本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域；具體涉及一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著生活水平的提高和消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，人們對(duì)自身健康和生態(tài)環(huán)境日益關(guān)注。眾所周知，驢產(chǎn)品具有極高的的藥用、保健和營養(yǎng)價(jià)值，驢肉、驢皮、驢乳、驢脂等產(chǎn)品的需求量日益增加。驢產(chǎn)品市場(chǎng)呈現(xiàn)供不應(yīng)求的局面，這也對(duì)驢養(yǎng)殖業(yè)提出了更高的要求。現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)向高效、綠色、無公害、環(huán)保的生態(tài)養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變。
復(fù)合活菌制劑做為微生態(tài)制劑的一種，具有綠色、安全、無抗等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)養(yǎng)殖。其主要由兩種或兩種以上的不同益生菌菌屬組成，將具有不同生物功能的益生菌組合，研制的復(fù)合活菌制劑通過生物拮抗作用、生物奪氧用及及增強(qiáng)免疫等作用以維持胃腸道內(nèi)環(huán)境平衡，且益生菌可在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)生長代謝，產(chǎn)生的各種消化酶能提高驢對(duì)飼料中各種營養(yǎng)成分的消化吸收，提高飼料效率和生長性能。驢用促生長復(fù)合活菌制劑可提高驢養(yǎng)殖業(yè)的綜合效益，具有廣闊的推廣前景，同時(shí)為發(fā)展驢規(guī)?；鷳B(tài)養(yǎng)殖，生產(chǎn)綠色、有機(jī)、無公害驢產(chǎn)品提供技術(shù)支撐，對(duì)于我國驢養(yǎng)殖業(yè)的健康、循環(huán)、可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種活菌數(shù)高、抗逆性強(qiáng)、綠色安全、無毒副作用的驢用促生長復(fù)合活菌制劑。
本發(fā)明的一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑是將干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，分別依次經(jīng)過活化，一級(jí)種子、二級(jí)種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，離心濃縮和噴霧干燥處理后復(fù)配制成，其中干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)比例為：0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2。
所述的一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑，其中所述干酪乳桿菌為干酪乳桿菌sy3，所述解淀粉芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌ssyb，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌sy6。
一種所述驢用促生長復(fù)合活菌制劑的制備方法，其特征在于該促生長生物制劑的工藝是按下述步驟進(jìn)行：
步驟a、將干酪乳桿菌活化，液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，收集發(fā)酵液，再經(jīng)離心濃縮、噴霧干燥，得到粉狀制劑a；
步驟b、將解淀粉芽孢桿菌活化，液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，收集發(fā)酵液，再經(jīng)離心濃縮、噴霧干燥，得到粉狀制劑b；
步驟c、將枯草芽孢桿菌活化，液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，收集發(fā)酵液，再經(jīng)離心濃縮、噴霧干燥，得到粉狀制劑c；
步驟d、然后將粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c復(fù)配，得到驢用促生長復(fù)合活菌制劑。
其中，步驟a中的干酪乳桿菌、步驟b中的解淀粉芽孢桿菌、步驟c中的枯草芽孢桿菌一級(jí)、二級(jí)液體培養(yǎng)用種子液制備方法為：將菌種接種于5ml液體培養(yǎng)基中，置于35-37℃培養(yǎng)一段時(shí)間，完成活化，然后劃線接種，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于5-10ml液體培養(yǎng)基，置于35-37℃培養(yǎng)，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于50-100ml液體培養(yǎng)基中，置于35-37℃培養(yǎng)，即為二級(jí)種子。
優(yōu)選地，其特征在于干酪乳桿菌的菌種及一級(jí)種子均接種于mrs液體培養(yǎng)基中，解淀粉芽孢桿菌及枯草芽孢桿菌的菌種及一級(jí)種子分別接種于營養(yǎng)肉湯中；干酪乳桿菌的菌種劃線接種于mrsa平板上，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的菌種分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上；干酪乳桿菌的菌種及一級(jí)種子的培養(yǎng)條件為微需氧，培養(yǎng)時(shí)間為36-48h，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的菌種及一級(jí)種子的培養(yǎng)條件為振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為24-36h。
其中，步驟a中的干酪乳桿菌的二級(jí)種子于液態(tài)發(fā)酵罐中的液態(tài)深層培養(yǎng)方法為：發(fā)酵培養(yǎng)基為mrs液態(tài)培養(yǎng)基，接種量為2％-5％，裝液量為70％-80％，35-37℃和ph值6.0-7.0條件下微需氧發(fā)酵培養(yǎng)36-48h；步驟b中的解淀粉芽孢桿菌、步驟c中的枯草芽孢桿菌的二級(jí)種子于液態(tài)發(fā)酵罐中的液態(tài)深層培養(yǎng)方法為：發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為1％-3％，裝液量為60％-80％，在120-190rpm、33-35℃和ph值6.0-7.0條件下發(fā)酵培養(yǎng)24-36h。
其中，步驟a中的干酪乳桿菌的二級(jí)種子發(fā)酵液、步驟b中的解淀粉芽孢桿菌的二級(jí)種子發(fā)酵液、步驟c中的枯草芽孢桿菌的二級(jí)種子發(fā)酵液離心濃縮方法為：將發(fā)酵培養(yǎng)液1000ml，以5000-8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10-15min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，加入脫脂乳保護(hù)劑，制備成離心濃縮料液。
優(yōu)選地，步驟a中的干酪乳桿菌的發(fā)酵液離心濃縮時(shí)脫脂乳保護(hù)劑添加量為15-18％w/v；步驟b中的解淀粉芽孢桿菌的二級(jí)種子發(fā)酵液、步驟c中的枯草芽孢桿菌的二級(jí)種子發(fā)酵液離心濃縮時(shí)脫脂乳保護(hù)劑添加量為17-20％w/v。
其中，步驟a中的干酪乳桿菌發(fā)酵液噴霧干燥過程中，設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)為：出口溫度70-80℃、入口溫度120-140℃、入料速度1000-1200ml/h；步驟b中的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液、步驟c中枯草芽孢桿菌發(fā)酵液噴霧干燥過程中，設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)為：出口溫度80-85℃、入口溫度140-150℃、入料速度1300-1500ml/h。
優(yōu)選地，所述驢用促生長復(fù)合活菌制劑的制作方法中步驟d中將粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c、按質(zhì)量比1:1:1復(fù)配。
本發(fā)明的驢用促生長復(fù)合活菌制劑具有活菌數(shù)高、抗逆性強(qiáng)、綠色安全、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)。臨床應(yīng)用證實(shí)，驢用促生長復(fù)合活菌制劑在提高驢頭均日增重，降低料重比的同時(shí)，降低仔驢腹瀉發(fā)病率，減少腹瀉治療用抗生素使用量，適于在規(guī)模化驢養(yǎng)殖場(chǎng)推廣應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)健康養(yǎng)殖，滿足人們對(duì)綠色驢產(chǎn)品的需求。
具體實(shí)施方式
下述使用的干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)sy3公開自2011年第28卷第7期《豬業(yè)科學(xué)》94-95頁的《齊齊哈爾周邊地區(qū)仔豬腸道乳酸桿菌的分離與鑒定》。
解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)ssyb公開自2017年第38卷第4期《家畜生態(tài)學(xué)報(bào)》58-62頁的《一株產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其酶促反應(yīng)適宜條件初步研究》。
枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)sy6公開自2013年第26卷第1期《中國生物制品學(xué)雜志》122-128頁的《豬源枯草芽孢桿菌噴霧干燥工藝的優(yōu)化》。
上述三株微生物饋贈(zèng)獲得！
具體實(shí)施方式一
本實(shí)施方式中一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑是將干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，分別依次經(jīng)過活化，一級(jí)種子、二級(jí)種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，離心濃縮和噴霧干燥處理后復(fù)配制成，其中干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)比例為：0.8:1.2:1.0。
本實(shí)施方式中一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑的制備方法，其特征在于該驢用促生長復(fù)合活菌制劑是按下述步驟進(jìn)行的：
步驟a、將干酪乳桿菌sy3菌種接種5mlmrs液體培養(yǎng)基中，置于37℃微需氧培養(yǎng)36h，完成活化，然后劃線接種于mrsa平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于10mlmrs液體培養(yǎng)基若干支，置于37℃微需氧培養(yǎng)48h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于100mlmrs液體培養(yǎng)基中，置于37℃微需氧培養(yǎng)48h，即為二級(jí)種子。將干酪乳桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為mrs液態(tài)培養(yǎng)基，接種量為5％，裝液量80％，于37℃和ph值7.0條件下微需氧培養(yǎng)48h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取干酪乳桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量18％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度70℃、入口溫度120℃、入料速度1000ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑a；
步驟b、將解淀粉芽孢桿菌ssyb菌種接種5ml營養(yǎng)肉湯中，置于37℃振蕩培養(yǎng)36h，完成活化，然后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于10ml營養(yǎng)肉湯若干支，置于37℃振蕩培養(yǎng)36h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于100ml營養(yǎng)肉湯中，置于37℃振蕩培養(yǎng)36h，即為二級(jí)種子。將解淀粉芽孢桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為3％，裝液量80％，在190rpm/min、35℃和ph值7.0條件下培養(yǎng)36h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量為20％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度85℃、入口溫度150℃、入料速度1500ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑b；
步驟c、將枯草芽孢桿菌sy6菌種接種5ml營養(yǎng)肉湯中，置于37℃振蕩培養(yǎng)36h，完成活化，然后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于10ml營養(yǎng)肉湯若干支，置于37℃振蕩培養(yǎng)36h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于100ml營養(yǎng)肉湯中，置于37℃振蕩培養(yǎng)36h，即為二級(jí)種子。將枯草芽孢桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為3％，裝液量80％，在188rpm、35℃和ph值7.0條件下培養(yǎng)36h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量為20％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度85℃、入口溫度150℃、入料速度1500ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑c；
步驟d、然后將粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c按質(zhì)量比0.8:1.2:1.0復(fù)配；即得到驢用促生長復(fù)合活菌制劑。
微需氧條件為o2濃度為5％、n2濃度為85％、co2濃度為10％。
具體實(shí)施方式二
本實(shí)施方式中一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑是將干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，分別依次經(jīng)過活化，一級(jí)種子、二級(jí)種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，離心濃縮和噴霧干燥處理后復(fù)配制成，其中干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)比例為：1.0:0.8:1.2。
本實(shí)施方式中一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑的制備方法，其特征在于該驢用促生長復(fù)合活菌制劑是按下述步驟進(jìn)行的：
步驟a、將干酪乳桿菌sy3菌種接種5mlmrs液體培養(yǎng)基中，置于35℃微需氧培養(yǎng)48h，完成活化，然后劃線接種于mrsa平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于5mlmrs液體培養(yǎng)基若干支，置于35℃微需氧培養(yǎng)36h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于50mlmrs液體培養(yǎng)基中，置于35℃微需氧培養(yǎng)36h，即為二級(jí)種子。將干酪乳桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為mrs液態(tài)培養(yǎng)基，接種量為2％，裝液量70％，于35℃和ph值6.0條件下微需氧培養(yǎng)36h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取干酪乳桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量15％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度80℃、入口溫度140℃、入料速度1200ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑a；
步驟b、將解淀粉芽孢桿菌ssyb菌種接種5ml營養(yǎng)肉湯中，置于35℃振蕩培養(yǎng)24h，完成活化，然后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于5ml營養(yǎng)肉湯若干支，置于35℃振蕩培養(yǎng)24h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于50ml營養(yǎng)肉湯中，置于35℃振蕩培養(yǎng)24h，即為二級(jí)種子。將解淀粉芽孢桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為1％，裝液量60％，在187rpm、33℃和ph值6.0條件下培養(yǎng)24h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量為17％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度80℃、入口溫度140℃、入料速度1300ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑b；
步驟c、將枯草芽孢桿菌sy6菌種接種5ml營養(yǎng)肉湯中，置于35℃振蕩培養(yǎng)24h，完成活化，然后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于5ml營養(yǎng)肉湯若干支，置于35℃振蕩培養(yǎng)24h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于50ml營養(yǎng)肉湯中，置于35℃振蕩培養(yǎng)24h，即為二級(jí)種子。將枯草芽孢桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為1％，裝液量60％，在122rpm、33.5℃和ph值6.1條件下培養(yǎng)25h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以5000以7990rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量為17.3％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度80℃、入口溫度141℃、入料速度1300ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑c；
步驟d、然后將粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c按質(zhì)量比1.0:0.8:1.2復(fù)配；即得到驢用促生長復(fù)合活菌制劑。
具體實(shí)施方式三
本實(shí)施方式中一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑是將干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，分別依次經(jīng)過活化，一級(jí)種子、二級(jí)種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，離心濃縮和噴霧干燥處理后復(fù)配制成，其中干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)比例為：1.0:1.0:1.0。
本實(shí)施方式中一種驢用促生長復(fù)合活菌制劑的制備方法，其特征在于該驢用促生長復(fù)合活菌制劑是按下述步驟進(jìn)行的：
步驟a、將干酪乳桿菌sy3菌種接種5mlmrs液體培養(yǎng)基中，置于36℃微需氧培養(yǎng)42h，完成活化，然后劃線接種于mrsa平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于8mlmrs液體培養(yǎng)基若干支，置于36℃微需氧培養(yǎng)43h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于78mlmrs液體培養(yǎng)基中，置于36℃微需氧培養(yǎng)42.5h，即為二級(jí)種子。將干酪乳桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為mrs液態(tài)培養(yǎng)基，接種量為3.6％，裝液量76％，于36℃和ph值6.5條件下微需氧培養(yǎng)42h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取干酪乳桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以6500rpm的轉(zhuǎn)速離心12min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量16.5％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度75℃、入口溫度132℃、入料速度1150ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑a；
步驟b、將解淀粉芽孢桿菌ssyb菌種接種5ml營養(yǎng)肉湯中，置于35.8℃振蕩培養(yǎng)28.2h，完成活化，然后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于7ml營養(yǎng)肉湯若干支，置于36℃振蕩培養(yǎng)28h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于75ml營養(yǎng)肉湯中，置于36℃振蕩培養(yǎng)27.9h，即為二級(jí)種子。將解淀粉芽孢桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為2％，裝液量70％，在155rpm/min、34℃和ph值6.5條件下培養(yǎng)27h，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以6490rpm的轉(zhuǎn)速離心13min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量為18.5％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度83℃、入口溫度145℃、入料速度1400ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑b；
步驟c、將枯草芽孢桿菌sy6菌種接種5ml營養(yǎng)肉湯中，置于36℃振蕩培養(yǎng)29h，完成活化，然后劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，選取5個(gè)以上典型菌落，接種于7.5ml營養(yǎng)肉湯若干支，置于35.7℃振蕩培養(yǎng)28h，作為一級(jí)種子，取一級(jí)種子接種于75ml營養(yǎng)肉湯中，置于36℃振蕩培養(yǎng)27.7h，即為二級(jí)種子。將枯草芽孢桿菌二級(jí)種子接種到液態(tài)發(fā)酵罐中，進(jìn)行液態(tài)深層培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，接種量為1.8％，裝液量69％，在156rpm、33.8℃和ph值6.6條件下培養(yǎng)，待活菌數(shù)達(dá)5.0×109cfu/ml以上時(shí)，取枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液體1000ml，以6510rpm的轉(zhuǎn)速離心12.5min，加入100ml無菌生理鹽水重懸菌泥，脫脂乳保護(hù)劑添加量為18.6％w/v，制備成離心濃縮料液。設(shè)定噴霧干燥機(jī)各項(xiàng)噴霧干燥條件參數(shù)：出口溫度82℃、入口溫度144℃、入料速度1400ml/h，進(jìn)行噴霧干燥，得到粉狀制劑c；
步驟d、然后將粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c按質(zhì)量比1.0:1.0:1.0復(fù)配；即得到驢用促生長復(fù)合活菌制劑。
針對(duì)上述實(shí)施例，檢測(cè)驢用促生長符合活菌制劑對(duì)驢的各項(xiàng)生長指標(biāo)、排泄的影響，以及探索干酪乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的在不同溫度下保存對(duì)菌群活力的影響，以及滿足最大生產(chǎn)性能的三種菌配比情況。
1.驢用促生長復(fù)合活菌制劑對(duì)驢仔生長性能及腹瀉影響
在黑龍江省三頭驢農(nóng)業(yè)科技有限公司和齊齊哈爾康和牧業(yè)有限責(zé)任公司驢場(chǎng)進(jìn)行驢用促生長復(fù)合活菌制劑應(yīng)用試驗(yàn)，選擇斷奶后一周的健康仔驢200頭，隨即分成2組，每組100頭。其中，試驗(yàn)組：飼喂常規(guī)飼料和粉狀菌劑；對(duì)照組：飼喂常規(guī)飼料，不添加菌劑，試驗(yàn)周期為21d。復(fù)合活菌制劑飼喂量為1.0×108cfu/d/頭。
試驗(yàn)期內(nèi)記錄每天各組增重和干物質(zhì)攝入量，計(jì)算頭均日增重、采食干物質(zhì)量、料重比(頭均日采食干物質(zhì)量/頭均日增重×100％)。記錄每天各組驢出現(xiàn)腹瀉的頭數(shù)，計(jì)算腹瀉率。腹瀉率＝試驗(yàn)期內(nèi)腹瀉病發(fā)生次數(shù)之和/試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)頭數(shù)×100％。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組驢頭均日增重顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，且料重比也顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，飼喂驢用促生長復(fù)合活菌制劑可提高斷奶仔驢生長性能，具體結(jié)果見表1。
表1復(fù)合活菌制劑對(duì)仔驢生長性能的影響
在預(yù)防仔驢腹瀉方面，試驗(yàn)組仔驢腹發(fā)病率顯著低于對(duì)照組(p<0.05)，飼喂驢用促生長復(fù)合活菌制劑可預(yù)防腹瀉，具體結(jié)果見表2。
表2驢用促生長復(fù)合活菌制劑對(duì)仔驢腹瀉率的影響
2.驢用促生長復(fù)合活菌制劑保存期試驗(yàn)
取活菌制劑干粉，檢測(cè)總菌數(shù)達(dá)到1011cfu/g以上。分別儲(chǔ)存于-20℃，4℃及室溫環(huán)境中，儲(chǔ)存時(shí)間為12個(gè)月，每月檢測(cè)活菌制劑中活菌總數(shù)，參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“ny/t2131-2012飼料添加劑枯草芽孢桿菌”在保存期內(nèi)活菌制劑成品中活菌總數(shù)應(yīng)達(dá)到109cfu/g。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在-20℃儲(chǔ)存溫度條件下，活菌制劑可儲(chǔ)存11個(gè)月以上。在4℃儲(chǔ)存溫度條件下，活菌制劑可儲(chǔ)存8個(gè)月。在室溫條件下，活菌制劑可儲(chǔ)存6個(gè)月。在保存期內(nèi)活菌制劑中活菌總數(shù)可達(dá)到109cfu/g以上，具體結(jié)果見表3。
表3溫度與儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)活菌制劑總活菌數(shù)的影響(單位：cfu/g)
3.不同質(zhì)量配比的復(fù)合活菌制劑對(duì)仔驢生長性能和腹瀉的影響
具體實(shí)施方式一的方法步驟d中將粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c按表4中的質(zhì)量配比混合，進(jìn)行飼喂試驗(yàn)，具體結(jié)果見5。
表4復(fù)合活菌制劑質(zhì)量配比方案
表5不同質(zhì)量配比的復(fù)合活菌制劑對(duì)仔驢生長性能和腹瀉的影響
由表5可知，步驟d中粉狀制劑a、粉狀制劑b、粉狀制劑c按1:1:1的質(zhì)量配比復(fù)配在提高仔驢生長性能和降低腹瀉率方面效果最好。