本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及動(dòng)物精液低溫和冷凍保存液的制作，特別涉及一種馬用精子低溫及冷凍保存稀釋液。
背景技術(shù)：
我國(guó)是養(yǎng)馬業(yè)大國(guó)，馬匹數(shù)量居世界第二位。作為一種主要的大家畜，馬曾經(jīng)與人類(lèi)生產(chǎn)生活息息相關(guān)，機(jī)械工業(yè)興起后，馬的役用價(jià)值弱化，逐漸淡出人們生活。近些年，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，以產(chǎn)品、文化休閑為主的現(xiàn)代馬業(yè)在我國(guó)悄然興起，現(xiàn)代馬業(yè)的發(fā)展迫切需要采用人工授精的方式進(jìn)行馬匹改良，精液的體外保存(低溫及冷凍保存)是目前馬匹人工授精過(guò)程中的技術(shù)核心。
自從1950年Czechoslovakia首次報(bào)道了將煮沸的牛奶用于精液體外保存后，這一簡(jiǎn)單易于獲取的天然精液稀釋液被廣泛的用于牛、山羊、綿羊及馬的精液保存。直到今天，幾乎所有的馬精液保存液均以脫脂奶作為其主要成分。然而這種基于奶的精液稀釋液存在如下幾個(gè)問(wèn)題，第一，不同個(gè)體、不同產(chǎn)奶期乳成分變異較大，由此導(dǎo)致稀釋液批次間不穩(wěn)定，無(wú)法實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；第二，奶中除了對(duì)精子保存有利的物質(zhì)外，還含有某些對(duì)精子保存不利的成分，不做區(qū)分的應(yīng)用脫脂乳會(huì)對(duì)精子保存產(chǎn)生一定的負(fù)面影響；第三，天然奶是一種膠體溶液，其主要成分酪蛋白均以酪蛋白顆粒的形式存在，這種顆粒在長(zhǎng)期低溫儲(chǔ)存和冷凍條件下易于聚合產(chǎn)生沉淀，這一性質(zhì)導(dǎo)致以天然奶為基礎(chǔ)的精液稀釋儲(chǔ)存期較短。
1949年英國(guó)科學(xué)家Polge、Smith和Parkes等發(fā)現(xiàn)甘油對(duì)低溫冷凍精液的保護(hù)作用后，家畜精液冷凍技術(shù)才出現(xiàn)重大突破。但以甘油作為抗凍劑應(yīng)用于馬精子冷凍并未取得理想效果。已經(jīng)意識(shí)到相同冷凍劑對(duì)不同的細(xì)胞組織的冷凍保護(hù)效果存在顯著差異，因此,針對(duì)馬精子細(xì)胞應(yīng)該尋找更加適合的抗凍劑進(jìn)行冷凍保護(hù)。
普通體細(xì)胞主要依靠周?chē)h(huán)境和胞內(nèi)的抗氧化酶和天然抗氧化劑清除多余活性氧。精子作為一類(lèi)高度分化的特殊細(xì)胞，極具簡(jiǎn)化的細(xì)胞質(zhì)使其喪失了攜帶大量抗氧化劑和自身修復(fù)氧化損傷的能力。因此精子抗氧化途徑主要依靠周?chē)h(huán)境中的抗氧化物。精子體外保存過(guò)程中稀釋液即為其所處的環(huán)境，因此稀釋液中抗氧化劑對(duì)保護(hù)精子免受氧化損傷至關(guān)重要意義。
為了克服以上基于天然奶或奶成分制備的精液稀釋液的缺點(diǎn)，研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的精液稀釋液，我們研究團(tuán)隊(duì)從2012年至今開(kāi)展了系列研究發(fā)明了一種馬用精子低溫和冷凍保存稀釋液，其應(yīng)用效果優(yōu)于國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品。
相關(guān)檢索未發(fā)現(xiàn)與本專(zhuān)利權(quán)利要求相似的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于針對(duì)目前精液保存稀釋液的不足之處，提供一種用于精液低溫和冷凍保存的稀釋液及其制備方法，能有效提高馬精液低溫和冷凍解凍后的精子活率及配種受胎率。與常規(guī)方法比，該方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，技術(shù)效果尤其顯著。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是：
一種馬精子低溫及保存稀釋液，所述精子低溫保存稀釋液由糖鹽溶液焦磷酸鈉、酪蛋白酸鈉(sodium caseinate，SC)、乳清蛋白(whey protein，WP)、抗氧化劑、組合抗生素及去離子水組合而成。
所述糖鹽溶液制作方法及添加量：稱(chēng)量碳酸氫鈉0.33g，羥乙基哌嗪乙磺酸4.766g，二水合檸檬酸鈉0.375g,一水合檸檬酸鉀0.615g,氫氧化鈉0.2g,乳糖27g,葡萄糖18.27g，肌醇0.01g溶解于800ml去離子水中，再用1000ml容量瓶加去離子水定容至1000ml。每1000ml所述馬精子低溫保存液中添加該糖鹽溶液999ml。
所述組合抗生素制作方法及添加量：稱(chēng)量慶大霉素2g、新霉素6g、安普霉素6.8g、粘菌素2.4g、兩性霉素0.01g溶解于40ml去離子水中。每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入1ml混合抗生素。
所述焦磷酸鈉添加量為：每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入0.02g。
所述酪蛋白酸鈉添加量為：每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入10-40g。
所述乳清蛋白添加量為：每1000ml所述馬精子低溫保存液中加入5-10g。
所述抗氧化劑及其添加量為，每1000ml所述馬精子低溫保存液中添加甘氨酸(Gly)1g、?；撬?Tau)3g、甲流氨酸(Met)3.75g、維生素E(Ve)0.5ml。
一種用于馬精子冷凍保存的稀釋液，所述精子冷凍保存的稀釋液由上述馬精子低溫保存液、抗凍劑和雞卵黃組合而成。
所述馬精子低溫保存稀釋液的添加量為：每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加865ml。
所述抗凍劑包含單一抗凍劑或組合抗凍劑。
所述單一抗凍劑為：甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺，每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加35ml甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺。
所述組合抗凍劑的制作方法及添加量為：
組合1：1/3甘油與2/3甲基甲酰胺；
組合2：2/3甘油與1/3甲基甲酰胺；
組合3：1/3甘油與2/3二甲基甲酰胺；
組合4：2/3甘油與1/3二甲基甲酰胺；
組合5：1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺；
組合6：1/3二甲基甲酰胺與2/3甲基甲酰胺；
組合7：1/3甘油1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺；
每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加35ml組合抗凍劑。
所述雞卵黃的添量為：每1000ml所述馬精子冷凍保存液中添加100ml。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1混合抗生素的制備
稱(chēng)量慶大霉素2g、新霉素6g、安普霉素6.8g、粘菌素2.4g、兩性霉素0.01g溶解于40ml去離子水中，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例2組合抗凍劑的制備
組合1：1/3甘油與2/3甲基甲酰胺
組合2：2/3甘油與1/3甲基甲酰胺
組合3：1/3甘油與2/3二甲基甲酰胺
組合4：2/3甘油與1/3二甲基甲酰胺
組合5：1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺
組合6：1/3二甲基甲酰胺與2/3甲基甲酰胺
組合7：1/3甘油1/3甲基甲酰胺與2/3二甲基甲酰胺
實(shí)施例3糖鹽溶液
稱(chēng)量碳酸氫鈉0.33g，羥乙基哌嗪乙磺酸4.766g，二水合檸檬酸鈉0.375g,一水合檸檬酸鉀0.615g,氫氧化鈉0.2g,乳糖27g,葡萄糖18.27g，肌醇0.01g溶解于800ml去離子水中，添加1ml混合抗生素，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加去離子水定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例4酪蛋白酸鈉的保護(hù)作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉1g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例5乳清蛋白的保護(hù)作用
稱(chēng)量乳清蛋白1g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例6酪蛋白酸鈉和乳清蛋白的協(xié)同保護(hù)作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉1g及乳清蛋白1g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例7不同濃度的酪蛋白酸鈉和乳清蛋白的協(xié)同保護(hù)作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉1、2或4g及乳清蛋白0.5、1或2g按照表1分別溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
表1不同濃度的酪蛋白酸鈉和乳清蛋白的協(xié)同保護(hù)作用分組配置表
注釋?zhuān)豪业鞍姿徕c(sodium caseinate，SC)，乳清蛋白(whey protein，WP)
實(shí)施例8焦磷酸鈉的作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，焦磷酸鈉0.004g,0.02g或0.04g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例9抗氧化劑的作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，焦磷酸鈉0.02g溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml；分成5份，向其中分別加入1g甘氨酸或3g?；撬峄?.75g甲硫氨酸或0.5ml維生素E，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例10單一抗凍劑的抗凍保護(hù)作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，焦磷酸鈉0.02g，甘氨酸1g，?；撬?g，甲硫氨酸3.75g和維生素E 0.5ml溶解于800ml去離子水中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml；量取865ml，向其中加入100ml雞卵黃和35ml甲基甲酰胺或二甲基甲酰胺，攪拌均勻，置于4℃冰箱中備用。
實(shí)施例11組合抗凍劑的抗凍保護(hù)作用
稱(chēng)量酪蛋白酸鈉4g，乳清蛋白1g，肌醇0.01g，焦磷酸鈉0.02g，甘氨酸1g，牛磺酸3g，甲硫氨酸3.75g和維生素E 0.5ml溶解于800ml糖鹽溶液中，攪拌均勻后，再用1000ml容量瓶加糖鹽溶液定容至1000ml；量取865ml，向其中加入100ml雞卵黃和35ml 7種組合抗凍劑之一，攪拌均勻，置于4℃冰箱中備用。
試驗(yàn)例1
下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)酪蛋白酸鈉和乳清蛋白在馬精子低溫保存中的作用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進(jìn)行精液保存實(shí)驗(yàn)，用母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
1不濃縮精液低溫保存(含有25％精清)
將過(guò)濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲(chǔ)存，48h后檢測(cè)精液活力參數(shù)。
2濃縮后精液低溫保存(不含精清)
過(guò)濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液低溫保存稀釋液稀釋至50×106個(gè)/ml濃度置于5℃儲(chǔ)存，48h后檢測(cè)精液活力參數(shù)。
(三)精液質(zhì)量評(píng)價(jià)
用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測(cè)腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀下，進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運(yùn)動(dòng)精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質(zhì)量評(píng)定結(jié)果
當(dāng)保存液中不含精清時(shí)，糖鹽溶液中添加乳清粉組和乳清粉+酪蛋白酸鈉組TM、PM、VAP及RAP顯著高于對(duì)照組；當(dāng)保存液中含有25％濃度精清時(shí)，糖鹽溶液中添加酪蛋白酸鈉和乳清粉+酪蛋白酸鈉組TM、PM及RAP值顯著高于對(duì)照組。
試驗(yàn)例1結(jié)果如下表所示
注釋?zhuān)和袛?shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)。
試驗(yàn)例2
下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)不同濃度酪蛋白酸鈉和乳清蛋白在馬精子低溫保存中的作用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進(jìn)行精液保存實(shí)驗(yàn)，用母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
將過(guò)濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲(chǔ)存，48h后檢測(cè)精液活力參數(shù)。
(三)精液質(zhì)量評(píng)價(jià)
用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測(cè)腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀下，進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運(yùn)動(dòng)精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質(zhì)量評(píng)定結(jié)果
低溫保存48h后檢測(cè)結(jié)果表明：SC 4+Whey 1和SC 2+Whey 1組TM值顯著高于其他四組；SC 4+Whey 1組PM值顯著高于其他五組；SC 4+Whey 1組RAP值顯著高于其他五組，SC 1+Whey 2組RAP值顯著低于SC 0.5+Whey 1和SC 2+Whey 1組。這一結(jié)果表明在糖鹽溶液中同時(shí)添加1g/mL濃度乳清粉和4g/mL濃度的酪蛋白酸鈉可以獲得最佳的保存效果。
試驗(yàn)例2結(jié)果如下表所示
注釋?zhuān)和袛?shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗(yàn)例3
下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)焦磷酸鈉在馬精子低溫保存中的作用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進(jìn)行精液保存實(shí)驗(yàn)，用母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
將過(guò)濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲(chǔ)存，48h后檢測(cè)精液活力參數(shù)。
(三)精液質(zhì)量評(píng)價(jià)
用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測(cè)腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀下，進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運(yùn)動(dòng)精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質(zhì)量評(píng)定結(jié)果
低溫保存48h后檢測(cè)結(jié)果表明：添加4、20及40mg/L濃度焦磷酸鈉組精子TM、PM、VAP及RAP均高于對(duì)照。
試驗(yàn)例3結(jié)果如下表所示
注釋?zhuān)和袛?shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗(yàn)例4
下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)四種抗氧化劑在馬精子低溫保存中的作用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進(jìn)行精液保存實(shí)驗(yàn)，用母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
將過(guò)濾后精液用與馬精液低溫保存稀釋液做1:3稀釋后置于5℃儲(chǔ)存，48h后檢測(cè)精液活力參數(shù)。
(三)精液質(zhì)量評(píng)價(jià)
用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測(cè)腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀下，進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運(yùn)動(dòng)精子比例(Rapid motility,RAP)。
(四)精子質(zhì)量評(píng)定結(jié)果
低溫保存72h后檢測(cè)結(jié)果表明：添加甘氨酸、甲硫氨酸、牛磺酸及維生素E四組精子TM、PM、VAP及RAP均高于對(duì)照。
試驗(yàn)例4結(jié)果如下表所示
注釋?zhuān)焊拾彼酖ly；甲硫氨酸Met；牛磺酸Tau；維生素E Ve；同列數(shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗(yàn)例5
下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)不同抗凍劑在馬精子低溫保存中的作用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進(jìn)行精液保存實(shí)驗(yàn)，用母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
過(guò)濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液冷凍保存液稀釋至200×106個(gè)/ml濃度，裝入0.5ml細(xì)管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷凍儀中以60℃/min速率降溫至-110℃，投入液氮中保存。
(三)精液質(zhì)量評(píng)價(jià)
用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測(cè)腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀下，進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運(yùn)動(dòng)精子比例(Rapid motility,RAP)。
精子質(zhì)膜完整性(viability)用SYBR14/PI熒光染色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(Invitrogen，L-7011)。具體方法為：精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml HEPES緩沖液(10mM HEPES,150mM NaCl,10％BSA,pH 7.4),添加5μL SYBR 14(0.02mM)，36℃孵育10min，然后再添加5μL 2.4mM濃度的PI(propidium iodide)，36℃孵育8min，孵育完成后650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS稀釋后滴片置于熒光顯微鏡(OLYMPUS,ONIX992-IX71)下觀測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)不少于500個(gè)。
用JC-1(Invitrogen,M34152)熒光染料染色檢測(cè)精子線粒體膜電勢(shì)(mitochondrion membranes potential，HMP)。精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加10μL JC-1(200μM)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片觀察，每個(gè)視野在熒光下對(duì)染色精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后轉(zhuǎn)換至可見(jiàn)光下對(duì)總精子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)不少于500個(gè)。
精子頂體缺損率(Defect Acrosome)用FITC-PNA(lectin agglutinin of arachis Hypogaea,L-7381,Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)熒光染料染色觀測(cè)。精液解凍后用PBS1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加20μL FITC-PNA(1.125mg/mL)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片用熒光顯微鏡觀察。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)不少于500個(gè)。
(四)精子質(zhì)量評(píng)定結(jié)果
比較三種不同濃度甲基甲酰胺和二甲基甲酰胺與常規(guī)抗凍劑甘油、乙二醇及二甲基亞砜對(duì)馬精子冷凍效果的影響。結(jié)果顯示3.5％的甲基甲酰和二甲基甲酰胺凍后精子質(zhì)量最好。
試驗(yàn)例5結(jié)果如下表所示
注釋?zhuān)和袛?shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗(yàn)例6
下面結(jié)合試驗(yàn)例對(duì)7種不同抗凍劑組合在馬精子低溫保存中的作用對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
6匹英純血種公馬被用于進(jìn)行精液保存實(shí)驗(yàn)，用母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
過(guò)濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液冷凍保存液稀釋至200×106個(gè)/ml濃度，裝入0.5ml細(xì)管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷凍儀中以60℃/min速率降溫至-110℃，投入液氮中保存。
(三)精液質(zhì)量評(píng)價(jià)
用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。取5μl解凍后精液滴加于Leja玻片檢測(cè)腔室中(腔室深度/高度固定為20μl)，置于配備有37℃恒溫載物臺(tái)的計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀下，進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)參數(shù)主要包括：或精子比例(total motility，TM),前向精子比例(progressive motility,PM),平均路徑速率(average path velocity,VAP)，快速運(yùn)動(dòng)精子比例(Rapid motility,RAP)。
精子質(zhì)膜完整性(viability)用SYBR14/PI熒光染色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(Invitrogen，L-7011)。具體方法為：精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml HEPES緩沖液(10mM HEPES,150mM NaCl,10％BSA,pH 7.4),添加5μL SYBR 14(0.02mM)，36℃孵育10min，然后再添加5μL 2.4mM濃度的PI(propidium iodide)，36℃孵育8min，孵育完成后650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS稀釋后滴片置于熒光顯微鏡(OLYMPUS,ONIX992-IX71)下觀測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)不少于500個(gè)。
用JC-1(Invitrogen,M34152)熒光染料染色檢測(cè)精子線粒體膜電勢(shì)(mitochondrion membranes potential，HMP)。精液解凍后用PBS 1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加10μL JC-1(200μM)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片觀察，每個(gè)視野在熒光下對(duì)染色精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后轉(zhuǎn)換至可見(jiàn)光下對(duì)總精子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)不少于500個(gè)。
精子頂體缺損率(Defect Acrosome)用FITC-PNA(lectin agglutinin of arachis Hypogaea,L-7381,Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)熒光染料染色觀測(cè)。精液解凍后用PBS1:1稀釋液后，650×g離心7min，離心完成后棄上清，添加1ml PBS洗滌1次。添加20μL FITC-PNA(1.125mg/mL)至1mL稀釋后精液樣品中，36℃孵育10min，滴片用熒光顯微鏡觀察。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組解凍3支細(xì)管，每支細(xì)管取3個(gè)觀察視野，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)精子個(gè)數(shù)不少于500個(gè)。
(四)精子質(zhì)量評(píng)定結(jié)果
7種組合抗凍劑對(duì)馬精子冷凍效果的顯示：組合1凍后精子活率顯著高于組合5、組合7、甘油組及甲基甲酰胺組(P<0.05)。組合2凍后PM值顯著高于二甲基甲酰胺和組合5(P<0.05)。
試驗(yàn)例6結(jié)果如下表所示
注釋?zhuān)和袛?shù)據(jù)上標(biāo)不同表示差異顯著(P<0.05)
試驗(yàn)例7
下面結(jié)合試驗(yàn)例低溫和冷凍保存后精液受胎率對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
(一)精液采集
母馬誘情，當(dāng)公馬勃起爬跨時(shí)，采精員手持假陰道把柄處，站立于臺(tái)馬右或左后側(cè)，將假陰道平放于母馬尻側(cè)，并迅速將陰莖導(dǎo)入假陰道。種公馬射精后，采精員順勢(shì)使陰莖從假陰道中退出，將假陰道集精杯端緩慢下傾，將采集到的精液用一次性紗布過(guò)濾后備用。本方法精子采集的過(guò)程遵循自然規(guī)律，用人工假陰道誘導(dǎo)雄性動(dòng)物射精，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成任何傷害，這也是世界范圍普遍采取的方式。
(二)精液處理
1.低溫保存
將過(guò)濾后精液分成兩份，一份用自配液稀釋3倍，另一份用進(jìn)口商品馬專(zhuān)用稀釋液稀釋3倍，置于5℃儲(chǔ)存8-12h后用于輸精實(shí)驗(yàn)。
2.精液冷凍
過(guò)濾后精液置于50ml離心管中，600×g離心力，離心10分鐘，收集下層精子，用馬精液冷凍保存液稀釋至200×106個(gè)/ml濃度，裝入0.5ml細(xì)管，4℃平衡120-240min后，置于程序冷凍儀中以60℃/min速率降溫至-110℃，投入液氮中保存，配種前37℃水浴30s解凍,評(píng)價(jià)精液活力參數(shù)。
(四)精子受胎率驗(yàn)證
1.低溫保存后精液的受胎驗(yàn)證
4匹英純血種公馬按順序輪流采精，每匹公馬每周采精2-3次。精液采集后離心濃縮處理，用本專(zhuān)利低溫保存液和對(duì)照稀釋液(馬專(zhuān)用進(jìn)口商品稀釋液)稀釋至2億/ml，5℃保存8-12h后，用于輸精驗(yàn)證受胎效果。
供試母馬共計(jì)114匹，其中71匹母馬用對(duì)照稀釋液保存后的精液輸精，另外43匹母馬用本專(zhuān)利低溫保存液稀釋保存后的精液輸精。母馬的發(fā)情鑒定和輸精時(shí)間的確定采用直腸觸摸檢查卵巢的方式實(shí)施。當(dāng)卵泡發(fā)育至3期卵泡時(shí)進(jìn)行一次輸精，間隔大約24小時(shí)再進(jìn)行卵巢檢查，未排卵則再輸精一次，直至排卵，每次輸精所用公馬精液由輸精當(dāng)天公馬的輪序決定。采用子宮角輸精法，每次輸入1個(gè)億有效精子，排卵后13天B超檢查妊娠結(jié)果。
2.凍精受胎驗(yàn)證
2匹英純血種公馬按上述所述冷凍方法，解凍后輸精進(jìn)行受胎驗(yàn)證。供試母馬30匹，采用B超探測(cè)結(jié)合激素誘導(dǎo)確定輸精時(shí)間，每天7點(diǎn)和19點(diǎn)B超檢查母馬卵泡發(fā)育情況，當(dāng)卵泡大于35×35mm時(shí)注射5000IU單位人絨毛膜促性腺激素(HCG)，于注射激素24h后，每間隔6-12h B超探測(cè)(卵泡大小)結(jié)合觸摸卵泡質(zhì)地(軟硬)綜合確定輸精時(shí)間，每次輸入6-8支0.5ml細(xì)管精液，總前進(jìn)精子數(shù)約為200～300×106個(gè)總精子。
應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
(四)受胎率評(píng)定結(jié)果
專(zhuān)利低溫保存稀釋液與進(jìn)口商品低溫保存稀釋液保存馬精子8-12h后，人工授精驗(yàn)證受胎率，結(jié)果表明本專(zhuān)利稀釋液情期受胎率為67.7％(29/43)，進(jìn)口商品稀釋液情期受胎率為57.7％(41/71)，表明本專(zhuān)利稀釋液保存效果優(yōu)于進(jìn)口商品液，彰顯了技術(shù)進(jìn)步。
用本專(zhuān)利冷凍稀釋液進(jìn)行精液冷凍，解凍后進(jìn)行受胎率驗(yàn)證，情期受胎率達(dá)到了50％(15/30)。這一受胎率略高于國(guó)際上報(bào)道的40-50％情期受胎率，彰顯了技術(shù)進(jìn)步。