銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法及促種子萌發(fā)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，包括如下步驟：一次剪切，表面消毒，二次剪切，內(nèi)生細菌的分離及培養(yǎng)。其次，提供一種利用上述分離出的內(nèi)生細菌促種子萌發(fā)方法，包括種子預(yù)處理，菌懸液制備，利用菌懸液浸種，播種進行萌發(fā)培養(yǎng)，并獲得AG18內(nèi)生細菌，其具有促種子萌發(fā)的作用。本發(fā)明中的分離方法，降低了引入外源微生物的風(fēng)險，增加內(nèi)生細菌的數(shù)量以及種類；促種子萌發(fā)方法實現(xiàn)了生物法促種子萌發(fā)，并獲得促種子萌發(fā)的內(nèi)生細菌AG18，實現(xiàn)了可持續(xù)性的促種子萌發(fā)。
【專利說明】
銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法及促種子萌發(fā)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)微生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法及促種子 萌發(fā)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生細菌與宿主在長期共同進化中形成和諧共生關(guān)系。共生微生物的存在為 植物適應(yīng)環(huán)境，增強抗性等方面發(fā)揮重要作用。銀砂槐為荒漠干旱環(huán)境中的一種優(yōu)良固沙 植物，由于其在自然界幼苗補充量不足，種群更新能力差，已被列為國家二級保護植物，其 內(nèi)生菌與植物互作的研究正成為生物、工程技術(shù)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的熱點。
[0003] 現(xiàn)有植物內(nèi)生菌分離方法分為四個步驟，第一步將植物清洗后剪成l-2cm小段，第 二步利用升隸對組織片段進行表面消毒，第=步將組織片段放入生理鹽水中進行人工研磨 或組織搗碎機破碎，第四步取勻漿后的上清液或稀釋液涂布于培養(yǎng)基進行37°C培養(yǎng)?，F(xiàn)有 銀砂槐促種子萌發(fā)的方法主要通過硫酸浸種：98%硫酸浸泡120min，再蒸饋水洗凈浸種 12h。發(fā)芽床采用濾紙法進行萌發(fā)實驗。
[0004] 上述分離方法存在W下缺點：消毒溶液容易進入內(nèi)部造成大量的內(nèi)生細菌死亡， 減少了內(nèi)生細菌的數(shù)量和種類，升隸容易對內(nèi)部組織微生物造成傷害，其泄露對環(huán)境造成 污染。此外，組織搗碎機破碎存在引入外源微生物的風(fēng)險，使最終分離出的內(nèi)生細菌的數(shù)量 和種類偏少W及各種屬細菌不純，進而利用上述方法制備出的內(nèi)生細菌在促種子萌發(fā)方法 中，種子萌發(fā)率不高。此外，目前打破種子休眠促進種子萌發(fā)的方法主要分為物理方法和化 學(xué)方法，物理方法如機械處理、層積處理，化學(xué)方法如激素處理，強酸處理等，不同的種子需 采用不同的方法，對于綜合休眠的種子則必須采用復(fù)合方法來處理。由于銀砂槐種子的種 皮不透水而存在物理休眠，但種皮破口后仍不能萌發(fā)，說明還存在其他類型的休眠，需要采 用復(fù)合方法破除休眠提高萌發(fā)，但是利用目前的復(fù)合方法進行處理，容易對環(huán)境造成污染， 并且容易傷害到種子，不具有持續(xù)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供一種獲得銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，能夠獲得更 多數(shù)量W及更多種類的內(nèi)生細菌，并利用該內(nèi)生細菌實現(xiàn)生物法促種子萌發(fā)，進而獲得促 種子萌發(fā)的內(nèi)生細菌。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，包括如 下步驟：
[0007] 步驟1、一次剪切:將銀砂槐根部組織清洗后，切成4-6cm片段；
[000引步驟2、表面消毒:依次用酒精與次氯酸鋼對所述4-6cm片段進行表面消毒處理；
[0009]步驟3、二次剪切：將消毒處理的所述4-6cm片段在無菌條件下剪切成0.5-lcm片 段；
[0010]步驟4、內(nèi)生細菌的分離及培養(yǎng):將所述0.5-lcm片段直接插入培養(yǎng)基平板中進行 培養(yǎng)，挑取不同形態(tài)菌落，進行劃線培養(yǎng)直至得到各菌落的純培養(yǎng)物，進行保存。
[0011]其中，步驟2具體為:先用75%酒精消毒3min，無菌水沖洗至少1次，再用2%次氯酸 鋼消毒3min，無菌水沖洗6次，取10化1最后一次的沖洗水檢測消毒效果。
[001 ^ 其中，步驟4中，所述培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基，且其抑值為7.0。
[OOK]其中，步驟4中，所述0.5-lcm片段在所述培養(yǎng)基中與28~30°C培養(yǎng)7天后，再進行 劃線培養(yǎng)，保存在20 %的甘油中，保存于-80°C。
[0014] 其次，提供一種促種子萌發(fā)方法，將上述的方法制備的內(nèi)生細菌用于該植物促種 子萌發(fā)方法中，包括如下步驟：
[0015] 步驟a、種子預(yù)處理:采用次氯酸鋼溶液對所述種子進行消毒，之后進行切片破種；
[0016] 步驟b、菌懸液制備:將所述內(nèi)生細菌接種于牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，并置于 搖床中過夜培養(yǎng)，之后進行離屯、，取所述內(nèi)生細菌的沉淀重懸于PBS緩沖液中，得到所述菌 懸液；
[0017] 步驟C、浸種:將消毒的所述種子浸入所述菌懸液中，浸種4h;
[0018] 步驟d、播種:將浸種后的所述種子進行萌發(fā)培養(yǎng)，并定期統(tǒng)計發(fā)芽率及胚根長度。
[0019] 其中，步驟a具體為:先用75%的酒精消毒12min，無菌水沖洗至少1次，再用5%的 次氯酸鋼溶液消毒15min，無菌水沖洗6次。
[0020] 其中，步驟b中所述搖床的震蕩頻率為15化pm。
[0021] 其中，步驟b中，將0D600調(diào)整為1.0,離屯、速率為SOOOrmp，離屯、時間為lOmin。
[0022] 其中，步驟d中的所述種子萌發(fā)培養(yǎng)采用培養(yǎng)皿濾紙法。
[0023] 再次，提供一種根據(jù)上述促種子萌發(fā)方法得到的AG18內(nèi)生細菌，所述AG18內(nèi)生細 菌具有促種子萌發(fā)的作用。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明中的分離方法中，不需要對植物 組織進行人工研磨或機械破碎，極大降低了引入外源微生物的風(fēng)險，通過嚴格控制培養(yǎng)條 件，如pH值W及培養(yǎng)溫度的設(shè)置，有利于內(nèi)生細菌中劣勢菌群的生長，能夠增加內(nèi)生細菌的 數(shù)量W及種類。并且利用分離出的內(nèi)生細菌對種子進行促萌發(fā)，實現(xiàn)了生物法促種子萌發(fā)， 并獲得促種子萌發(fā)的內(nèi)生細菌AG18,避免了采用復(fù)合方法促進種子萌發(fā)而造成的環(huán)境污 染，而且大大降低對種子的傷害，并由于AG18內(nèi)生細菌與寄主形成互惠關(guān)系，實現(xiàn)了可持續(xù) 性的促種子萌發(fā)。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明中分離出的內(nèi)生細菌促種子萌發(fā)的種子萌發(fā)率柱形圖；
[0026] 圖2為本發(fā)明中分離出的內(nèi)生細菌促種子萌發(fā)中種子根長的柱形圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面通過具體的實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[002引銀砂槐(Ammoden化on bifolium(Pall.)化kovl.)為豆科銀砂槐屬沙生落葉植物。 該屬植物全世界共有8種，中國只有1種，即銀砂槐，僅分布于中國新疆霍城縣塔克爾莫乎爾 沙漠，是優(yōu)良防風(fēng)固沙植物，本發(fā)明中的銀砂槐也來源于此。
[0029]本發(fā)明中的銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法包括如下步驟：
[0030] 步驟1、一次剪切:將銀砂槐根部組織清洗后，切成4-6cm片段。該片段較大，能夠避 免后續(xù)的表面消毒對其內(nèi)生細菌的破壞，保留組織內(nèi)完整的菌群數(shù)量和種類。
[0031] 步驟2、表面消毒:依次用酒精與次氯酸鋼對所述4-6cm片段進行表面消毒處理。具 體為先用體積分數(shù)為75%酒精消毒3min，無菌水沖洗至少1次，再用體積分數(shù)為2%次氯酸 鋼消毒3min，無菌水沖洗6次，在最后一次的沖洗水中，取其10化1檢測消毒效果。
[0032] 步驟3、二次剪切：將消毒處理的所述4-6cm片段在無菌條件下剪切成0.5-lcm片 段。在無菌條件下，對其進行二次剪切，不需采用人工研磨或機器破碎，避免了引入外源微 生物和污染，簡化步驟，提高了菌株的成活率W及純度。
[0033] 步驟4、內(nèi)生細菌的分離及培養(yǎng):將所述0.5-lcm片段直接插入培養(yǎng)基平板中進行 培養(yǎng)，挑取不同形態(tài)菌落，進行劃線培養(yǎng)直至得到各菌落的純培養(yǎng)物，進行保存。
[0034] 步驟4中的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基，將其pH值調(diào)控在7.0,在該培養(yǎng)基中28 ~3(TC培養(yǎng)7天，之后再進行劃線培養(yǎng)，此處將培養(yǎng)基的抑值控制在7.0W及溫度控制在30 °C能夠有益于內(nèi)生細菌中的劣勢菌群生長，進一步提高內(nèi)生細菌的種類及數(shù)量。得到純培 養(yǎng)物后，將其置于體積分數(shù)為20%甘油中，保存于-80°C中備用。
[0035] 利用上述分離方法，從銀砂槐根部分離出69株內(nèi)生菌，經(jīng)16S rRNA鑒定，歸屬于11 個屬。
[0036] 本發(fā)明中的分離方法與現(xiàn)有技術(shù)中的一般分離方法獲得的菌落情況如表一所示：
[0037] 表一 [00；3 引
[0
[0040]從表一可W明顯看出，采用本發(fā)明中的分離方法與現(xiàn)有技術(shù)中一般的分離方法相 比看，其菌落數(shù)量大大增加，而且內(nèi)生菌的種類也增加很多，保留了大部分的內(nèi)生細菌。
[0041] 本發(fā)明中的分離方法中，不需要對植物組織進行人工研磨或機械破碎，極大降低 了引入外源微生物的風(fēng)險，通過嚴格控制培養(yǎng)條件，如pH值W及培養(yǎng)溫度的設(shè)置，有利于內(nèi) 生細菌中劣勢菌群的生長，能夠增加內(nèi)生細菌的數(shù)量W及種類。
[0042] 由于內(nèi)生細菌與寄主植物互相作用，本發(fā)明提供了一種利用上述分離方法獲得的 內(nèi)生細菌促種子萌發(fā)的方法，包括如下步驟：
[0043] 步驟a、種子預(yù)處理:采用次氯酸鋼溶液對所述種子進行消毒，之后進行切片破種。
[0044] 具體為先用體積分數(shù)為75%的酒精消毒12min，無菌水沖洗至少1次，再用體積分 數(shù)為5%的次氯酸鋼溶液消毒15min，無菌水沖洗6次。
[0045] 步驟b、菌懸液制備:將所述內(nèi)生細菌接種于牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，并置于 搖床中過夜培養(yǎng)，之后進行離屯、，取所述內(nèi)生細菌的沉淀重懸于PBS緩沖液中，得到所述菌 懸液。
[0046] 上述步驟中，搖床的震蕩頻率設(shè)定為150rmp，并且將0D600調(diào)整為1.0,在SOOOrmp 轉(zhuǎn)速下離屯、1 Omin，PBS緩沖液(憐酸緩沖鹽溶液)的濃度為1 OmM，pH值為7.0。
[0047] 其中，0D600,是利用分光光度計測定600nm波長處的吸光值。當菌液0D值為1.0時， 細菌生長較好，細胞密度較合理，將其0D值調(diào)整為1.0,另一個優(yōu)點是統(tǒng)一標準，便于不同菌 株處理間的比較。
[004引步驟C、浸種:將消毒的所述種子浸入所述菌懸液中，浸種4h;
[0049] 步驟d、播種:將浸種后的所述種子進行萌發(fā)培養(yǎng)，并定期(如每隔5天)統(tǒng)計發(fā)芽率 及胚根長度。萌發(fā)培養(yǎng)采用培養(yǎng)皿濾紙法，該方法為國際種子檢驗協(xié)會（ISTA)規(guī)定用于種 子萌發(fā)實驗的標準程序，即在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪入濾紙，用水浸濕后，將處理后的種子置于濾紙上 進行培養(yǎng)。
[0050] 利用本發(fā)明中的分離方法能夠分離出69株內(nèi)生細菌，W下29株(GeneBank序列登 錄號：KR045813-KR045835，KR045852-KR045857)為代表菌株，其中5株屬芽抱桿菌屬 (Bacillus)，8株屬泛菌屬（Pantoea)，4株屬歐文氏菌屬化rwinia)，2株屬不動桿菌屬 (Acinetobacter)，2株屬假單胞菌屬（Pseudomonas)，2株屬芽抱八疊球菌屬 (Sporosarcina)，2株屬克雷伯氏菌屬化lebsiella)，1株屬節(jié)桿菌屬（Arthrobacter)，1株 屬考克氏菌屬化ocuria)，1株屬纖維單胞菌屬（Cellulomonas)，1株屬類芽抱桿菌屬 (Paenibacillus)。其對應(yīng)的編號W及登錄號如表二。
[0化1 ] 表二
[00591
[0
[0054]利用上述29株細菌進行上述促種子萌發(fā)實驗，于實驗結(jié)束時(萌發(fā)15天后)所測萌 發(fā)率及胚根長度如表S。表S中設(shè)置PBS緩沖溶液為空白對照，即在步驟C中，該空白對照組 中的消毒的種子浸入到PBS緩沖液中。數(shù)值為平均值±56(56為標準誤差），"*"表示菌株處 理與對照相比差異顯著(P<〇. 05)。
[0化5] 表S
[0化6]
[0化7]
[005引通過表S可W獲得AG18內(nèi)生細菌具有促銀砂槐種子萌發(fā)的作用。根據(jù)leSrDNA鑒 定的結(jié)果W及在GeneBank中的序列相似性比對，該AG18內(nèi)生細菌與巨大芽抱桿菌菌株 (Bacillus megaterium strain G1-7)具有100%的相似性，其屬于芽抱桿菌屬的一種。
[0059] 如圖1和圖2所示，其分別為本發(fā)明中分離出的內(nèi)生細菌促種子萌發(fā)的種子萌發(fā)率 柱形圖W及分離出的內(nèi)生細菌促種子萌發(fā)中種子根長的柱狀圖，從圖中可W看出，AG18的 促種子萌發(fā)作用最為明顯。圖中的表示菌株處理與對照組相比差異顯著，P<〇.05。
[0060] P值為概率，P<〇.05為顯著，P<0.01為極顯著，即指樣本間的差異由抽樣誤差所致 的概率小于0.05或0.01。
[0061] 由于內(nèi)生菌細胞懸浮于PBS中，對種子進行促萌發(fā)作用，所W將PBS處理的種子作 為對照組。
[0062] 從圖中可W看出，通過本發(fā)明的分離方法獲得的AG18內(nèi)生細菌對促進種子萌發(fā)與 根的生長具有明顯的優(yōu)勢。
[0063] 銀砂槐種子自身萌發(fā)率極低，通過本發(fā)明中的分離方法獲得的豐富多樣的內(nèi)生 菌，降低微生物資源丟失的風(fēng)險，采用機械處理(破口）種子，并通過植物與微生物互作的方 式提供了內(nèi)生菌促進植物種子萌芽的方法，并且獲得內(nèi)生菌AG18對銀砂槐種子具有促萌發(fā) 的作用。目前未有文獻報導(dǎo)該內(nèi)生菌菌株對植物的促生作用，運也是首次從銀砂槐中獲得 促生困株。
[0064] W上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，本發(fā)明可W有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、 等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟1、一次剪切:將銀砂槐根部組織清洗后，切成4-6cm片段； 步驟2、表面消毒:依次用酒精與次氯酸鈉對所述4-6cm片段進行表面消毒處理； 步驟3、二次剪切:將消毒處理的所述4-6cm片段在無菌條件下剪切成0.5-lcm片段； 步驟4、內(nèi)生細菌的分離及培養(yǎng):將所述0.5-lcm片段直接插入培養(yǎng)基平板中進行培養(yǎng)， 挑取不同形態(tài)菌落，進行劃線培養(yǎng)直至得到各菌落的純培養(yǎng)物，進行保存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，其特征在于， 步驟2具體為：先用75%酒精消毒3min，無菌水沖洗至少1次，再用2%次氯酸鈉消毒 3min，無菌水沖洗6次，取1 ΟΟμΙ最后一次的沖洗水檢測消毒效果。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，其特征在于，步驟4中，所述 培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，且其pH值為7.0。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的銀砂槐根部內(nèi)生細菌的分離方法，其特征在于，步驟4中，所述 0.5-lcm片段在所述培養(yǎng)基中與28~30°C培養(yǎng)7天后，再進行劃線培養(yǎng)，保存在20%的甘油 中，保存于-80 °C。5. -種促種子萌發(fā)方法，其特征在于，將權(quán)利要求1至4中任一所述的方法制備的內(nèi)生 細菌用于該植物促種子萌發(fā)方法中，包括如下步驟： 步驟a、種子預(yù)處理:采用次氯酸鈉溶液對所述種子進行消毒，之后進行切片破種； 步驟b、菌懸液制備:將所述內(nèi)生細菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，并置于搖床 中過夜培養(yǎng)，之后進行離心，取所述內(nèi)生細菌的沉淀重懸于PBS緩沖液中，得到所述菌懸液； 步驟c、浸種:將消毒的所述種子浸入所述菌懸液中，浸種4h; 步驟d、播種:將浸種后的所述種子進行萌發(fā)培養(yǎng)，并定期統(tǒng)計發(fā)芽率及胚根長度。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促種子萌發(fā)方法，其特征在于，步驟a具體為:先用75 %的酒精 消毒12min，無菌水沖洗至少1次，再用5 %的次氯酸鈉溶液消毒15min，無菌水沖洗6次。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促種子萌發(fā)方法，其特征在于，步驟b中所述搖床的震蕩頻率 為150rpm〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促種子萌發(fā)方法，其特征在于，步驟b中，將0D600調(diào)整為1.0， 離心速率為8000rmp，離心時間為lOmin。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促種子萌發(fā)方法，其特征在于，步驟d中的所述種子萌發(fā)培養(yǎng) 采用培養(yǎng)皿濾紙法。10. -種根據(jù)權(quán)利要求5至9任一所述的促種子萌發(fā)方法獲得的AG18內(nèi)生細菌，其特征 在于，所述AG18內(nèi)生細菌具有促種子萌發(fā)的作用。
【文檔編號】C12R1/07GK106047757SQ201610504635
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】朱艷蕾, 佘小平
【申請人】陜西師范大學(xué)