本發(fā)明涉及微生物的分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種植物內(nèi)生菌的分離方法。
背景技術(shù)：
：植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌，在其生活過程中宿主植物不表現(xiàn)出外在的病癥，植物與其內(nèi)生菌屬于互惠共生的關(guān)系。植物為內(nèi)生菌提供光合產(chǎn)物和礦物質(zhì)，而內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物則能刺激植物的生長發(fā)育，提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。由于將植物內(nèi)生菌作為生防因子具有獨特的優(yōu)勢：它們分布于植物的不同組織中，受到植物組織的保護，具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境，與附生菌相比更易于發(fā)揮生防作用，因此，有關(guān)植物內(nèi)生菌的研究正成為國內(nèi)外環(huán)境、生物、化學等領(lǐng)域的焦點。植物內(nèi)生菌普遍存在于植物體的各個部位且種類繁多，而人們對這些內(nèi)生菌的棲息部位和種類多樣性仍然知之甚少。因而，為了充分開發(fā)利用植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物資源，首先必須實現(xiàn)植物內(nèi)生菌的完全、準確的分離。目前常用的分離方法均采用化學消毒劑對植物表面進行消毒處理，分離獲取植物細胞內(nèi)或細胞間的內(nèi)生菌。這些方法盡管簡便易行，減少了污染，卻也使得分離獲取的內(nèi)生菌的數(shù)量和種類非常有限。這是由于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)分布的不均勻性，導致分離的結(jié)果不能充分地代表整個植物體內(nèi)生菌的數(shù)量和種類。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的分離獲取的內(nèi)生菌的數(shù)量和種類非常有限，結(jié)果不能充分地代表整個植物體內(nèi)生菌的數(shù)量和種類的缺陷，提供一種植物內(nèi)生菌的分離方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：1）、采集健康、無病蟲害的植物材料，自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌；2)、將采集的材料表面消毒后用無菌水沖洗，晾干表面水分后備用；消毒的方法為將采集的材料置于體積濃度70～75％乙醇消毒0.5～1min，無菌水清洗，再用體積濃度0.1～0.3％升汞浸泡0.5～1min或者質(zhì)量濃度4～6％次氯酸鈉浸泡5～10min；3）、將消毒后的植物材料用無菌工具剪成小塊后，放入裝有無菌去離子水的容器中，密封容器在0-4℃環(huán)境與25～30℃環(huán)境中交替放置4～10小時，進行內(nèi)生菌浸出，進一步的，密封容器在0-4℃環(huán)境與25～30℃環(huán)境中交替放置的方法為先在0-4℃環(huán)境中放置20～30min，然后放入25～30℃環(huán)境中40～30min，循環(huán)4～10次，優(yōu)選的，密封容器在0-4℃環(huán)境與25～30℃環(huán)境中交替放置的方法為先在0℃冰浴20min，然后放入25～30℃水浴40min，循環(huán)4～8次；4）、取出植物材料，研磨或加入一定量的石英砂再研磨成勻漿；優(yōu)選的，研磨時將植物材料的表皮去除后進行碾磨；為了確保內(nèi)生菌的存活，研磨在冰浴下進行；5）、研磨后的勻漿梯度稀釋10～104倍，各取200μl稀釋液涂布后在25～30℃下平板培養(yǎng)24～48h，每樣品重復3～5次，根據(jù)菌落表型特征的不同挑取具有代表性的單菌落，進行平板劃線培養(yǎng)，將經(jīng)純培養(yǎng)的單菌落移入試管斜面保存；平板劃線培養(yǎng)時的平板基包括內(nèi)生細菌培養(yǎng)基、內(nèi)生真菌培養(yǎng)基和內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基。優(yōu)選的，內(nèi)生細菌培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基。本發(fā)明的內(nèi)生菌分離方法先通過消毒有效除去植物材料表面細菌、真菌、放線菌以及其他微生物，從而避免混入雜菌影響內(nèi)生菌分離效果；然后通過將植物材料密封容器在0-4℃環(huán)境與25～30℃環(huán)境中交替放置4～10小時，進行內(nèi)生菌浸出，充分釋放植物內(nèi)生菌從而有效避免了人為擴大或丟失植物內(nèi)生菌的分離獲得，為研究植物內(nèi)生菌的種群組成特征，豐富內(nèi)生菌資源具有十分重要的作用。具體實施方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：1）、采集健康、無病蟲害的植物材料，自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌；2)、將采集的材料表面消毒后用無菌水沖洗，晾干表面水分后備用；消毒的方法為將采集的材料置于體積濃度70％乙醇消毒1min，無菌水清洗，再用體積濃度0.1％升汞浸泡1min或者質(zhì)量濃度6％次氯酸鈉浸泡5min；3）、將消毒后的植物材料用無菌工具剪成小塊后，放入裝有無菌去離子水的容器中，密封容器在4℃環(huán)境與30℃環(huán)境中交替放置4～10小時；4）、取出植物材料，去除表皮后用無菌工具剪成小塊后，研磨或加入一定量的石英砂冰浴下研磨成勻漿5）、研磨后的勻漿梯度稀釋10～104倍，各取200μl稀釋液涂布后在25～30℃下平板培養(yǎng)24～48h，每樣品重復3～5次，根據(jù)菌落表型特征的不同挑取具有代表性的單菌落，進行平板劃線培養(yǎng)，將經(jīng)純培養(yǎng)的單菌落移入試管斜面保存；平板劃線培養(yǎng)時的平板基包括內(nèi)生細菌培養(yǎng)基、內(nèi)生真菌培養(yǎng)基和內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基。實施例2一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：1）、采集健康、無病蟲害的植物材料，自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌；2)、將采集的材料表面消毒后用無菌水沖洗，晾干表面水分后備用；消毒的方法為將采集的材料置于體積濃度75％乙醇消毒0.5min，無菌水清洗，再用體積濃度0.3％升汞浸泡0.5min或者質(zhì)量濃度4％次氯酸鈉浸泡10min；3）、將消毒后的植物材料用無菌工具剪成小塊后，放入裝有無菌去離子水的容器中，密封容器先在0℃冰浴20min，然后放入25～30℃水浴40min，循環(huán)4～8次；4）、取出植物材料去除表皮后用無菌工具剪成小塊后，研磨或加入一定量的石英砂冰浴下研磨成勻漿；5）、研磨后的勻漿梯度稀釋10～104倍，各取200μl稀釋液涂布后在25～30℃下平板培養(yǎng)24～48h，每樣品重復3～5次，根據(jù)菌落表型特征的不同挑取具有代表性的單菌落，進行平板劃線培養(yǎng)，將經(jīng)純培養(yǎng)的單菌落移入試管斜面保存；內(nèi)生細菌培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基。實施例3一種植物內(nèi)生菌的分離方法，包括以下步驟：1）、采集健康、無病蟲害的植物材料，自來水沖洗干凈后再用無菌水洗滌；2)、將采集的材料表面消毒后用無菌水沖洗，晾干表面水分后備用；消毒的方法為將采集的材料置于體積濃度72％乙醇消毒1min，無菌水清洗，再用體積濃度0.2％升汞浸泡0.5min或者質(zhì)量濃度5％次氯酸鈉浸泡6min；3）、將消毒后的植物材料用無菌工具剪成小塊后，放入裝有無菌去離子水的容器中，密封容器在2℃環(huán)境中放置25min，然后放入28℃環(huán)境中35min，循環(huán)6次；4）、取出植物材料去除表皮后用無菌工具剪成小塊后，研磨或加入一定量的石英砂冰浴下研磨成勻漿；5）、研磨后的勻漿梯度稀釋10～104倍，各取200μl稀釋液涂布后在25～30℃下平板培養(yǎng)24～48h，每樣品重復3～5次，根據(jù)菌落表型特征的不同挑取具有代表性的單菌落，進行平板劃線培養(yǎng)，將經(jīng)純培養(yǎng)的單菌落移入試管斜面保存；內(nèi)生細菌培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，內(nèi)生真菌培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，內(nèi)生放線菌培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基。采用本鋒芒實施例3的分離方法分離橡膠樹幼嫩枝條內(nèi)生菌與常規(guī)分離方法進行對比，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕度等特征判斷分離出的菌落種類并計數(shù)，結(jié)果如表1所示：方法內(nèi)生細菌種類數(shù)內(nèi)生真菌種類數(shù)內(nèi)生放線菌種類數(shù)內(nèi)生菌總數(shù)本發(fā)明的分離方法1712534常規(guī)分離方法2621855由表1可知，本發(fā)明先通過消毒有效除去植物材料表面細菌、真菌、放線菌以及其他微生物，從而避免混入雜菌影響內(nèi)生菌分離效果；然后通過將植物材料密封容器在0-4℃環(huán)境與25～30℃環(huán)境中交替放置4～10小時，進行內(nèi)生菌浸出，充分釋放植物內(nèi)生菌，分離的內(nèi)生菌總數(shù)比常規(guī)分離方法多61.76％，能夠最大限度地避免了人為擴大或丟失植物內(nèi)生菌的分離獲得。最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12