本發(fā)明涉及源于草酸青霉的黑麥酮酸i及制備抗人食管癌藥物的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黑麥酮酸類化合物（secalonicacids）屬于麥角色素類（ergochrome）次生代謝產(chǎn)物，為氧雜蒽酮二聚物。自從stoll等在1952年從真菌中分離得到黑麥酮酸a（secalonicacida）之后，該系列的化合物黑麥酮酸（a,b,c,d,e,f,g）就不斷地被發(fā)現(xiàn)及研究。黑麥酮酸類化合物具有各種不同的生理活性，以黑麥酮酸d（secalonicacidd,sad）為例，5mg/ml的sad加入到生理鹽水中,在5-20mg范圍內(nèi)，即可以治療早期膀胱癌，50-100mg范圍內(nèi)，對更嚴(yán)重的膀胱癌有療效并且沒有副作用發(fā)生。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性好的黑麥酮酸類化合物，具有很好的藥用和產(chǎn)業(yè)化前景。
本發(fā)明人研究得知，草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，(已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：cctccno：m2013714)的發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物有很好的細(xì)胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)所示黑麥酮酸類化合物具有抗人食管癌活性，目前尚未見該化合物對人食管癌細(xì)胞的增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供源于草酸青霉的黑麥酮酸i及制備抗人食管癌藥物的應(yīng)用。該化合物具有抑制食管癌細(xì)胞增殖作用，具有抗人食管癌活性。其結(jié)構(gòu)式為：
該化合物的制備方法，是通過發(fā)酵培養(yǎng)草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，獲取發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出該化合物。具體步驟如下：
1發(fā)酵生產(chǎn)
培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6接種到pda固體斜面培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至3天，然后接種到培養(yǎng)液中，28℃靜止培養(yǎng)30天后，獲得菌絲體和發(fā)酵液；所述培養(yǎng)液組成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麥芽糖20.0g、味精10.0g、葡萄糖10.0g、kh2po40.5g、mgso4·7h2o0.3g、nacl15.0g；
2浸膏的獲得
用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。菌絲體用丙酮溶液（含20%~30%水）連續(xù)超聲破壁3次，過濾去除殘渣，得到菌絲體的含丙酮和水的粗提物。減壓濃縮去除丙酮，得到粗體物的水溶液，再以體積比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，減壓濃縮至近干得菌絲體浸膏36.5g。
3化合物的分離精制
菌絲體浸膏通過100-200目硅膠拌樣，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫液，進(jìn)行減壓硅膠色譜柱層析。經(jīng)過簡單的薄層色譜分析，合并，分離成組分a-e。組分d(5.9g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脫物)以二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫劑，進(jìn)行加壓柱硅膠色譜層析，經(jīng)過薄層色譜分析后合并得到五個亞組分d1-d5。組分d2(1.2g)以三氯甲烷：甲醇=1:2為梯度洗脫劑，進(jìn)行凝膠柱層析（sephadexlh-20），經(jīng)過薄層色譜分析后合并得到四個亞組分d2-1~d2-4。d2的亞組分d2-3(212mg)通過半制備液相色譜(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分離流速為5ml/min，流動相為55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(2.7mg，tr13.8min)。
所述草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：cctccno：m2013714。
本發(fā)明還保護(hù)了所述的化合物在制備抑制人食管癌細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，及該化合物在制備抗人食管癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點：研究所示該黑麥酮酸化合物未見報道且具有顯著的抑制人食管癌細(xì)胞增殖活性，目前尚未見該化合物對人食管癌細(xì)胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。
附圖說明
圖1secalonicacidi主要的cosy，hmbc和noe信號。
具體實施方式
在如下的實施例中所指的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
實施例1該化合物的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制
1發(fā)酵生產(chǎn)
生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6(已于2013年12月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:武漢武漢大學(xué)，保藏編號是：cctccno：m2013714)適量，接種到pda固體斜面培養(yǎng)基上在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至3天。
取斜面培養(yǎng)2至3天的草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6適量，接種到裝有400ml培養(yǎng)液[培養(yǎng)液組成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麥芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，kh2po40.5，mgso4·7h2o0.3，nacl15.0，定容]的1000ml錐形瓶中，28℃靜止培養(yǎng)30天后，獲得菌絲體和發(fā)酵液。
2浸膏的獲得
用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。菌絲體用丙酮溶液（含20%~30%水）連續(xù)超聲破壁3次，過濾去除殘渣，得到菌絲體的含丙酮和水的粗提物。減壓濃縮去除丙酮，得到粗體物的水溶液，再以體積比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，減壓濃縮至近干得菌絲體浸膏36.5g。
3化合物的分離精制
菌絲體浸膏通過100-200目硅膠拌樣，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫液，進(jìn)行減壓硅膠色譜柱層析。經(jīng)過簡單的薄層色譜分析，合并，分離成組分a-e。組分d(5.9g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脫物)以二氯甲烷：甲醇為梯度洗脫劑，進(jìn)行加壓柱硅膠色譜層析，經(jīng)過薄層色譜分析后合并得到五個亞組分d1-d5。組分d2(1.2g)以三氯甲烷：甲醇=1:2為梯度洗脫劑，進(jìn)行凝膠柱層析（sephadexlh-20），經(jīng)過薄層色譜分析后合并得到四個亞組分d2-1~d2-4。d2的亞組分d2-3(212mg)通過半制備液相色譜(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分離流速為5ml/min，流動相為55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(2.7mg，tr13.8min)。
化合物常溫下為黃色油狀物，高分辨電噴霧質(zhì)譜hresi-ms在m/z：659.1377處給出分子離子峰[m+na]+（calcdforc32h28nao14，659.1377），提示分子量為636，結(jié)合波譜信息推測分子式為c32h28o14。1h和13c-nmr數(shù)據(jù)見表1，主要的cosy，hmbc和noe信號見圖1。
表1化合物的1h和13c-nmr數(shù)據(jù)(500mhz1hand126mhz13c,indmso-d6)
實施例2體外抗腫瘤活性的測試
1實驗樣品及實驗方法
被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施1中分離精制的化合物純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。
細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)采用腫瘤細(xì)胞系，腫瘤細(xì)胞用含10%fbs的dmem培養(yǎng)基，在37℃于通入5%co2的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。
細(xì)胞增殖抑制活性測試方法
四氮唑鹽（mtt）法取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至每毫升1×105個細(xì)胞，按每孔200微升接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃通入5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加入2微升的樣品液或空白溶液，培養(yǎng)24小時之后，每孔加入mtt液（mtt的每毫升5毫克生理鹽水溶液）10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37℃、2000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，吸取上清。每孔加入dmso各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解之后，利用md公司生產(chǎn)的spectramaxplus型酶標(biāo)儀測定每孔在570nm處的吸光（od）值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)置三孔的空白對照和無細(xì)胞凋零孔（如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞凋零）。各孔o(hù)d值先做相應(yīng)無細(xì)胞凋零，再取三孔平均od值按ir(%)=(od空白對照-od樣品)/od空白對照×100%計算每個濃度下細(xì)胞的增殖抑制率（ir%）。
2.實驗結(jié)果
細(xì)胞增殖抑制活性測試結(jié)果
在mtt法測試中，根據(jù)不同濃度的該化合物的腫瘤細(xì)胞增殖抑制率，應(yīng)用spss16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并計算半數(shù)抑制濃度ic50值。結(jié)果見表2。
表2化合物對人食管癌細(xì)胞增殖的抑制活性
3.結(jié)論
該化合物對人食管癌細(xì)胞具有較好的抗腫瘤活性?？勺鳛橹苽涫彻馨┘?xì)胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于食管癌的研究。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。