本發(fā)明涉及一種從山莓鮮果中提取木犀草素和山莓素的方法，屬于天然產(chǎn)物分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

山莓又名山拋子、牛奶泡、撒秧泡，三月泡、四月泡、龍船泡，薔薇科懸鉤子屬的植物。分布于日本、越南、朝鮮、緬甸以及中國大陸的甘肅、西藏、東北、青海、新疆等地，生長于海拔200米至2,200米的地區(qū)，多生在向陽山坡、山谷、荒地、溪邊和疏密灌叢中潮濕處，目前尚未由人工引種栽培。落葉灌木，高1—2米，小枝紅褐色，有許多皮刺分布于枝干，幼枝帶綠色，有柔毛及皮刺。葉卵形或卵狀披針形，長3.5—9厘米，寬2—4.5厘米，頂端漸尖，基部圓形或略帶心形，不分裂或有時作3淺裂，邊緣有不整齊的重鋸齒，兩面脈上有柔毛，背面脈上有細(xì)鉤刺；葉柄長約1.5厘米，有柔毛及細(xì)刺；托葉線形，基部貼生在葉柄上。花白色，直徑約2厘米，通常單生在短枝上；萼片卵狀披針形，有柔毛，宿存。聚合果球形，直徑1—1.2厘米，成熟時紅色?；ㄆ?—5月，果期5—6月。

山莓果實氨基酸(20.84mg/g·fw)至少含有17種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸；sod含量達(dá)237.98μg/g·fw；礦質(zhì)元素含量豐富，尤其是鍶(se)；種子油中脂肪酸尬發(fā)以下飽和脂肪成分以不飽和脂肪酸為主，亞油酸(46.56％)、亞麻酸(11.67％)有較高含量，此外，含豐富糖類、蛋白質(zhì)、有機酸、維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分，被稱為“第三代黃金水果”的，還含有木犀草素和山莓素等活性物質(zhì)。

木犀草素白色或類白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，溶于乙醇等極性有機溶劑。對山莓酮葡萄糖苷(rkg)、山莓酮半乳糖苷和山莓酮木糖苷的黑色素形成抑制作用進(jìn)行了對比。結(jié)果顯示rkg的黑色素抑制作用最強，山莓酮半乳糖苷次之，山莓酮木糖苷無抑制作用。

木犀草素(rkg)具有很好的抗老化、美白、亮膚及皮膚調(diào)理作用。近年研究表明，皮膚中由一氧化氮合成酶作用而合成的一氧化氮給皮膚造成很大傷害，使皮膚變得粗糙、老化的同時，也成為色素沉積的主要原因之一。木犀草素則是一優(yōu)良的一氧化氮捕捉劑，添加在護膚品可以有效的消除皮膚中過多的一氧化氮，從而降低酪氨酸酶活性，減少黑色素的形成。

山莓素是廣泛存在于各種軟果、堅果等植物組織中的一種天然多酚組分，沒食子酸的二聚衍生物，是一種多酚二內(nèi)酯，它不僅以游離的形式存在，而且更多的是以縮合形式(以鞣花單寧或苷等)存在于自然界。。山莓素與三氯化鐵的顯色反應(yīng)呈藍(lán)色，遇硫酸呈黃色。它微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。山莓素表現(xiàn)出對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用，特別是對結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤等有很好的抑制作用。紅山莓---“第三代水果”是當(dāng)今發(fā)現(xiàn)的天然山莓素含量最高的食物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了核桃和越橘等，并且美國明尼蘇達(dá)大學(xué)和南卡羅來納醫(yī)科大學(xué)賀嶺斯癌癥中心研究證實，紅山莓中含有大量的山莓素，可有效抵抗致癌癥物質(zhì)和致有機突變的物質(zhì)。

公開號為cn101204240的中國專利公開了一種紅山莓清澈型果汁、果醋飲料，其特征在于所述的紅山莓清澈型果汁、果醋飲料的工藝步驟為：原料挑選、打漿、酶解、分離澄清、離心過濾、添加輔料調(diào)配、膠體磨加工、均質(zhì)機處理、脫氣、熱灌裝、殺菌、冷卻、成品。實現(xiàn)糖度：10°bx；酸度(以乙酸計)0.8mg/100ml；該飲料不添加任何色素，可釀制成色彩艷麗的純天然飲料，含天然植物sod、山莓酮、水楊酸等品質(zhì)和精華，為人們提供了一種具有養(yǎng)顏美容、抗癌、抗衰老、降血壓、降血脂和預(yù)防貧血、腸胃病、心腦血管疾病的保健功效的果汁飲料。

公開號為cn101002619的中國專利公開了一種紅山莓混濁果汁飲料，其配比為：紅山莓∶水為1∶3；向上述配比液中添加輔料：糖度(白砂糖)：11.5％；酸度(檸檬酸)：ph＝3.5；果膠為上述果汁配比重量的0.08％，cmc0.2％。經(jīng)過以下步驟：挑選紅山莓、加熱90℃處理、過100目取汁、添加輔料調(diào)配、膠體磨加工、均質(zhì)處理、脫氣、加熱90℃、罐裝、殺菌、冷卻、成品。該飲料不用添加色素，可釀制成色彩艷麗的純天然飲料，含天然植物sod、山莓酮、水楊酸等品質(zhì)和精華，為人們提供了一種具有養(yǎng)顏美容、抗癌、抗衰老、降壓、降脂和預(yù)防貧血、腸胃病、心腦血管疾病的保健功效的果汁飲料。

公開號為cn101401775的中國專利公開了一種日用皮膚美白功效納米乳的制備方法，其特征在于包括以下步驟：按日用型納米乳原料配比，將乙二胺四乙酸二鈉置于容器中，再加入三重蒸餾水進(jìn)行充分溶解后，再依次加入檸檬酸和naoh充分溶解后，依次加入n-乙酰葡萄糖胺，l-抗壞血酸2-葡糖苷，完全溶解后，再依次加入β-山莓酮葡萄糖苷，維生素pp因子，以上物質(zhì)的溶解可以置于cq-10超聲震蕩器中進(jìn)行超聲震蕩加速溶解；再慢慢加入光甘草定應(yīng)用液，待完全溶解后，測定該溶液ph值為4.7±0.2，用彩色記號筆標(biāo)記為水相(i)；將肉豆蔻酸異丙酯，置于另一個容器中，取維生素e加入肉豆蔻酸異丙酯中，置于超聲振蕩器中震蕩超聲進(jìn)行混勻，再加入黃芩苷、苯乙基間苯二酚，也置于超聲振蕩器中震蕩超聲使之完全溶解，并用記號筆標(biāo)記為油相(ii)；再將辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(s)∶聚甘油脂肪酸酯(c)＝3∶1的比例，分別取辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯和聚甘油脂肪酸酯，并將兩者置于第三個容器中，加蓋，并將此容器迅速置于液體快速混合器上，打開液體快速混合器，充分混合均勻，使之形成乳化劑/助乳化劑(s/c)混合物，3-5min后，關(guān)閉液體快速混合器，加入阿魏酸異辛酯，按上述方法進(jìn)行混勻，并用記號筆標(biāo)記為s/c混合物(iii)；按照油相(ii)∶s/c(iii)∶水相(i)＝15％∶35％∶50％的比例，先分別取水相(i)、s/c混合物(iii)置于第四個容器中；將上述水相(i)、s/c混合物(iii)兩液相充分混合后，再在室溫25℃條件下或者自然室溫中，將其放入超聲振蕩器中震蕩并超聲2min左右，或者在室溫25℃條件下或者自然室溫中，啟動定時恒溫磁力攪拌器，以200rpm·min-1的轉(zhuǎn)速磁力攪拌5min，然后，再在此容器中直接加入油相(ii)，并將整個體系在超聲振蕩器中超聲10min左右，或者在室溫25℃條件下或者自然室溫中，啟動定時恒溫磁力攪拌器，以200rpm/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌20min；關(guān)閉超聲振蕩器或者定時恒溫磁力攪拌器，取下容器，觀察其外觀如是微淡黃色、清亮透明、流體性和分散性好、有明顯可見乳光者，即為日用皮膚美白功效納米乳；將此日用皮膚美白功效納米乳迅速分裝于不同規(guī)格的避光玻璃容器之中，加蓋，消毒，包裝，并置于干燥、通風(fēng)、陰涼的室溫之中保存即可。

公開號為cn101718690a的中國專利公開了一種山莓山莓素的測定方法，采用紫外光譜掃描山莓素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，確定山莓素的最大吸收峰及測定溶劑甲醇，確定并驗證在一定濃度范圍內(nèi)山莓素含量與吸光度之間的線性關(guān)系；然后利用有機溶劑乙酸乙酯將山莓中的山莓素成分提取出來，采用紫外吸收法測定山莓素的含量。該方法所測定山莓素的濃度范圍在0ug/ml～18ug/ml，檢測限為0.25ug，實現(xiàn)了操作簡捷，數(shù)據(jù)可靠，快速高效，低成本的測定。

公開號為cn103190612a的中國專利公開了一種山莓山莓素咀嚼片及其加工方法，包括以下步驟：將具有活性物質(zhì)的山莓采摘后，經(jīng)風(fēng)選、剔除雜質(zhì)后破碎；先后用12倍量和8倍量的丙酮總共回流1.5小時，加熱溫度至不高于80℃，提取山莓素后過濾、洗滌得到山莓素固體，將山莓素固體粉碎后備用；對山莓進(jìn)行挑選、風(fēng)選、去雜、經(jīng)過0.5％的檸檬酸與0.3％的抗壞血酸合用滅酶處理后，在400pa真空壓力和60℃干燥溫度下脫水，當(dāng)山莓含水率在6-6.5％以下時，置入超微粉碎機中制得山莓纖維粉；在70-75％的山莓纖維粉中加入2-5％的葡萄糖粉、0.1-0.3％的大麥芽粉、0.1-0.5％的南瓜粉、0.5-2％的大豆卵磷脂和5-10％的木糖醇，經(jīng)過篩分，除去較大顆粒制成預(yù)混粉料；在預(yù)混粉料中加入1-4％的山莓素、2.1～3.1％的果葡糖漿、0.1-0.3％的檸檬酸、0.1-0.3％的羥甲基淀粉鈉、1-3％的硬脂酸鎂和0.1-0.3％的d-異抗壞血酸鈉，混和均勻，也可根據(jù)不同人群口感加入少量的酸味劑進(jìn)行調(diào)配，酸堿調(diào)整范圍不宜過大，以免失去山莓固有香味；把混合均勻的料送入搖擺顆粒機進(jìn)行造粒，混動搖擺次數(shù)60次/分；造粒后放進(jìn)熱風(fēng)循環(huán)烘箱干燥0.5小時，風(fēng)量3600立方米/小時，干燥溫度控制在55℃；最后在旋轉(zhuǎn)式壓片機中壓片成型，壓片壓力55kn。

公開號為cn103766859a的中國專利公開了一種強化山莓素含量的紅山莓果醬生產(chǎn)工藝，包括以下步驟：紅山莓凍果在常溫下解凍6h，鮮果水清洗去除雜質(zhì)；使用絞肉機對解凍的原料果進(jìn)行破碎(孔徑8mm)，制得原料醬；樹苺漿與提取劑水以1:11的比例在微波設(shè)備中提取1.5h，溫度為75℃；將真空度升至0.05-0.08mpa，按樹苺液：白砂糖：檸檬酸＝5:4.5:0.5比例抽入原輔料，充分的攪拌，溫度達(dá)到85-95℃；調(diào)整好濃度的醬體泵入平衡罐灌裝，灌裝機內(nèi)醬體溫度不得低于85℃；殺菌水溫一段≥92℃；二段≥95℃；控制冷卻中心溫度≤40℃；檢查，吹干水分，裝箱。

從山莓研究文獻(xiàn)來看，黃酮類化合物具有降血糖、降血脂、抗心率失常、抗氧化高效性與低毒性、抗衰老等生理活性。木犀草素具有抑菌和活膚美白的作用，山莓素不易溶于甲醇、氯仿，表現(xiàn)出對化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變及其他多種癌變有明顯的抑制作用，特別是對結(jié)腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤等有很好的抑制作用。

山莓野生資源蘊藏量相當(dāng)大，具有良好的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。目前對其研究主要集中在資源調(diào)查，而對它的藥效成分提取、藥理方面的研究報道很少，特別是其果實之藥用價值未被重視。隨著山莓果實的藥用有效成分研究的進(jìn)一步深入，山莓果實的藥用價值必將會得到更加充分的發(fā)現(xiàn)和利用。若對提取過程中其有效成分進(jìn)行綜合開發(fā)利用，因而對山莓進(jìn)行綜合深加工意義非凡，探索從山莓中同時提取木犀草素和山莓素，其意義相當(dāng)遠(yuǎn)大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對山莓果實含有大量水溶性成分，在提取過程中由于破碎不徹底，造成細(xì)胞內(nèi)活性成分未能充分釋放，在提取廢渣中殘留較多，此類功能性成分并未得到充分利用，生產(chǎn)成本較高。

本發(fā)明采用的微生物菌種，木霉(trichodermasp.)來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號分別為cgmccno.3.3002。

木霉發(fā)酵液的制備：按木霉菌培養(yǎng)方法進(jìn)行液體培養(yǎng)即可。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：新鮮山莓果實經(jīng)醇提、木霉發(fā)酵、分別用硅膠柱和大孔樹脂吸附分離、洗脫、濃縮結(jié)晶制得木犀草素和山莓素純品。

因此，本發(fā)明提供一種從山莓鮮果中提取木犀草素和山莓素的方法，具體步驟包括如下：

(1)將山莓果實勻漿，加入乙醇進(jìn)行80～95℃回流提取30～60min，陶瓷膜過濾一次，得提取液和濾渣ⅰ，其中山莓果實重量kg與乙醇體積l比為1:2～4；

(2)將提取液在45～55℃減壓進(jìn)行濃縮至原有體積的1/20～1/30，得到濃縮液ⅰ，在0～5℃保存1～2h，陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅱ和濾渣ⅱ；

(3)將濾渣ⅰ加入3～15％木霉發(fā)酵液，25～35℃保存2～4d，再加入濾液ⅱ，繼續(xù)發(fā)酵10～20h，再加入乙醇，進(jìn)行80～95℃回流提取30～60min，陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅲ，其中加入乙醇體積l與山莓果實重量kg比為2～3：1；

(4)濾液ⅲ在45～55℃減壓進(jìn)行濃縮至原有體積的1/20～1/30，得到濃縮液ⅲ，上硅膠柱吸附濃縮液，用三倍柱體積的石油醚進(jìn)行沖洗，并用兩倍至四倍柱體積的石油醚乙酸乙酯溶液(1：1)進(jìn)行洗脫，得到洗脫液?。?/p>

(5)濾渣ⅱ加入乙醇溶解，上大孔樹脂柱，用兩倍至四倍柱體積的含有60～85％乙醇水溶液對大孔樹脂進(jìn)行洗脫，得到洗脫液ⅱ，并將洗脫液ⅱ進(jìn)行45～55℃減壓濃縮至原來體積的1/8～1/20，得濃縮液ⅱ，其中加入乙醇體積l與濾渣ⅱ重量kg比為0.5～4：1；

(6)將洗脫液ⅰ進(jìn)行45～55℃減壓濃縮至原來體積的1/10～1/15，靜置過夜，過濾，干燥濾渣得山莓素，再重結(jié)晶得山莓素純品；

(7)將濃縮液ⅱ放置在4～8℃靜置過夜結(jié)晶，過濾得結(jié)晶物，即為木犀草素粗品，再在4～8℃重結(jié)晶得木犀草素純品。

上述所采用的大孔樹脂為klfc-150、ab-8、lsa-20、s-9等。

在一個實施方案中，步驟(5)中所述乙醇溶液，是指60～85％乙醇水溶液，其中60％乙醇水溶液的配制方法為60ml無水乙醇加入40ml水混合制成。

在一個實施方案中，步驟(3)中所述3～15％木霉發(fā)酵液中％是指體積質(zhì)量比，加入木霉發(fā)酵液體積l與山莓果實重量kg比。

在一個實施方案中，步驟(1)、(2)、(3)、(6)和(7)中所述過濾，是指采用0.2μm孔徑大小的陶瓷膜過濾一次。

技術(shù)效果

1、本發(fā)明方法操作簡單，大大提高了木犀草素和山莓素的產(chǎn)率，極大地降低了木犀草素和山莓素的生產(chǎn)成本，簡化了其生產(chǎn)過程。

2、使用山莓作為提取原料，既大大提高了山莓的利用效率，又提高了山莓的附加值。

3、該法既避免了木犀草素的破壞和抑菌問題，又促進(jìn)了山莓素的轉(zhuǎn)化。

具休實施方式

下面，本發(fā)明將用實施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任何

一個或類似實例。

實施例1

將100kg山莓果實勻漿，加入250l乙醇進(jìn)行85℃回流提取50min，陶瓷膜過濾一次，得提取液和濾渣??；將提取液在50℃減壓進(jìn)行濃縮至10l，得到濃縮液ⅰ，在3℃保存2h，陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅱ和1.34kg濾渣ⅱ。

將濾渣ⅰ加入10l木霉發(fā)酵液，30℃保存2d，再加入濾液ⅱ，繼續(xù)發(fā)酵20h，再加入200l乙醇，進(jìn)行85℃回流提取60min，陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅲ；濾液ⅲ在55℃減壓進(jìn)行濃縮至8l，得到濃縮液ⅲ，上硅膠柱吸附濃縮液，用25l石油醚進(jìn)行沖洗，并用25l的石油醚乙酸乙酯溶液(1：1)進(jìn)行洗脫，得到洗脫液ⅰ。

將洗脫液ⅰ進(jìn)行55℃減壓濃縮至2l，靜置過夜，過濾，干燥濾渣得山莓素，再重結(jié)晶得216g山莓素純品；濾渣ⅱ加入3l乙醇溶解，上大孔樹脂柱，用10l的含有75％乙醇水溶液對ab-8大孔樹脂進(jìn)行洗脫，得到洗脫液ⅱ，并將洗脫液ⅱ進(jìn)行45℃減壓濃縮至1l，得濃縮液ⅱ；將濃縮液ⅱ放置在4℃靜置過夜結(jié)晶，過濾得結(jié)晶物，即為木犀草素粗品，再在4℃重結(jié)晶得328g木犀草素純品。經(jīng)hplc檢測木犀草素純度為98.45％，山莓素純度為96.02％。

實施例2

將200kg山莓果實勻漿，加入600l乙醇進(jìn)行80℃回流提取60min，陶瓷膜過濾一次，得提取液和濾渣??；將提取液在55℃減壓進(jìn)行濃縮至25l，得到濃縮液ⅰ，在2℃保存2h，陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅱ和2.85kg濾渣ⅱ。

將濾渣ⅰ加入20l木霉發(fā)酵液，28℃保存4d，再加入濾液ⅱ，繼續(xù)發(fā)酵15h，再加入500l乙醇，進(jìn)行80℃回流提取60min，陶瓷膜過濾一次，得濾液ⅲ；濾液ⅲ在55℃減壓進(jìn)行濃縮至20l，得到濃縮液ⅲ，上硅膠柱吸附濃縮液，用60l的石油醚進(jìn)行沖洗，并用70l的石油醚乙酸乙酯溶液(1：1)進(jìn)行洗脫，得到洗脫液ⅰ。

將洗脫液ⅰ進(jìn)行45～55℃減壓濃縮至6l，靜置過夜，過濾，干燥濾渣得山莓素，再重結(jié)晶得562g山莓素純品；濾渣ⅱ加入3.5l乙醇溶解，上s-9大孔樹脂柱，用14l的含有75％乙醇水溶液對大孔樹脂進(jìn)行洗脫，得到洗脫液ⅱ，并將洗脫液ⅱ進(jìn)行55℃減壓濃縮至1l，得濃縮液ⅱ；將濃縮液ⅱ放置在4℃靜置過夜結(jié)晶，過濾得結(jié)晶物，即為木犀草素粗品，再在4℃重結(jié)晶得735g木犀草素純品。經(jīng)hplc檢測木犀草素純度為98.76％，山莓素純度為96.36％。