一種用于丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)和基因分型的多重?zé)晒鈖cr檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)和基因分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。所述試劑盒包括RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HCV反應(yīng)液Ⅰ、HCV反應(yīng)液Ⅱ、HCV反應(yīng)液Ⅲ，優(yōu)選的，還包括HCV分型陰性對(duì)照、HCV分型陽(yáng)性對(duì)照及使用說明書。本發(fā)明對(duì)提取的HCV?RNA，采用三管多重?zé)晒釶CR，通過一步法RT-PCR，快速檢測(cè)樣本中丙型肝炎病毒RNA及其亞型。本發(fā)明的試劑盒擴(kuò)增方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果靈敏度高、特異性好，可用于人血清或血漿中HCV?RNA的檢測(cè)和基因分型，有助于判斷治療的難易程度、制定個(gè)體化抗病毒治療方案，具有臨床推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種用于丙型肝炎病毒核酸檢測(cè)和基因分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種采用多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，制備丙型肝炎病毒及其基因分型檢測(cè)的試劑盒，用于快速準(zhǔn)確檢測(cè)臨床血清或血漿樣品中丙型肝炎病毒及國(guó)內(nèi)主要流行亞型lb，2a，3a，3b，6a的感染。本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起丙型肝炎的病原體,嚴(yán)重危害人類健康。它主要通過輸血、靜脈注射、母嬰垂直等方式感染致病，可引起慢性肝炎，肝硬化，甚至肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，目前全球約有2億人感染HCV (至少包括130個(gè)國(guó)家)，約占全球人口的3%，其中80%急性肝炎患者成為慢性肝炎，其中20%發(fā)展為肝硬化，1%-5%肝硬化患者可發(fā)展為肝癌。
[0003]HCV的基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約9.6kb。根據(jù)其核苷酸序列的差異性，可將HCV分為6個(gè)主要的基因型，每個(gè)基因型又可分為多個(gè)亞型。HCV基因型的分布具有明顯的地域差異，1-3型呈全球性流行，4-6型呈地方性流行。我國(guó)主要有1、2、3和6型4種HCV流行基因型，其中流行最廣泛的亞型為Ib和2a，其次為6a、3b和3a。HCV基因型與干擾素抗病毒治療的應(yīng)答密切相關(guān)，是決定丙型肝炎患者干擾素治療效果的重要因素。不同基因型HCV感染者接受干擾素治療后，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)率有所不同，從而有助于預(yù)測(cè)治療效果，為調(diào)整用藥劑量及治療時(shí)間，制定個(gè)體化抗病毒治療方案提供指導(dǎo)。因此HCV基因型在臨床上常作為藥物療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
[0004]HCV基因分型的方法主要有分子生物學(xué)和血清學(xué)兩大類。在分子生物學(xué)分型法中，核苷酸測(cè)序法被認(rèn)為是“金標(biāo) 準(zhǔn)”，但由于測(cè)序設(shè)備的限制，廣泛的臨床應(yīng)用存在一定困難。PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)法利用限制性內(nèi)切酶可將6種基因型分開，但酶切位點(diǎn)易受到基因變異的影響。線性探針雜交(Line probe hybridization assay, LiPA)法操作較為繁瑣，HCV RNA低載量患者的檢測(cè)效果較差。實(shí)時(shí)熒光PCR法既可檢測(cè)主要基因型，同時(shí)還能區(qū)分亞型。此外，還有型特異探針雜交、反向斑點(diǎn)雜交等分型方法。血清學(xué)基因分型主要是檢測(cè)NS4區(qū)和核心區(qū)編碼的抗原，常用的方法有重組免疫印跡試驗(yàn)(Recombinant Immunoblot Assay, RIBA)和酶免疫試驗(yàn)(Enzyme Immunoassay, EIA)。這兩種方法對(duì)1、2、3基因型的辨別有96%的一致性,且操作簡(jiǎn)便。但用于檢測(cè)HCV基因型特異性抗原的ELISA方法雖可以識(shí)別6種基因型，卻不能識(shí)別亞型。而且一些研究表明，血清學(xué)分型可能在特異性和靈敏度方面有局限。近年國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的HCV RNA基因分型的研究方法主要有HPLC酶切法、引物特異性電泳分型法、熔點(diǎn)曲線法、分管引物測(cè)序等方法，這幾種方法均存在操作復(fù)雜、結(jié)果鑒定開放式或分管多步等缺陷，因此也沒有成為臨床常規(guī)開展的技術(shù)。本發(fā)明采用多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，可用于快速準(zhǔn)確檢測(cè)臨床血清或血漿樣品中丙型肝炎病毒及國(guó)內(nèi)主要流行亞型lb，2a，3a，3b，6a的感染，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、疾病治療等領(lǐng)域有極大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種采用多重?zé)晒馓结樇夹g(shù)進(jìn)行丙型肝炎病毒核酸及其基因型檢測(cè)的試劑盒，通過該試劑盒的使用，能夠快速、簡(jiǎn)便、敏感地檢測(cè)HCVRNA及HCV基因型，從而為丙型肝炎的臨床診斷和抗病毒治療提供參考依據(jù)。
[0006]為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為在HCV5’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)進(jìn)行HCV通用型檢測(cè)的引物和探針，同時(shí)分別針對(duì)HCV的各亞型(HCVlb、HCV2a，HCV6a、HCV3b和HCV3a)的NS5B基因區(qū)段設(shè)計(jì)用于HCV基因分型的引物和探針。在HCV核酸提取后，配制RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，根據(jù)三個(gè)反應(yīng)管的擴(kuò)增結(jié)果判斷HCV感染及其感染亞型。本發(fā)明擴(kuò)增程序簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好、結(jié)果清晰，容易判斷。
[0007]本發(fā)明是一種用于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸檢測(cè)和基因分型的多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HCV反應(yīng)液1、HCV反應(yīng)液II以及HCV反應(yīng)液III ；
[0008]其中，HCV反應(yīng)液I用于檢測(cè)HCV通用型和Ib亞型，其包括以下引物序列和探針:
[0009]用于HCV通用型檢測(cè)的引物序列是:
[0010]HCV-F:5，-AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’ (SEQ ID N0.1 所示)；
[0011]HCV-R:5’ -CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’ (SEQ ID N0.2 所示)；
[0012]對(duì)應(yīng)的探針序列是`:
[0013]HCV-P:5’ -AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’ (SEQ ID N0.3 所示)；及
[0014]用于HCVlb亞型檢測(cè)的引物序列是:
[0015]HCVlb-F:5’ -GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3’ (SEQ ID N0.4 所示)；
[0016]HCVlb-R:5’ -GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3’ (SEQ ID N0.5 所示)；
[0017]對(duì)應(yīng)的探針序列是:
[0018]HCVlb-P:5，-CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3，(SEQ ID N0.6 所示)；
[0019]其中，HCV反應(yīng)液II用于檢測(cè)HCV2a和6a亞型，其包括以下引物序列和探針:
[0020]用于HCV2a亞型檢測(cè)的引物序列是:
[0021]HCV2a-F:5，-CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3，(SEQ ID N0.7 所示)；
[0022]HCV2a-R:5，-GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3，(SEQ ID N0.8 所示)；
[0023]對(duì)應(yīng)的探針序列是:
[0024]HCV2a-P:5，-ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3，(SEQ ID N0.9 所示)；及
[0025]用于HCV6a亞型檢測(cè)的引物序列是:
[0026]HCV6a-F:5，-CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’ (SEQ ID N0.10 所示)；
[0027]HCV6a-R:5，-TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’ (SEQ ID N0.11 所示)；
[0028]對(duì)應(yīng)的探針序列是:
[0029]HCV6a-P:5’ -TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’ (SEQ ID N0.12 所示)；
[0030]其中，HCV反應(yīng)液III用于檢測(cè)HCV3a和3b亞型，其包括以下引物序列和探針:
[0031]用于HCV3a亞型檢測(cè)的引物序列是:[0032]HCV3a-F:5’ -CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’ (SEQ ID N0.13 所示)；
[0033]HCV3a-R:5，-GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3，(SEQ ID N0.14 所示)；
[0034]對(duì)應(yīng)的探針序列是:
[0035]HCV3a-P:5，-ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’ (SEQ ID N0.15 所示)；及
[0036]用于HCV3b亞型檢測(cè)的引物序列是:
[0037]HCV3b-F:5’ -GCACCAAAACCAAACTCACT-3’ (SEQ ID N0.16 所示)；
[0038]HCV3b-R:5’ -GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3，(SEQ ID N0.17 所示)；
[0039]對(duì)應(yīng)的探針序列是:
[0040]HCV3b-P:5，-CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’ (SEQ ID N0.18 所示)。
[0041]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的試劑盒中還包括HCV分型陰性對(duì)照、HCV分型陽(yáng)性對(duì)照及使用說明書，更優(yōu)選的，所述的HCV分型陰性對(duì)照為無HCV RNA的正常人血清樣本；所述的HCV分型陽(yáng)性對(duì)照為含有HCVlb亞型基因片段的非轉(zhuǎn)染性體外轉(zhuǎn)錄RNA的人血清樣本。
[0042]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的RT-PCR反應(yīng)液中含有pH=8.0的Tris-HC120mM、KCllOOmM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 0.4mM、MgCl26mM。
[0043]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的酶混合液中含有200U/μ L逆轉(zhuǎn)錄酶、40U/ μ L RNA酶抑制劑和2U/` μ L Taq酶。
[0044]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的HCV反應(yīng)液1、HCV反應(yīng)液II或HCV反應(yīng)液III中所含有的探針序列的5’端分別采用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。
[0045]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，所述的PCR反應(yīng)液中還包括內(nèi)參系統(tǒng)，所述的內(nèi)參系統(tǒng)為人GAPDH基因參照系統(tǒng)，包括:
[0046]用于擴(kuò)增人GAPDH基因的引物序列:
[0047]GAPDH-F:5’ -CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’ (SEQ ID N0.19 所示)；
[0048]GAPDH-R:5，-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3，(SEQ ID N0.20 所示)；及
[0049]內(nèi)參探針:
[0050]GAPDH-P:5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’ (SEQ ID N0.21 所示)，內(nèi)參探針 5’端用CY5標(biāo)記，3’端用BHQl標(biāo)記。
[0051]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，HCV反應(yīng)液I中含有的用于檢測(cè)HCV通用型和Ib亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.3-0.5 μ M，用TE緩沖液溶解；HCV反應(yīng)液II中含有的用于檢測(cè)2a和6a亞型的引物序列和探針,其濃度分別為:0.2-0.4 μ M，用TE緩沖液溶解；HCV反應(yīng)液III中含有的用于檢測(cè)3a和3b亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:
0.3-0.5 μ M，用TE緩沖液溶解。
[0052]根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒，優(yōu)選的，RT-PCR反應(yīng)體系的配制和擴(kuò)增程序如下:
[0053]RT-PCR反應(yīng)體系的配制:
[0054]將RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HCV反應(yīng)液1、HCV反應(yīng)液II或HCV反應(yīng)液III分別按照體積比15:10:5的比例混合，反應(yīng)體系為50 μ L ;
[0055]RT-PCR反應(yīng)程序設(shè)置如下:
[0056](I) 5CTC, 30min, I 個(gè)循環(huán)；
[0057](2)95°C，5min，l 個(gè)循環(huán)；[0058](3) 95°C, IOs ；
[0059](4) 60。。，40s;
[0060](5)重復(fù)步驟(3)和(4)，共進(jìn)行45次循環(huán)
[0061]步驟(4)中60°C時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道為FAM、VIC和CY5。
[0062]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明試劑盒進(jìn)行HCV基因分型的設(shè)計(jì)思路如下表1所示:
[0063]表1、三管多重?zé)晒釶CR檢測(cè)HCV基因型方案
【權(quán)利要求】
1.一種用于丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核酸檢測(cè)和基因分型的多重突光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HCV反應(yīng)液1、HCV反應(yīng)液II以及HCV反應(yīng)液III ； 其中，HCV反應(yīng)液I用于檢測(cè)HCV通用型和Ib亞型，其包括以下引物序列和探針: 用于HCV通用型檢測(cè)的引物序列是:
HCV-F:5’ -AGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3’ ；
HCV-R:5’ -CRACCCAACRCTACTCGGCT-3’ ； 對(duì)應(yīng)的探針序列是:
HCV-P:5’ -AGTACACCGGAATYGCCRGGAHGAC-3’ ；及
用于HCVlb亞型檢測(cè)的引物序列是:
HCVlb-F:5，-GCCCAGGAGCAACTTGAAAA-3，；
HCVlb-R:5，-GAGAGTAACTATGGAGTGAA-3，； 對(duì)應(yīng)的探針序列是:
HCVlb-P:5’ -CTCCATTGAGCCACTTGACCTACCT-3’ ； 其中，HCV反應(yīng)液II用于檢測(cè)HCV2a和6a亞型，其包括以下引物序列和探針: 用于HCV2a亞型檢測(cè)的引物序列是:
HCV2a-F:5’ -CGGAGGCTATGACCAGGTATTC-3’ ；
HCV2a-R:5， -GGCATCACGGGTGAGGTAATAG-3，； 對(duì)應(yīng)的探針序列是:
HCV2a-P:5， -ACCTCCTCCCCTTGTCGTCCCGT-3，；及
用于HCV6a亞型檢測(cè)的引物序列是:
HCV6a-F:5’ -CTTGCCTCAGGAAACTTGGG-3’ ；
HCV6a-R:5’ -TAGCTTGGTCTTCACTGCCC-3’ ； 對(duì)應(yīng)的探針序列是:
HCV6a-P:5’ -TGCGAGCCTGGAGACATCGAGCCA-3’ ； 其中，HCV反應(yīng)液III用于檢測(cè)HCV3a和3b亞型，其包括以下引物序列和探針: 用于HCV3a亞型檢測(cè)的引物序列是:
HCV3a-F:5’ -CCTTGACTTTGAAATGTACG-3’ ；
HCV3a-R:5’ -GCTCTACTGGAGAGTAACTG-3’ ； 對(duì)應(yīng)的探針序列是:
HCV3a-P:5’ -ACTCTGTCACTCCGCTGGATTTACC-3’ ；及
用于HCV3b亞型檢測(cè)的引物序列是:
HCV3b-F:5，-GCACCAAAACCAAACTCACT-3，；
HCV3b-R:5， -GAGTAGGCAAAGCAGCAAAT-3，； 對(duì)應(yīng)的探針序列是:
HCV3b-P:5’ -CTGCGGGCCAGCTAGATCTTTC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括HCV分型陰性對(duì)照、HCV分型陽(yáng)性對(duì)照及使用說明書，優(yōu)選的，所述的HCV分型陰性對(duì)照為無HCV RNA的正常人血清樣本； 所述的HCV分型陽(yáng)性對(duì)照為含有HCVlb亞型基因片段的非轉(zhuǎn)染性體外轉(zhuǎn)錄RNA的人血清樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反應(yīng)液中含有pH=8.0的Tris-HC120mM、KC1100mM、dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 0.4mM、MgCl26mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶混合液中含有200U/i!L逆轉(zhuǎn)錄酶、40U/ u L RNA酶抑制劑和2U/ U L Taq酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于HCV反應(yīng)液1、HCV反應(yīng)液II或HCV反應(yīng)液III中所含有的探針序列的5’端分別采用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)液中還包括內(nèi)參系統(tǒng)，所述的內(nèi)參系統(tǒng)為人GAPDH基因參照系統(tǒng)，包括: 用于擴(kuò)增人GAPDH基因的引物序列:
GAPDH-F:5’ -CCGTCTAGAAAAACCTGCCAAA-3’ ；
GAPDH-R:5’ -TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’ ；及 內(nèi)參探針: GAPDH-P:5’-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3’，內(nèi)參探針 5’端用 CY5 標(biāo)記，3’端用 BHQl標(biāo)記 O
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，HCV反應(yīng)液I中含有的用于檢測(cè)HCV通用型和Ib亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.3-0.5 ii M，用TE緩沖液溶解；HCV反應(yīng)液II中含有的用于檢測(cè)2a和6a亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.2_0.4yM，用TE緩沖液溶解；HCV反應(yīng)液III中含有的用于檢測(cè)3a和3b亞型的引物序列和探針，其濃度分別為:0.3-0.5 ii M，用TE緩沖液溶解。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，RT-PCR反應(yīng)體系的配制和擴(kuò)增程序如下: RT-PCR反應(yīng)體系的配制: 將RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、HCV反應(yīng)液1、HCV反應(yīng)液II或HCV反應(yīng)液III分別按照體積比15:10:5的比例混合，反應(yīng)體系為50 ii L ; RT-PCR反應(yīng)程序設(shè)置如下: (1)50°C，30min，l 個(gè)循環(huán)； (2)95°C，5min，l個(gè)循環(huán)；
(3)95。。，IOs ；
(4)60°C,40s ； (5 )重復(fù)步驟(3 )和(4 )，共進(jìn)行45次循環(huán) 步驟(4)中60°C時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道為FAM、VIC和CY5。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備檢測(cè)丙型肝炎病毒試劑中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備對(duì)丙型肝炎病毒進(jìn)行基因分型的試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103773897SQ201410020086
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】李榮宇, 祁寅樂, 王國(guó)強(qiáng), 劉中華, 李秀林, 張旭 申請(qǐng)人:江蘇碩世生物科技有限公司