酶的活性下降約50%，pH 8.0時活性很低，并且在其設定的反應條件下該酶的穩(wěn)定性極差。
[0005]SAHase是一種NAD依賴型酶，在反應過程中需要要消耗大量MD。由于輔酶的價格高穩(wěn)定性差，并且，隨著輔酶由底物型態(tài)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物型態(tài)，反應方向逐漸逆轉(zhuǎn)，表觀反應速度逐漸停止。因此，輔酶依賴型酶的實際應用，除了必須有合適的酶和反應工藝以外，還需要有效地解決輔酶再生問題。通過雙酶的偶聯(lián)反應，人們有望建立輔酶循環(huán)再生體系，達到降低成本和維持快速反應的目的。本實驗室研究了海棲熱袍菌來源的乳酸脫氫酶的酶學性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該酶具有極高的穩(wěn)定性，在寬廣的溫度和PH值范圍內(nèi)保持較高活性，在NAD再生中具有很大的應用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明的目的:
為了解決現(xiàn)有SAH制備方法中酶的活性低，穩(wěn)定性差，NAD消耗快，過程復雜等問題，本發(fā)明研制I種用于合成SAH的高活性的高溫酶，并利用極耐熱性乳酸脫氫酶進行NAD再生，建立高效生產(chǎn)SAH的雙酶體系。[0007]技術(shù)關(guān)鍵:
從海棲熱袍菌中克隆出編碼S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶的基因并將其分別插入具有自主知識產(chǎn)權(quán)的熱激表達載體PHsh質(zhì)粒(美國專利US 7，807，460 B2)，在大腸桿菌中進行超量表達產(chǎn)生極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶；對這兩種酶分別進行純化和酶學性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)它們具有很強的活性和匹配性；隨后，運用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶建立一個高效的SAH的雙酶合成方法。
[0008]技術(shù)方案:
(1)從海棲熱袍菌中克隆出編碼S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反應的酶如乳酸脫氫酶的編碼基因并將其分別插入熱激載體pHsh構(gòu)建表達質(zhì)粒pHsh-saAase,和pHsh-lc/? ο
[0009](2)對表達質(zhì)粒中的目標基因的序列進行優(yōu)化，使目標酶在大腸桿菌細胞中實現(xiàn)超量表達；將優(yōu)化后的基因表達質(zhì)粒導入大腸桿菌，通過熱激誘導進行表達。
[0010](3)對重組的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和催化NAD再生反應的酶如乳酸脫氫酶等進行分離純化(圖1)。
[0011](4)對分離純化后的各種酶分別進行酶學性質(zhì)的鑒定，(圖2、3)。
[0012](5)建立用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶制備SAH的單酶合成系統(tǒng)及反應條件。
[0013](6)以海棲熱袍菌來源的極耐熱性的酶如乳酸脫氫酶等構(gòu)建高效的輔酶再生系統(tǒng)，與S-腺苷同型半胱 氨酸水解酶聯(lián)用(圖4)，提高SAH的合成速度并延長反應周期(圖5)。
[0014]本發(fā)明可取得的有益效果:
本發(fā)明的關(guān)鍵有益效果包括:
(O首次發(fā)現(xiàn)海棲熱袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的最適反應依賴于NAD的濃度、揭示的最高活性比過去報道的活性提高15倍，為SAH的酶法生產(chǎn)獲得活性和穩(wěn)定性俱佳的酶種；
(2)以pHsh為表達載體使極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的產(chǎn)量達到最高水平，為SAH的酶法生產(chǎn)獲得可靠的酶源；
(3)為S-腺苷同型半胱氨酸水解酶配置NAD再生系統(tǒng)，并應用海棲熱袍菌來源的極耐熱性酶建立高效的輔酶循環(huán)系統(tǒng)，使SAH的產(chǎn)量得到大幅度提高；
(4)發(fā)現(xiàn)并證明海棲熱袍菌產(chǎn)生的乳酸脫氫酶在NAD再生反應中是高活性高效率的優(yōu)選酶種。
[0015](5)確立了獨特的高產(chǎn)SAH的工藝條件:pH≤8.0、溫度≤80°C、底物腺苷濃度≤20毫摩爾、NAD濃度≤I毫摩爾。
[0016]【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1.重組的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶的表達效果圖。
[0018]圖2.重組的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶學性質(zhì)。
[0019]圖3.重組的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和乳酸脫氫酶酶在最優(yōu)生產(chǎn)條件下的穩(wěn)定性。[0020]圖4.雙酶法制備S-腺苷同型半胱氨酸過程示意圖。
[0021]圖5.雙酶法制備S-腺苷同型半胱氨酸。
[0022]
【具體實施方式】:
本發(fā)明中所用術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面的方法結(jié)合具體實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細的描述本發(fā)明。應理解實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0023]本發(fā)明所用材料與常規(guī)技術(shù)包括:
(I)菌株及質(zhì)粒:海棲熱袍桿菌maritima MSB8購自美國菌種保存中心，編號為ATCC43589 ;質(zhì)粒pHsh由仙奕生物科技(南京)有限公司(Shine E Biotech,Nanjing, China)提供。
[0024](2)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件.Μ.coli培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子的選擇用含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基，重組酶最高產(chǎn)量測定用含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的TB培養(yǎng)基。電轉(zhuǎn)化用SOC培養(yǎng)基。
[0025](3)其他常規(guī)DNA操作方法:實驗中所使用的T4 DNA連接酶購自NEB公司，PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、PrimeSTAR? max DNA聚合酶、DNA分子量Marker等常規(guī)試劑均購自大連Takara生 物公司，DNA片段割膠回收中所用QG、PE試劑購自Qiagen公司。PCR反應和DNA片段連接反應均按照相應說明書要求操作?；蛐蛄械臏y定由上海美吉生物公司完成。
[0026]實例1.海棲熱袍菌來源的SAHase和LDH的克隆表達和純化 (I)極耐熱性SAHase和LDH基因的克隆
海棲熱袍菌基因組的提取、PCR擴增、DNA的分離、純化、酶切、連接、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化等基因操作按《分子克隆手冊》第三版上的標準方法進行。
[0027](2)極耐熱性SAHase和LDH基因在大腸桿菌中的超量表達
分別以重組質(zhì)粒pHsh-saAase和pHsh-7t/A轉(zhuǎn)化萬.coli BL21中，在30°C培養(yǎng),挑取單菌落接入含0.1 mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于30°C震蕩培養(yǎng)至OD6tltl達到0.6-1.0，將試管移入42°C水浴搖床誘導基因表達，繼續(xù)培養(yǎng)2-6 h，用超聲波破碎細胞，離心去除細胞碎片。
[0028](3)極耐熱性SAHase和LDH重組酶的純化
重組SAHase的純化:按上述方法進行大體積培養(yǎng)細胞并進行誘導表達，將離心收集的細胞用咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(pH 8.0)重懸，經(jīng)高壓細胞破碎儀破碎細胞，13 000g離心15 min，取上清液于80°C熱處理I h后，13 000 g離心15 min，離心上清液過鎳離子柱(親和層析)，經(jīng)100 mM咪唑，0.2 M氯化鈉，和20 mM Tris - HCl緩沖液(pH 7.9)洗脫，所獲得的重組酶達到電泳純。
[0029]重組LDH的純化:將離心收集的細胞用咪唑鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液(pH 8.0)重懸，經(jīng)高壓細胞破碎儀破碎細胞，13 000 g離心15 min，取上清于80°C熱處理I h后，13 000g離心15 min,離心上清液經(jīng)過陰離子交換層析,重組酶達到電泳純。
[0030]實例2.酶活性測定
(I) S-腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的測定以腺苷和同型半胱氨酸為底物，采用HPLC法測定反應體系中SAH的生成量。I mL反應液中含有I mM的腺苷，2 mM的同型半胱氨酸，I mM的NAD，50 mM的Tris-HCl (pH 8.0)。加入適量酶液，于85 °C反應20 min后，迅速移至冰浴中終止反應。用HPLC在260 nm處檢測SAH的生成量。SAHase酶活單位定義:每分鐘生成SAH I μ mo I所需要的酶量定義為一個活性單位。用SAH作標準曲線。
[0031](2)乳酸脫氫酶酶活性測定
LDH活性測定采用分光光度法，以丙酮酸鈉和NADH為底物，測定反應體系中NADH的下降量。反應體系為200 yL，內(nèi)含I mM的丙酮酸鈉，I mM的NADH，適量稀釋后酶液，50 mM的Tris-HCl (pH 8.0)。空白對照中不加酶，補加等體積的緩沖液，85°C反應5 min后，冰浴中迅速終止反應，用分光光度計在340 nm處測定其吸收值，計算相對于空白對照的下降值。LDH酶活單位定義:每分鐘氧化NADH I μ mol所需要的酶量定義為一個活性單位。用NADH作標準曲線。
[0032]實例3.酶法制備SAH
(I)單酶反應系統(tǒng)生產(chǎn)SAH的最適條件
反應體系為10 ml，內(nèi)含20 mM的腺苷，40 mM的同型半胱氨酸，I mM NAD,0.5 mg純化后 SAHase，50 mM 的 Tris-HCl。反應條件為 85°C，pH 8.0,12 h。
[0033](2)雙酶反應系統(tǒng)生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸的最適條件
反應體系為10 ml，內(nèi)含20 mM的腺苷，40 mM的同型半胱氨酸，40 mM的丙酮酸鈉，I mMNAD, 0.5 mg 純化后 SAHase 酶液，0-2 mg 純化后 LDH，50 mM 的 Tris-HCl。反應條件為 85°C，pH 8.0,12 h。
[0034]實例4.極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的克隆表達
(I)根據(jù)極耐熱性S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(GenBank: AF013268.1)基因序列設計一對引物:5’ -CATGCCATGGCTAACACAGGTGAAATGAAGA-3’，5’ -CCGCTCGAGCTGCCAACTTCTCAGATA-3’。以海棲熱袍菌基因組DNA為模板，用上述引物對S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因進行PCR擴增。
[0035](2)用Nco I和沿ο I處理PCR產(chǎn)物，并將它與AfcoI和沿ο I雙酶切的載體pHsh大片段混合并連接。
[0036](3)通過電轉(zhuǎn)化導入疋co7i BL21(DE3)后，涂布到含0.1 mg/ml氨芐青霉素的LB平板上，于30°C培養(yǎng)。
[0037](4)從LB平板上挑選單菌落，分別接種到4 ml含0.1 mg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)過夜后，按照標準的方法提取質(zhì)粒。
[0038](5)質(zhì)粒寄送到上海美吉生物公司進行序列測定，并將質(zhì)粒命名為pHsh-saAase，并用作后續(xù)研究的起始材料和實驗對照。
[0039](6)將重組質(zhì)粒 pHsh-saAase 轉(zhuǎn)入萬.coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL,涂布于含
0.1 mg/ml的氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，30°C過夜培養(yǎng)。
[0040] (7)挑取重組單菌落接種于含0.1 mg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達0.8^1.0時，轉(zhuǎn)入42°C水浴搖床中使其瞬間升溫至42°C進行誘導，200 rpm繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，以12 000 rpm離心I min收集菌體。
[0041](8)用鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑緩沖液(50 mM,pH 8.0)洗滌細胞兩次，并用500 μL的緩沖液重懸細胞，超聲波破碎，5秒/次，共10次。
[0042](9)超聲破碎后以12 000 rpm，4°C離心I min去除未破碎細胞及細胞碎片，取上清用于SAHase酶活測定。同樣收集I ml菌液離心棄上清，以I X樣品緩沖液重懸菌體，煮沸后進行蛋白電泳(12.5%分離膠)分析。
[0043]實例5.重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶的分離純化
(I)將重組質(zhì)粒pHsh-saAase轉(zhuǎn)入宿主菌株萬.coli BL21 (DE3)，挑取單菌落接種于10ml含0.1 mg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中(10 ml/50 ml三角瓶)，30°C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0044](2)按1%的 接種量轉(zhuǎn)接入700 ml含0.1 mg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中(700ml/3 L三角瓶)，30°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達0.8~1.0時，轉(zhuǎn)入42°C水浴搖床200 rpm培養(yǎng)5 h，以5 000 g，離心10 min收集細胞。用滅菌的去離子水洗滌細胞三次，徹底除去殘留的培養(yǎng)基溶液菌，按照I '2 (濕重:體積)的比例重懸于適量的鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑(50 mM, pH
8.0)緩沖液中。
[0045](3)用高壓破碎法破碎細胞后，以20 000 g離心30 min去除破碎細胞和細胞碎片，上清即為胞內(nèi)粗酶液。
[0046](4)將粗酶液置于三角瓶中，在80°C下熱處理I h變性大部分雜蛋白進行部分純化，熱處理過程中不時的搖動三角瓶以保證受熱的充分。熱處理后，10 000 g，4°C下離心，30 min取得部分純化的上清。
[0047](5)上清利用His-tag親和層析純化S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。具體過程如下:
a取I ml填料裝柱；
b先用3倍柱體積的無菌水洗滌柱子；
c再用5倍柱體積的IXCharge buffer漂洗柱子；
d再用3倍柱體積的I XBinding buffer漂洗柱子；
e把部分純化的SAHase上清液加入柱子中；
f用10倍柱體積的IXBinding buffer漂洗柱子；
g用6倍柱體積的I XWash buffer漂洗柱子；
h用6倍柱體積的IXElute buffer洗脫柱子上結(jié)合的蛋白；
i用4倍體積的I X Strip buffer洗柱子；
j用10倍無菌水沖洗柱子，然后用20%酒精充滿柱填料，4°C下保存填料。
[0048]收集的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE膠驗證后，合并其中較純的洗脫液，并置于冰上用緩沖液透析。
[0049]實施例6.重組S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶學性質(zhì)的測定
(I)NAD濃度對合成活性影響的測定:反應在50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中進行，內(nèi)含20 mM的腺苷，40 mM同型半胱氨酸，適量稀釋后SAHase酶液，1-20 mM NAD，于85°C反應20 min。用HPLC檢測不同NAD濃度下，SAH的生成量。
[0050](2)最適反應 pH 的測定:不同的 pH (6.5~10.0)的 50 mM phosphate-Tris-Gly緩沖液，于85°C分別測定酶活，反應體系為I ml:l mM腺苷，2 mM同型半胱氨酸，I mMNAD，然后添加適量稀釋的SAHase酶液，于85°C下反應20 min。以最高酶活力為100%，計算相對活性。[0051](3)最適反應溫度的測定:酶反應在50 mM pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中進行，緩沖液pH在85°C下校正。在60~100°C范圍內(nèi)，每隔5°C，分別測定酶活，反應體系為I ml:1 mM腺苷，2 mM同型半胱氨酸，I mM NAD，然后添加適量稀釋的酶液，反應時間為20 min。以最高酶活力為100%，計算相對酶活。
[0052](4)穩(wěn)定性的測定:取適量純化酶液(6.4 μ g/ml)在85°C下pH 8.0環(huán)境保溫20、90、210、330、450、570、720 min，在不同的時間取樣測定酶活，以未保溫(4°C保存)的酶活力為100%，計算相對酶活,確定酶在最適反應條件下的穩(wěn)定性。
[0053]實施例7.酶法制備S-腺苷同型半胱氨酸
S-腺苷同型半胱氨酸含量的分析在Agilent 1260 Infinity HPLC高壓液相色譜儀上，用Agilent TC-C18柱(4.6 _ X 250 mm, 5 μ m)分析。色譜條件:柱溫:25°C ;流動相:86%的甲醇；流速:0.8 ml/min ;紫外可見吸收檢測器:260nm。
[0054]具體方法是:在10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中添加20 mM腺苷，40mM同型半胱氨酸，I mM NAD,然后添加0.5 mg的純酶,于85°C下反應12 h。
[0055]實施例8.用乳酸脫氫酶作為輔酶再生系統(tǒng)生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸
具體方法是:在10 ml 50mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中添加20 mM腺苷，40 mM同型半胱氨酸，40mM丙酮酸鈉，I mM NAD,然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和適量乳酸脫氫酶，于85°C下反應12 h。
[0056]實施例9.用NADH氧化酶作為輔酶再生系統(tǒng)生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸
具體方法是:在10 ml 50mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中添加20 mM腺苷，40 mM同型半胱氨酸，I mM MD，然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和適量NADH氧化酶，于85°C下反應12 h。
[0057]實施例10.用醇脫氫酶作為輔酶再生系統(tǒng)生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸
具體方法是:在10 ml 50mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中添加20 mM腺苷，40 mM同型半胱氨酸，40 mM乙醒，I mM NAD,然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和適量醇脫氫酶，于85°C下反應12 ho
[0058]實施例11. 用葡萄糖脫氫酶作為輔酶再生系統(tǒng)生產(chǎn)S-腺苷同型半胱氨酸
具體方法是:在10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中添加20 mM腺苷，40 mM同型半胱氨酸，40 mM D-葡萄糖酸-1，5-內(nèi)酯，I mM NAD,然后添加0.5 mg的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和適量葡萄糖脫氫酶，于85°C下反應12 h。
【權(quán)利要求】
1.一種由海棲熱袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶與催化NAD再生反應的酶共同組成的高效合成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的雙酶系統(tǒng)，以及應用雙酶系統(tǒng)高效合成SAH的方法；技術(shù)方案包括以下主要步驟:(I)從海棲熱袍菌中克隆出編碼S-腺苷同型半胱氨酸水解酶等目標基因，并將其插入大腸桿菌表達載體構(gòu)建基因表達質(zhì)粒；(2)對表達質(zhì)粒中的目標基因的序列進行優(yōu)化，提高其表達水平；(3)用表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組細胞，細胞培養(yǎng)過程中誘導基因表達后，收集并裂解重組細胞，對細胞提取液進行熱處理后離心，得到重組酶；(4)在高溫條件下，用海棲熱袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶與介導輔酶再生的酶進行聯(lián)合反應，進行SAH的高效合成。
2.如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌表達載體，其特征在于用熱激誘導型載體PHsh表達海棲熱袍菌S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因。
3.如權(quán)利要求1所述的介導輔酶再生的酶，其特征在于其編碼基因來源于極端高溫微生物，產(chǎn)生的酶屬于極耐熱性酶。
4.如權(quán)利要求3所述的介導NAD再生的極耐熱性酶，其特征是由海棲熱袍菌的基因編碼的乳酸脫氫酶。
5.如權(quán)利要求1所述的SAH高效合成，其特征在于根據(jù)S-腺苷同型半胱氨酸水解酶酶學性質(zhì)設定的極端反應條件:pH》8.0、溫度》80°C、底物腺苷濃度》20毫摩爾、NAD濃度》I毫摩 爾。
【文檔編號】C12N9/14GK103966185SQ201410207959
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月18日
【發(fā)明者】邵蔚藍, 錢國軍, 王洪成 申請人:南京仙奕基因科技有限公司