本發(fā)明屬于益生菌制劑生產(chǎn)工藝領域，涉及一種便于益生菌二次加工的冷凍儲存技術及其在益生菌制劑生產(chǎn)過程中的具體應用。

背景技術：
益生菌制劑的制備過程中，尤其是當產(chǎn)品以顆?；蛘咂瑒┑男问匠霈F(xiàn)時，往往涉及到對益生菌菌種的再加工?，F(xiàn)有的益生菌菌種一般以凍干粉的形式存在，當對益生菌凍干粉再次加工的時候，不可避免的涉及到對凍干粉重新進行復水、濕潤以及與其他物料攪拌、混合等工藝操作，當進行這些操作時，會對益生菌菌株的活性造成損害，不同程度的減少益生菌的活菌數(shù)。因此，研發(fā)一種活菌率高、復水性能好的益生菌菌株，并進一步制備成具有特定功效的益生菌制劑，具有很大的市場前景和經(jīng)濟價值。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種新型的益生菌超低溫冷凍工藝及適合這種工藝的全鹽冷凍保護劑配方，所述工藝為一種益生菌超低溫冷凍顆粒（益生菌冷凍菌株）的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供所述超低溫冷凍工藝制備的益生菌超低溫冷凍顆粒。所述益生菌超低溫冷凍顆粒為益生菌冷凍菌株，其不需要干燥除水，具有冷凍速度快、活菌率高、復水性能好等優(yōu)點。本發(fā)明的再一目的是提供利用所述益生菌超低溫冷凍顆粒制備的益生菌制劑及其制備方法。本發(fā)明提供了一種益生菌超低溫冷凍顆粒的制備方法，所述方法包括以下步驟：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：以重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖1-2%、葡萄糖1-2%、蛋白胨0.5-2%、酵母膏1-5%、檸檬酸氫二銨0.2-1%、K2HPO40.01-0.5%、無水乙酸鈉0.1-0.5%、硫酸鎂0.02-0.1%，余量為蒸餾水，調節(jié)pH為6.0-7.0，配好后滅菌，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將益生菌菌株按照5-10%的接種量接入步驟（1）所得的培養(yǎng)基中，在溫度30-40℃、轉速40-100rpm下培養(yǎng)10-20小時，然后在10-20℃放置2-6小時，得到益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在4-10℃，流量為150ml-3000ml/min條件下，進行管道式離心，得到益生菌菌泥，備用；（4）配制保護劑：以重量百分比計，保護劑中各組分的配比為磷酸氫二鉀1-2%、磷酸二氫鉀1-2%、半胱氨酸鹽酸鹽1-3%、甘油1-2%、乳清粉1-5%、余量為蒸餾水，配好后滅菌，備用；（5）添加保護劑：將步驟（3）所得益生菌菌泥與步驟（4）所得保護劑按重量比1:1-3混合，攪拌均勻形成乳化液；（6）速凍成型：將步驟（5）所得乳化液，按照500g/min的速度噴霧入-195℃液氮中速凍3min，形成均勻的低溫小顆粒，得到益生菌超低溫冷凍顆粒。本發(fā)明所述益生菌超低溫冷凍工藝還包括步驟（7）打撈保存：將步驟（6）形成的益生菌超低溫冷凍顆粒裝入無菌鋁箔袋中，-20℃以下低溫保存待用。優(yōu)選地，步驟（1）中發(fā)酵培養(yǎng)基各組分配比為乳糖1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、檸檬酸氫二銨0.5%、K2HPO40.1%、無水乙酸鈉0.5%、硫酸鎂0.05%，余量為蒸餾水，調節(jié)pH為6.5。步驟（1）在滅菌條件為121℃濕熱滅菌20min。步驟（2）中，所述益生菌菌株為國家衛(wèi)生部公布的可用于食品和保健品的益生菌菌株，包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、兩歧雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、唾液乳桿菌、瑞士乳桿菌、副干酪乳桿菌中的一種或多種，但不限于以上所述菌株。優(yōu)選地，步驟（2）為將益生菌菌株按照5%的接種量接入步驟（1）所得的培養(yǎng)基中，在溫度37-40℃、轉速50rpm下培養(yǎng)15-20小時，然后在10-15℃放置3小時，得到益生菌發(fā)酵液，備用。優(yōu)選地，步驟（3）為將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在8-10℃，流量為1000ml/min條件下，進行管道式離心，離心轉速為14000-16000rpm，得到益生菌菌泥，備用。步驟（3）中，若需要益生菌菌株復配，可先將各菌株形成的菌泥按比例混合，然后按照步驟（4）-（6）方法制備復配的益生菌超低溫冷凍顆粒。步驟（3）中所述益生菌菌泥的得率為8-50g/L。優(yōu)選地，步驟（4）中保護劑中各組分的配比為磷酸氫二鉀1.5%、磷酸二氫鉀1.5%、半胱氨酸鹽酸鹽2%、甘油2%、乳清粉5%、余量為蒸餾水。步驟（4）中，滅菌條件為115℃下滅菌20min。優(yōu)選地，步驟（5）中，將步驟（3）所得益生菌菌泥與步驟（4）所得保護劑按重量比1:3混合，攪拌均勻形成乳化液。本發(fā)明還提供了所述超低溫冷凍工藝制備的益生菌超低溫冷凍顆粒。本發(fā)明還提供了所述益生菌超低溫冷凍顆粒在制備益生菌制劑中的應用。本發(fā)明還提供了一種利用所述益生菌超低溫冷凍顆粒制備的益生菌制劑。所述益生菌制劑為由高活菌數(shù)的益生菌菌株（即本發(fā)明所述益生菌超低溫冷凍顆粒）單獨或者與營養(yǎng)功能物質及其他輔料復配制備的益生菌制劑。所述營養(yǎng)功能物質包括益生元、益生菌菌粉、膳食纖維、維生素、DHA、國家允許使用的營養(yǎng)強化劑等。優(yōu)選地，所述益生元為低聚果糖、低聚半乳糖、母乳低聚糖中的一種或者多種。優(yōu)選地，所述膳食纖維為菊粉、β-聚葡萄糖、果膠、抗性淀粉、半纖維素、纖維素中的一種或多種。優(yōu)選地，所述維生素為維生素A、D、E、K、B1、B2、B12、C中的一種或多種。優(yōu)選地，所述益生菌制劑的劑型為顆粒型或者片劑型。本發(fā)明還提供了一種利用所述益生菌超低溫冷凍顆粒制備益生菌制劑的方法，所述方法包括如下步驟：（1）配制復配原料，其包括干物料和所述益生菌超低溫冷凍顆粒，將所述干物料的各原料干燥、粉碎、過80目篩形成均勻的細粉；（2）將干物料各原料的細粉混合均勻；（3）將益生菌超低溫冷凍顆粒從-20℃存儲條件下取出，室溫溶融重新形成菌懸液，菌懸液的質量不超過復配原料總質量的15%；（4）將菌懸液與步驟（2）混勻的干物料混合均勻，制成濕軟材；（5）將濕軟材制成濕顆粒；（6）將濕顆粒在低于30℃真空條件下干燥至含水量低于5%，制成顆粒型產(chǎn)品或加工成片劑型產(chǎn)品。步驟（1）中，所述干物料包含營養(yǎng)功能物質，如益生元、益生菌菌粉、膳食纖維、維生素、DHA中的一種或多種；還包含制?；蛘咧破^程中按照功能設計所需的輔料，如賦形劑、支撐劑、助流劑、崩解劑、調味劑或吸潮劑等。所述干物料包括制?；蛘咧破璧闹蝿┗蛸x形劑如淀粉、乳糖、白砂糖等；還包括賦予顆?；蛘咂瑒┛谖兜奶鹞秳┗蛘哒{味劑如：白糖、甜菊糖、木糖醇、赤蘚糖醇、異麥芽糖醇、食用香精、甜橙粉和其他水果粉等；還包括使顆?；蚱瑒┚邆涓萌芙庑裕ū澜庑裕┑谋澜鈩┤玺燃谆矸垅c、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、泡騰崩解劑等；還可包括幫助更好形成完善顆粒或者片劑形態(tài)的一些吸潮劑、助流劑或者其他功能的輔料如：硬脂酸鎂、滑石粉、預膠化淀粉等；同時還包括賦予片劑或者顆粒劑特定功能的營養(yǎng)功能性物質，包括但不限于益生元、益生菌粉、膳食纖維、維生素、DHA、國家允許使用的營養(yǎng)強化劑中的一種或多種。優(yōu)選地，所述益生元為低聚果糖、低聚半乳糖、母乳低聚糖中的一種或者多種。優(yōu)選地，所述膳食纖維為菊粉、β-聚葡萄糖、果膠、抗性淀粉、半纖維素、纖維素中的一種或多種。優(yōu)選地，所述維生素為維生素A、D、E、K、B1、B2、B12、C中的一種或多種。步驟（3）中，因為益生菌超低溫冷凍顆粒本身含水，室溫溶融可形成菌懸液，將益生菌超低溫冷凍顆粒溶融時，可以根據(jù)需要加入適量10%奶粉溶液或者生理鹽水，室溫溶解重新形成菌懸液。步驟（5）中，將濕軟材通過一次性制粒機或者旋轉擠壓制粒機制成濕顆粒。本發(fā)明具有如下有益效果：（1）保護劑是在低溫冷凍過程中保護菌株不受傷害的必須措施。本發(fā)明所用保護劑為全鹽配方，除了能夠有效保護菌株冷凍過程中的活性以外，相較于一些有機含量較多的保護劑，對溶液的凝固點降低較小，可以讓冷凍顆粒在相對較高的溫度存儲。本發(fā)明的益生菌超低溫冷凍顆粒儲存溫度低于零下20℃即可以，而有機物含量較高的凍干或冷凍保護劑所生產(chǎn)的冷凍顆粒，儲存條件必須低于零下40℃。（2）本發(fā)明所述益生菌超低溫冷凍工藝生產(chǎn)的益生菌超低溫冷凍顆粒，省去了常規(guī)益生菌凍干粉生產(chǎn)所需要的干燥步驟，節(jié)省了生產(chǎn)成本，且由于瞬時冷凍，益生菌菌株的活力得到了更有效的保存。相對于各菌株的常規(guī)冷凍干燥工藝，采用瞬時超低溫冷凍技術，活菌率可以提高2%-50%。（3）所述益生菌超低溫冷凍顆粒為益生菌冷凍菌株，其不需要干燥除水，具有冷凍速度快、活菌率高、復水性能好等優(yōu)點。（4）本發(fā)明所述益生菌制劑制備方法涉及益生菌超低溫冷凍顆粒形成與益生菌超低溫冷凍顆粒再加工兩個步驟，本發(fā)明的優(yōu)勢在于第一步的益生菌超低溫冷凍顆粒的產(chǎn)品形態(tài)和性質相對于常規(guī)冷凍干燥菌粉對再加工工藝的性能要求更接近，因此更易于在加工過程中保存益生菌的活力。（5）本發(fā)明制得的益生菌制劑中的活菌率大于88%。相對于常規(guī)低溫冷凍干燥菌粉，用益生菌超低溫冷凍顆粒與其他原料復配制備益生菌顆粒劑和片劑的好處在于，益生菌超低溫冷凍顆粒本身含水，能更快速的溶解于溶液中，并且可以避免常規(guī)低溫冷凍干燥菌粉復水時對益生菌細胞的損傷，可以大大提高益生菌制劑的活菌含量水平。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，本發(fā)明實施例中所用的實驗材料、試劑和儀器等均可市售獲得，若未具體指明，實施例中所用的技術手段均為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌購自江陰新申奧生物科技有限公司；嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；長雙岐桿菌購自上海潤盈生物技術有限公司。菊粉購自上海吉天食品有限公司、藻油粉（DHA）購自美國馬泰克公司、甜橙粉購自天津真如果食品工業(yè)有限公司、滑石粉和硬脂酸鎂購自鄭州眾信化工產(chǎn)品有限公司、β-聚葡萄糖購自上海博程膳食纖維發(fā)展有限公司、赤蘚糖醇和甜菊糖購自上海甘源實業(yè)有限公司。實施例1制備益生菌超低溫冷凍顆粒本實施例所述益生菌超低溫冷凍顆粒的制備方法如下：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：配置5L培養(yǎng)基，按重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、檸檬酸氫二銨0.5%、K2HPO40.1%、無水乙酸鈉0.5%、硫酸鎂0.02%，余量為蒸餾水，調節(jié)pH為6.5，配制好后，121℃滅菌20min，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌分別按照5%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度37℃、轉速50rpm條件下培養(yǎng)16小時，然后在15℃放置3小時，得益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在10℃，流量為2000ml/min條件下，進行管道式離心，離心轉速為14000rpm，得益生菌菌泥，嗜熱鏈球菌得菌泥12g/L，乳雙歧桿菌得菌泥11g/L，保加利亞乳桿菌得菌泥8g/L；（4）將嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌菌泥按重量比5:1復配形成發(fā)酵劑復合菌泥；乳雙歧桿菌菌泥單獨處理；（5）配制保護劑：按重量百分比計，保護劑中各組分的配比為磷酸氫二鉀1.5%、磷酸二氫鉀1.5%、半胱氨酸鹽酸鹽2%、甘油2%、乳清粉5%、余量為蒸餾水,配制量24L，115℃下滅菌20min；（6）添加保護劑：將步驟（4）所配的發(fā)酵劑復合菌泥、乳雙歧桿菌菌泥分別與步驟（5）所配保護劑按照重量比1:3混合，攪拌均勻形成乳化液；（7）速凍成型：將步驟（6）所得乳化液，以500g/min的速度噴霧入-195℃液氮中速凍3min，形成均勻的低溫小顆粒，得到超低溫冷凍發(fā)酵劑顆粒和乳雙歧桿菌超低溫冷凍顆粒；（8）打撈保存：將步驟（7）形成的兩種益生菌超低溫冷凍顆粒分別裝入無菌鋁箔袋中，-20℃以下低溫保存待用。實施例2一種可直接口服的酸奶發(fā)酵劑顆粒本實施例的一種可直接口服的酸奶發(fā)酵劑顆粒的制備方法包括如下步驟：（1）配制10kg的復配原料，包括干物料和實施例1制備的兩種益生菌超低溫冷凍顆粒，干物料的組成為淀粉2kg、甜橙粉1kg、赤蘚糖醇3kg、乳糖2kg、β-聚葡萄糖1kg，所有原材料過80目篩形成制粒用細粉；（2）將上述干物料在混料機中混合均勻；（3）在-20℃存儲條件下，取出0.4kg實施例1制得的超低溫冷凍發(fā)酵劑顆粒和0.6kg實施例1制得的雙歧桿菌顆粒，室溫溶融重新形成菌懸液，得到0.4kg超低溫冷凍發(fā)酵劑顆粒的菌懸液和0.6kg乳雙歧桿菌超低溫冷凍顆粒的菌懸液；（4）將步驟（3）溶融后的菌懸液與步驟（2）混合好的干物料混合，用濕法混料機，混合3min形成均勻的濕軟材；（5）將上述濕軟材直接用旋轉擠壓制粒機制備成桿狀濕顆粒，將此濕顆粒在30℃真空干燥為含水量低于5%的干顆粒，包裝形成既可以直接吃又可以發(fā)酵酸奶的可即食酸奶發(fā)酵顆粒。本實施例制備的可即食酸奶發(fā)酵劑顆粒，每克的酸奶發(fā)酵能力為1-3kg牛奶，總活菌含量大于60億cfu/g,制備過程中的活菌率為95%。實施例3制備益生菌超低溫冷凍顆粒本實施例所述益生菌超低溫冷凍顆粒的制備方法如下：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：配置5L培養(yǎng)基，按重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖2%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏2.5%、檸檬酸氫二銨1%、K2HPO40.5%、無水乙酸鈉0.1%、硫酸鎂0.05%，余量為蒸餾水，用NaOH溶液調節(jié)pH為6.5，配制好后121℃滅菌20min，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌分別按照5%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度37℃下培養(yǎng)16小時，攪拌轉速為50rpm，然后在15℃放置5小時，得益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在8℃，流量為1000ml/min條件下，進行管道式離心，離心轉速16000rpm，得益生菌菌泥，嗜熱鏈球菌得菌泥12g/L，嗜酸乳桿菌菌泥10g/L，鼠李糖乳桿菌12g/L；（4）將嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌菌泥按重量比5:1:1復配形成發(fā)酵劑復合菌泥；（5）配制保護劑：按重量百分比計，保護劑中各組分的配比為磷酸氫二鉀2%、磷酸二氫鉀2%、半胱氨酸鹽酸鹽1%、甘油1.5%、乳清粉2.5%、余量為蒸餾水,配制量為48升，115℃下滅菌20min；（6）添加保護劑：將步驟（4）所配的發(fā)酵劑復合菌泥與步驟（5）所配保護劑按照重量比1:2.5混合，攪拌均勻形成乳化液；（7）速凍成型：將步驟（6）所得乳化液，以500g/min的速度噴霧入-195℃液氮中速凍3min，形成均勻的低溫小顆粒，得到益生菌超低溫冷凍顆粒；（8）打撈保存：將步驟（7）形成的益生菌超低溫冷凍顆粒分別裝入無菌鋁箔袋中，-20℃以下低溫保存待用。實施例4一種可直接口服的酸奶發(fā)酵劑片劑本實施例的一種可直接口服的酸奶發(fā)酵劑片劑的制備方法包括如下步驟：（1）配制復配原料，包括干物料和實施例3制備的益生菌超低溫冷凍顆粒，干物料的組成為淀粉2kg、菊粉1kg、赤蘚糖醇2.5kg、藻油粉（DHA）0.5kg、乳糖2kg、β-聚葡萄糖1kg，所有原材料過80目篩形成制粒用細粉；（2）將上述干物料在混料機中混合均勻；（3）從-20℃存儲條件下，取出1kg實施例3制得的益生菌超低溫冷凍顆粒，常溫溶融重新形成菌懸液，得到1kg益生菌超低溫冷凍顆粒的菌懸液；（4）將步驟（3）溶融后的菌懸液與步驟（2）混合好的干物料混合，在一體式濕法制粒機中制成目數(shù)為20-30目的濕顆粒；（5）將上述濕顆粒在30℃條件下真空干燥為含水量低于5%的干顆粒，得中間顆粒；（6）以重量百分比計，將0.5%的硬脂酸鎂、0.8%的滑石粉和98.7%中間顆粒混合均勻，壓片得可即食酸奶發(fā)酵劑的片劑。本實施例制得的片劑可以直接口服，每片重1g可以發(fā)酵1-3kg牛奶，每片的總活菌量大于50億cfu/片，制備過程中的活菌存活率為88%。實施例5制備益生菌超低溫冷凍顆粒本實施例所述益生菌超低溫冷凍顆粒的制備方法如下：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：配置5L培養(yǎng)基，按重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、檸檬酸氫二銨0.2%、K2HPO40.2%、無水乙酸鈉0.2%、硫酸鎂0.1%，余量為蒸餾水，用NaOH溶液調節(jié)pH為6.5，配制好后在115℃條件下滅菌20min，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將長雙岐桿菌按照5%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度37℃下培養(yǎng)20小時，轉速為50rpm，然后在15℃放置3小時，得益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在10℃，流量為2000ml/min條件下，進行管道式離心，離線轉速為16000rpm，得益生菌菌泥10g/L，備用；（4）配制保護劑：按重量百分比計，保護劑各組分的配比為磷酸氫二鉀1%、磷酸二氫鉀1%、半胱氨酸鹽酸鹽3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量為蒸餾水，115℃滅菌20分鐘，待冷卻后備用；（5）將10g步驟（3）所得菌泥與20g步驟（4）所得保護劑混合均勻，形成乳化液，將乳化液用泵以500g/min的速度噴霧入-195℃液氮中速凍3min，形成均勻的低溫小顆粒，得到益生菌超低溫冷凍顆粒；（6）打撈保存：將步驟（5）形成的益生菌超低溫冷凍顆粒分別裝入無菌鋁箔袋中，-20℃以下低溫保存待用。實施例6一種含益生元和維生素強化的益生菌顆粒制劑本實施例的一種含益生元和維生素強化的益生菌制劑的制備方法包括如下步驟：（1）配制復配原料，包括干物料和實施例5制備的益生菌超低溫冷凍顆粒，干物料的組成為淀粉0.5kg、菊粉3kg、赤蘚糖醇3kg、低聚半乳糖3kg，維生素A70mg，維生素D0.7mg，維生素E3g，維生素B13g，維生素C25g，所有原材料過80目篩形成制粒用細粉；（2）將上述干物料在混料機中混合均勻；（3）從-20℃存儲條件下，取出0.9kg實施例5制得的益生菌超低溫冷凍顆粒，常溫溶融重新形成菌懸液，得到0.9kg益生菌超低溫冷凍顆粒的菌懸液；（4）將步驟（3）溶融后的菌懸液與步驟（2）混合好的干物料混合，在一體式濕法制粒機中制備為雪花狀30-50目的濕顆粒；（5）將上述濕顆粒在30℃條件下真空干燥為含水量低于5%的干顆粒。本實施例制備的益生菌顆粒制劑，不但可以補充腸道雙歧桿菌，而且強化了益生元與益生菌的配合，更有利于維護腸道健康；特別強化了維生素補充，符合國家營養(yǎng)強化劑使用的相關規(guī)范，更有利于人體健康。實施例7制備益生菌超低溫冷凍顆粒本實施例所述益生菌超低溫冷凍顆粒的制備方法如下：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：配置5L培養(yǎng)基，按重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、檸檬酸氫二銨0.2%、K2HPO40.2%、無水乙酸鈉0.2%、硫酸鎂0.1%，余量為蒸餾水，用NaOH溶液調節(jié)pH為6.5，配制好后在115℃條件下滅菌20min，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將保加利亞乳桿菌按照5%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度37℃下培養(yǎng)20小時，轉速為50rpm，然后在15℃放置3小時，得益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在10℃，流量為2000ml/min條件下，進行管道式離心，離心轉速為16000rpm，得益生菌菌泥9g/L，備用；（4）配制保護劑：按重量百分比計，保護劑各組分的配比為磷酸氫二鉀1%、磷酸二氫鉀1%、半胱氨酸鹽酸鹽3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量為蒸餾水，115℃滅菌20min，待冷卻后備用；（5）將9g步驟（3）所得菌泥與27g步驟（4）所得保護劑混合均勻，形成乳化液，將乳化液用泵以500g/min的速度噴霧入-195℃液氮中速凍3min，形成均勻的低溫小顆粒，得到益生菌超低溫冷凍顆粒；（6）打撈保存：將步驟（5）形成的益生菌超低溫冷凍顆粒分別裝入無菌鋁箔袋中，-20℃以下低溫保存待用。實驗例1對比測試采用超低溫冷凍技術保存的保加利亞乳桿菌與采用常規(guī)真空冷凍干燥技術保存的保加利亞乳桿菌在活菌存活率方面的差異本實驗例對比實施例7制備的保加利亞乳桿菌超低溫冷凍顆粒與常規(guī)真空冷凍干燥技術制備的保加利亞乳桿菌凍干菌粉在活菌存活率方面的差異，其中，常規(guī)真空冷凍干燥技術制備保加利亞乳桿菌凍干菌粉的實驗方法如下：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：配置5L培養(yǎng)基，按重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、檸檬酸氫二銨0.2%、K2HPO40.2%、無水乙酸鈉0.2%、硫酸鎂0.1%，余量為蒸餾水，用NaOH溶液調節(jié)pH為6.5，配制好后在115℃條件下滅菌20min，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將保加利亞乳桿菌按照5%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度37℃下培養(yǎng)20小時，轉速為50rpm，然后在15℃放置3小時，得益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在10℃，流量為2000ml/min條件下，進行管道式離心，離線轉速為16000rpm，得益生菌菌泥9g/L，備用；（4）配制保護劑：按重量百分比計，保護劑各組分的配比為磷酸氫二鉀1%、磷酸二氫鉀1%、半胱氨酸鹽酸鹽3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量為蒸餾水，115℃滅菌20分鐘，待冷卻后備用；（5）將9g步驟（3）所得菌泥與27g步驟（3）所得保護劑混合均勻，形成乳化液，將乳化液直接裝盤放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥,凍干條件為：速凍至-45℃，真空度維持在20～40pa，待觀測到凍干菌泥上出現(xiàn)裂紋，升溫至25℃，在25℃控溫維持所述真空度繼續(xù)干燥10小時，整個真空冷凍干燥過程耗時30小時。最終所得保加利亞乳桿菌凍干菌粉的含水量低于5%。將上述離心后所得菌泥、實施例7制備的保加利亞乳桿菌超低溫冷凍顆粒與常規(guī)真空冷凍干燥技術制備的保加利亞乳桿菌凍干菌粉按照GB4789.35所述方法比較二種方法對保加利亞乳桿菌存活率的影響。結果見下表1：表1由表1的實驗結果可以看出，采用本發(fā)明所述超低溫冷凍技術制得的保加利亞乳桿菌超低溫冷凍顆粒，雖然降低了單位活菌量，但是總活菌比常規(guī)真空冷凍干燥技術制得的保加利亞乳桿菌凍干菌粉高出50%，減少了菌體的損失，降低了生產(chǎn)的成本。還需指出的是，保護劑是在低溫冷凍過程中保護菌株不受傷害的必須措施。本發(fā)明所用保護劑為全鹽配方，除了能夠有效保護菌株冷凍過程中的活性以外，相較于一些有機含量較多的保護劑，對溶液的凝固點降低較小，可以讓冷凍顆粒在相對較高的溫度存儲。本發(fā)明的益生菌超低溫冷凍顆粒儲存溫度低于零下20℃即可以，而有機物含量較高的凍干或冷凍保護劑所生產(chǎn)的凍干顆粒，儲存條件必須低于零下40℃。實驗例2對比測試采用超低溫冷凍技術制備的益生菌菌株與采用常規(guī)真空冷凍干燥技術制備的益生菌凍干菌粉采用同樣工藝制備的益生菌制劑對菌株存活率的影響本實驗例對比了實施例5制備的長雙歧桿菌超低溫冷凍顆粒和采用常規(guī)真空冷凍干燥技術制備的長雙歧桿菌凍干菌粉，按照實施例6所述的益生菌制劑制備工藝制得的益生菌制劑中的長雙岐桿菌的存活率。其中，常規(guī)真空冷凍干燥技術制備長雙岐桿菌凍干菌粉的實驗方法如下：（1）配制發(fā)酵培養(yǎng)基：配置5L培養(yǎng)基，按重量百分比計，培養(yǎng)基中各組分配比為乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、檸檬酸氫二銨0.2%、K2HPO40.2%、無水乙酸鈉0.2%、硫酸鎂0.1%，余量為蒸餾水，用NaOH溶液調節(jié)pH為6.5，配制好后在115℃條件下滅菌20min，備用；（2）培養(yǎng)益生菌：將長雙岐桿菌按照5%的接種量接入上述培養(yǎng)基中，在溫度37℃下培養(yǎng)20小時，轉速為50rpm，然后在15℃放置3小時，得益生菌發(fā)酵液，備用；（3）離心處理：將步驟（2）所得益生菌發(fā)酵液在10℃，流量為2000ml/min條件下，進行管道式離心，離線轉速為16000rpm，得益生菌菌泥10g/L，備用；（4）配制保護劑：按重量百分比計，保護劑各組分的配比為磷酸氫二鉀1%、磷酸二氫鉀1%、半胱氨酸鹽酸鹽3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量為蒸餾水，115℃滅菌20分鐘，待冷卻后備用；（5）將10g步驟（3）所得菌泥與20g步驟（4）所得保護劑混合均勻，形成乳化液，將乳化液直接裝盤放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥,凍干條件為：速凍至-45℃，真空度維持在20～40pa，待觀測到凍干菌泥上出現(xiàn)裂紋，升溫至25℃，在25℃控溫維持所述真空度繼續(xù)干燥10小時，整個真空冷凍干燥過程耗時30小時。最終所得保加利亞乳桿菌凍干菌粉的含水量低于5%。按照GB4789.35的方法測定實施例5制備的長雙歧桿菌超低溫冷凍顆粒和采用常規(guī)真空冷凍干燥技術制備的長雙歧桿菌凍干菌粉的活菌含量，結果表明常規(guī)真空冷凍干燥技術制備的長雙岐桿菌凍干菌粉的活菌含量為：1.5×1011cfu/g；實施例5制備的長雙歧桿菌超低溫冷凍顆粒的活菌含量為：6×1010cfu/g。制備益生菌制劑的方法如下：（1）稱取0.9kg長雙歧桿菌超低溫冷凍顆粒，直接常溫溶融后得到0.9kg菌懸液，與實施例6步驟（2）所述干物料混合均勻形成濕軟材；（2）稱取長雙岐桿菌凍干菌粉0.36kg與實施例6步驟（2）所述干物料混合均勻，然后加入0.54kg生理鹽水溶液混合均勻形成濕軟材；（3）將步驟（1）和步驟（2）制得的濕軟材按照實施例6所述工藝制備長雙岐桿菌的益生菌制劑，制備好的益生菌制劑按照GB4789.35所述方法測活菌含量，比較二種益生菌制劑中的長雙岐桿菌的存活率。結果見下表2：表2由表2的實驗結果可以看出，采用本發(fā)明所述超低溫冷凍技術在制備顆粒型或者片劑型益生菌制劑的運用上，活菌率比常規(guī)真空凍干菌粉高了36%，能大大降低制備過程中的活菌損失，降低了生產(chǎn)的成本。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式及試驗，對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。