本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及生物標(biāo)記物ensg00000267416在癌癥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌，致死率偽劣全球高致死性腫瘤的第三位，被稱為“癌中之王”，可分為肝細(xì)胞型、膽管細(xì)胞型和混合型三種類型。其中，肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位列癌癥相關(guān)腫瘤死亡率第三位。hcc具有起病隱匿、惡性程度高、進(jìn)展迅速、易轉(zhuǎn)移、病死率高、總體預(yù)后不佳等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康。

導(dǎo)致肝細(xì)胞性肝癌的主要病因?yàn)槁曰顒?dòng)性肝病，包括乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)和丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus，hcv)導(dǎo)致的病毒性肝炎，酒精性肝炎及非酒精性脂肪肝。目前國(guó)內(nèi)常見的肝細(xì)胞肝癌以hbv感染為主要途徑。全球每年新發(fā)肝癌病例數(shù)的100萬人以上，而我國(guó)占其中一半。迄今為止全球每年因肝癌死亡的病人數(shù)達(dá)42.67萬，而僅我國(guó)就占53％，肝癌已成為我國(guó)人口患惡性腫瘤疾病致死的重要因素之一。盡管隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，許多的肝癌病人能得到妥善和規(guī)范的治療，并且已取得較好療效，但肝癌的早期發(fā)現(xiàn)較難、肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率較高一直嚴(yán)重影響著肝癌病人的治療效果與生存期。相對(duì)于其他實(shí)體腫瘤而言，原發(fā)性肝癌在確診時(shí)，90％以上患者已經(jīng)到中、晚期，而對(duì)中、晚期肝癌病人能夠手術(shù)治療者僅占肝癌病人的5％-10％。肝癌根治性切除后病人的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60％～70％，小肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率亦為30％～40％。因此，在加強(qiáng)肝癌早期診斷研究的同時(shí)，闡述引起肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制，建立早期肝癌或轉(zhuǎn)移性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而探索新的干預(yù)措施，防止肝癌的進(jìn)一步復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，提高肝癌術(shù)前術(shù)后的治療效果，增加患者的存活率和生活質(zhì)量對(duì)疾病的治療和預(yù)防具有重大的意義。

隨著高通量芯片及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)非編碼rna在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。非編碼rna是指不編碼蛋白質(zhì)的rna，其中包括rrna，trna，snrna，snorna，microrna及長(zhǎng)鏈非編碼rna(longnon-codingrna，lncrna)等，其中mirna及l(fā)ncrna是近期研究的熱點(diǎn)。它們?cè)谀[瘤的發(fā)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用。lncrna目前被越來越多的報(bào)道參與肝癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。lncrna是一類長(zhǎng)度大于200堿基的rna分子，由于缺少有效的開放式閱讀框而不編碼蛋白，但具備復(fù)雜的生物學(xué)功能并在各種生物過程中發(fā)揮著重要的作用，如染色質(zhì)修飾、x染色體的失活、參與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及到蛋白活動(dòng)調(diào)控等，其變異和調(diào)節(jié)能夠?qū)е掳[瘤在內(nèi)的多重疾病。近年來研究表明異常表達(dá)的1ncrna通過多重途徑參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡，增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移等調(diào)控，與肝癌等腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系。研究lncrna與腫瘤的關(guān)系，對(duì)于了解肝癌的發(fā)病機(jī)制、實(shí)現(xiàn)肝癌臨床上的早期診斷以及靶向治療具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種診斷產(chǎn)品，為實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的之二，提供一種分子標(biāo)記物，作為檢測(cè)或治療指標(biāo)應(yīng)用于臨床以及應(yīng)用于肝癌發(fā)病機(jī)制的研究。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和藥物組合物，實(shí)現(xiàn)肝癌的精準(zhǔn)分子治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測(cè)ensg00000267416的試劑在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述產(chǎn)品通過檢測(cè)樣本中ensg00000267416基因的表達(dá)水平來判斷患者是否患有肝癌。其中，ensg00000267416基因在肝癌患者中表達(dá)上調(diào)。

進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括：通過rt-pcr、實(shí)時(shí)定量pcr、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)樣本中ensg00000267416基因的表達(dá)水平以診斷肝癌。其中，所述用rt-pcr診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增ensg00000267416基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增ensg00000267416基因的引物；所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括：與ensg00000267416基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與ensg00000267416基因的核酸序列雜交的探針。

所述“樣本”包括細(xì)胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述樣本為組織。

進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量pcr診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異性擴(kuò)增ensg00000267416基因的引物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中所述引物如seqidno.2和seqidno.3所示。

本發(fā)明提供了一種診斷早期肝癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括檢測(cè)ensg00000267416表達(dá)水平的試劑。所述產(chǎn)品包括芯片、核酸膜條或試劑盒；

進(jìn)一步，所述試劑包括特異性識(shí)別ensg00000267416的探針，或特異性擴(kuò)增ensg00000267416的引物。

本發(fā)明中基因檢測(cè)試劑盒或基因芯片可用于檢測(cè)包括ensg00000267416基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如，與肝癌相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平，將肝癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高肝癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了一種ensg00000267416基因的用途，用于篩選預(yù)防或治療肝癌潛在物質(zhì)。

進(jìn)一步，用于篩選預(yù)防或治療肝癌潛在物質(zhì)的步驟包括：

用候選物質(zhì)處理表達(dá)或含有ensg00000267416基因的體系；和

檢測(cè)所述體系中ensg00000267416基因的表達(dá)；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低ensg00000267416基因的表達(dá)水平(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療肝癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自：細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系。

所述候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對(duì)ensg00000267416基因或其上游或下游基因設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了一種ensg00000267416基因的用途，用于制備治療肝癌的藥物組合物。

進(jìn)一步，所述藥物組合物包括ensg00000267416基因的抑制劑。

本發(fā)明提供了一種治療肝癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括ensg00000267416基因的抑制劑。所述抑制劑選自：以ensg00000267416或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制ensg00000267416基因表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shrna(小發(fā)夾rna)、小干擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達(dá)或形成所述shrna、小干擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構(gòu)建物。優(yōu)選的，所述的抑制劑為sirna。

在篩選有效的sirna序列時(shí)，本發(fā)明人通過大量的比對(duì)分析，從而找出最佳的有效片段。通過設(shè)計(jì)合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，選出干擾效果最佳的sirna，進(jìn)一步地在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對(duì)于該sirna在能有效的抑制細(xì)胞中ensg00000267416基因的表達(dá)水平，以及肝癌細(xì)胞的增殖。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括與所述抑制劑相配伍的其他藥類以及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。其中，藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料包括(但不限于)如緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽等。作為緩沖劑，能夠使用磷酸鹽、甘氨酸，山梨酸，山梨酸鐘，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)例如硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽，膠態(tài)二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂等。作為乳化劑，能夠使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、西黃芪膠等。作為懸浮劑，能夠使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，能夠使用丙二醇、二亞乙基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為防腐劑，能夠使用疊氮化鈉、苯扎氯銨、對(duì)羥苯甲酸、氯丁醇等。

本發(fā)明的藥物組合物還可以包括離子交換劑如礬土，硬脂酸鋁，卵磷脂，半乳化藥物遞送系統(tǒng)(sedds)例如dα一生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽，在藥物劑型中使用的表面活性劑例如吐溫或其它類似聚合遞送基質(zhì)，血清蛋白例如人血清白蛋白，也可以使用環(huán)糊精例如α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、和γ-環(huán)糊精，或化學(xué)修飾的衍生物例如是羥基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-羥基丙基-β-環(huán)糊精、或其它增溶衍生物來促進(jìn)本發(fā)明化合物的遞送。本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑，如含水乳糖或無水乳糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、硅酸、微晶纖維素、羥甲基纖維素鈉、淀粉甘醇酸鈉及其衍生物等。

本發(fā)明的藥物組合物還包含界面活性劑、乳化劑、擴(kuò)散劑、消泡劑、涂層材料等。任何藥學(xué)上或醫(yī)學(xué)上可接受的界面活性劑、乳化劑、擴(kuò)散劑、消泡劑等皆可被使用。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的ph以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語(yǔ)非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達(dá)到目標(biāo)組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對(duì)于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米淀粉。當(dāng)口服施用水懸浮液和/或乳液時(shí)，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當(dāng)時(shí)，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長(zhǎng)或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于下調(diào)內(nèi)源性的ensg00000267416的過表達(dá)，通過降低ensg00000267416基因的表達(dá)，從而治療因ensg00000267416表達(dá)上調(diào)引起的肝癌。

本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含一種或多種抗癌劑。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種抑制ensg00000267416基因表達(dá)的化合物和至少一種化療劑。用于本發(fā)明的化療劑，包括但不限于：微管激活劑、烷化劑、抗贅生抗代謝物、鉑類化合物、dna-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，hmg-coa抑制劑，cdk抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋dna，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療肝癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時(shí)給藥，而其它劑量可以單獨(dú)給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)記物”是其在組織或細(xì)胞中的表達(dá)水平與正?；蚪】导?xì)胞或組織的表達(dá)水平相比發(fā)生改變的任何基因。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的實(shí)用性并不局限于對(duì)本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達(dá)進(jìn)行定量。作為非限制性的實(shí)例，標(biāo)志物基因可具有seqidno.1指定的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cdna序列諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cdna序列。

本發(fā)明可以利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)定基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，測(cè)定基因表達(dá)的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“芯片”包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對(duì)應(yīng)于ensg00000267416所示的部分或全部序列。術(shù)語(yǔ)“核酸膜條”包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探針，所述基底可以是任何適于固定寡核苷酸探針的基底，例如尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片、微縮磁珠等。

具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的lncrna，設(shè)計(jì)出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個(gè)可尋址位置均含有一個(gè)與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個(gè)亞陣。

所述固相載體包括塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通過非共價(jià)或物理吸附機(jī)制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的小試管、小珠和微量反應(yīng)板；所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團(tuán)，易與抗體(抗原)形成化學(xué)偶聯(lián)，結(jié)合容量大；所述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。

術(shù)語(yǔ)“試劑盒”可用于檢測(cè)ensg00000267416的表達(dá)水平，包括(但不限于)可檢測(cè)ensg00000267416表達(dá)水平的芯片、核酸膜條以及pcr引物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述引物具有seqidno.2～3所示的序列。所述試劑盒中還可包括樣本核酸的提取試劑、pcr反應(yīng)試劑、對(duì)照液等。此外，所述試劑盒還包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。

術(shù)語(yǔ)“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語(yǔ)“探針”通常指能通過互補(bǔ)堿基配對(duì)與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補(bǔ)性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法。

所述探針具有與靶點(diǎn)基因的特定的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這里，所謂“互補(bǔ)”，只要是雜交即可，可以不是完全互補(bǔ)。這些多核苷酸通常相對(duì)于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是dna，也可以是rna，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注冊(cè)商標(biāo)，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交聯(lián)化核酸)、ena(注冊(cè)商標(biāo)，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

在本發(fā)明中，針對(duì)ensg00000267416基因的寡核苷酸探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。在本發(fā)明中，是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。表達(dá)載體向宿主細(xì)胞中的導(dǎo)入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、deae葡聚糖法、顯微注射、病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜透過性肽的結(jié)合等周知的方法。

本發(fā)明的藥物組合物可以按藥劑學(xué)上有效的量進(jìn)行給藥，本發(fā)明的用語(yǔ)“藥劑學(xué)上有效的量”指的是以可適用于醫(yī)學(xué)治療或預(yù)防的合理的受惠/危險(xiǎn)比率足以治療或預(yù)防疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴(yán)重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對(duì)藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時(shí)間、給藥途徑及排出比率、治療時(shí)間、與所使用的本發(fā)明的組合物配合或同時(shí)使用的藥物的要素及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的要素來決定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨(dú)的治療劑進(jìn)行給藥，或是與其它治療劑并用地進(jìn)行給藥，可以與以往的治療劑依次地或同時(shí)地進(jìn)行給藥。此外，可單次或多次地進(jìn)行給藥。重要的是，需要對(duì)上述要素均加以考慮，并且以無副作用的最少的量可取得最大效果的量進(jìn)行給藥。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，實(shí)驗(yàn)都是按照至少重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了ensg00000267416在肝癌患者組織中差異表達(dá)，通過檢測(cè)ensg00000267416的表達(dá)水平可以判斷患者是否患有肝癌或者患病風(fēng)險(xiǎn)的高低。

本發(fā)明提供了一種肝癌的精準(zhǔn)醫(yī)療手段，通過下調(diào)患者中ensg00000267416的表達(dá)水平，從而治療因ensg00000267416表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的肝癌。

本發(fā)明提供了一種肝癌的分子標(biāo)記物，為肝癌的機(jī)理研究以及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測(cè)ensg00000267416在肝癌患者中的表達(dá)情況圖；

圖2是利用tcga數(shù)據(jù)庫(kù)交叉驗(yàn)證ensg00000267416在肝癌患者中的差異表達(dá)圖；

圖3是ensg00000267416在肝癌患者中的roc曲線圖；

圖4是利用qpcr檢測(cè)ensg00000267416在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況圖；

圖5是檢測(cè)轉(zhuǎn)染sirna對(duì)肝癌細(xì)胞中ensg00000267416的表達(dá)影響圖；

圖6是利用cck8檢測(cè)ensg00000267416對(duì)細(xì)胞增殖的影響圖；

圖7是檢測(cè)ensg00000267416對(duì)細(xì)胞的克隆形成集落的影響圖；

圖8是檢測(cè)ensg00000267416對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響圖；

圖9是transwell小室檢測(cè)ensg00000267416基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移和侵襲的影響圖；

其中，圖a是ensg00000267416基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移的影響圖，圖b是ensg00000267416基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移的影響圖。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與肝癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集10例肝癌患者的癌組織以及癌旁組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會(huì)的同意。

2、rna樣品的制備

利用qiagen的組織rna提取試劑盒進(jìn)行組織rna的提取，按說明書的具體步驟進(jìn)行操作。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用lowrnainputlinearamplificationkit將mrna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，同時(shí)用cy3分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

4、雜交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用說明書的步驟進(jìn)行雜交。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動(dòng)以100％和10％pmt各掃描1次，2次結(jié)果agilent軟件自動(dòng)合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用featureextraction進(jìn)行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用bioconductor程序包進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后ratio值為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：fdr<0.01，abs(log2fc)>1.5。

6、結(jié)果

與癌旁組織相比，ensg00000267416基因在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。

實(shí)施例2qpcr測(cè)序驗(yàn)證ensg00000267416基因的差異表達(dá)

1、對(duì)ensg00000267416基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本qpcr驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式肝癌組織和癌旁組織樣本各60例。

2、rna提取步驟同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)qpcr擴(kuò)增檢驗(yàn)

根據(jù)ensg00000267416基因和管家基因的gapdh的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列由上海生工合成。其中，ensg00000267416基因的引物序列如seqidno.2～3所示，管家基因gapdh的引物序列如seqidno.4～5所示。

配制25μl反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35個(gè)循環(huán)。

以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。

3、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與癌旁組織相比，ensg00000267416基因在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例3分析ensg00000267416在tcga數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)情況

1、數(shù)據(jù)收集

從tcga數(shù)據(jù)庫(kù)中收集200例肝癌組織和50例癌旁組織的lncrna表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析ensg00000267416在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平；繪制箱形圖。

2、roc曲線分析

使用r語(yǔ)言中的proc包分析ensg00000267416的受試者工作特征，計(jì)算二項(xiàng)精確置信空間，繪制roc曲線。

3、結(jié)果

ensg00000267416的表達(dá)水平如圖2所示，相比對(duì)照組，ensg00000267416在肝癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。

ensg00000267416的roc曲線如圖3所示，ensg00000267416的auc值高達(dá)0.8315，且具有較高的特異性和敏感性，說明ensg00000267416應(yīng)用于肝癌的診斷具有較高的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例4ensg00000267416基因在肝癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株hepg2、huh7和正常肝細(xì)胞系hl-7702，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、rna的提取

1)胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打獲得的細(xì)胞經(jīng)離心、重懸、清洗后，以含10％fbs的dmem培養(yǎng)基重懸；

2)將重懸的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，添加培養(yǎng)基至2ml/孔，輕搖6孔板使細(xì)胞均勻重懸；

3)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48h，去培養(yǎng)基；

4)以1mltrizol試劑裂解細(xì)胞，反復(fù)吹打6孔板壁，盡量使細(xì)胞完全裂解；

5)轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液至1.5mldepc處理過的ep管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步驟同組織中rna提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實(shí)施例2.

4、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與正常肝細(xì)胞系相比，ensg00000267416基因在肝癌細(xì)胞hepg2、huh7中表達(dá)均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同rna-sep結(jié)果一致。

實(shí)施例5ensg00000267416基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培養(yǎng)基dmem在37℃、5％co2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、sirna設(shè)計(jì)

針對(duì)ensg00000267416基因設(shè)計(jì)sirna序列，其中，陰性對(duì)照sirna序列(sirna-nc)如seqidno.6～7所示；sirna1序列如seqidno.8～9所示；sirna2序列如seqidno.10～11所示；sirna3序列如seqidno.12～13所示。

將細(xì)胞按2×10⁵/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)24h；在無雙抗、含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于invitrogen公司)的說明書轉(zhuǎn)染。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(hepg2)、陰性對(duì)照組(sirna-nc)和實(shí)驗(yàn)組(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3)，其中陰性對(duì)照組sirna與ensg00000267416基因的序列無同源性，濃度為20nm/孔，同時(shí)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3、qpcr檢測(cè)ensg00000267416基因的表達(dá)水平

3.1細(xì)胞總rna的提取

具體步驟同實(shí)施例4。

3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

3.3qpcr擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖5顯示，相比hepg2、轉(zhuǎn)染空載sirna-nc、sirna2、sirna3組，sirna1組能夠顯著降低ensg00000267416的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例6cck8檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例4

2、cck8檢測(cè)細(xì)胞增殖

1)將對(duì)數(shù)增殖期的hepg2細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×10³個(gè)細(xì)胞；

2)實(shí)驗(yàn)分三組，分別是空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染sirna-nc組和轉(zhuǎn)染sirna1，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；

3)分別在轉(zhuǎn)染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8試劑；

4)2h后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)a450的吸光值。

3、結(jié)果

圖6所示的結(jié)果顯示：空白對(duì)照組同空載組無明顯差異，而轉(zhuǎn)染sirna1組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，上述結(jié)果表明ensg00000267416的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

實(shí)施例7軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10³個(gè)/ml。

3、制備兩個(gè)濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于co2溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個(gè)/ml的穩(wěn)定感染細(xì)胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)4個(gè)樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％co2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。

7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖7所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染sirna2-ensg00000267416的細(xì)胞組單細(xì)胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

實(shí)施例8ensg00000267416基因?qū)Ω伟┘?xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ensg00000267416基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例4。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例5。

3、步驟

1)將3m110×上樣緩沖液用27ml蒸餾水稀釋。

2)收集細(xì)胞樣本并用預(yù)冷的pbs清洗。

3)將細(xì)胞加入lml1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml1×上樣緩沖液，將細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁶個(gè)/ml。

5)將細(xì)胞懸液取出100μ1，加入ep管中。

6)將5μl的annexinvfitc加入ep管中，混勻ep管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μ1pi染液，在室溫下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖8所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率升高(p<0.05)，該結(jié)果說明，ensg00000267416的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。

實(shí)施例9細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

1、transwell小室制備

無菌條件下matrigel冰浴融化，用pbs進(jìn)行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含bsa的無血清培養(yǎng)液對(duì)基底膜進(jìn)行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細(xì)胞懸液

細(xì)胞撤血清饑餓處理12-24h，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化處理，終止消化后進(jìn)行離心，去除上層培養(yǎng)液。用pbs對(duì)沉淀細(xì)胞進(jìn)行清洗，加入含有bsa的無血清培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行重懸。調(diào)整細(xì)胞的密度至5×l0⁵個(gè)/ml。

3、細(xì)胞接種

取細(xì)胞懸液200μ1(遷移實(shí)驗(yàn)為100μ1，侵襲實(shí)驗(yàn)為200μ1)加入到transwell小室中。在24孔板下室加入500μ1含fbs的1640培養(yǎng)基。把細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4、染色

細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用dapi染色。把小室細(xì)胞先用pbs漂洗2遍，放入dapi工作液中室溫染色5-20min。用pbs漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖9所示，在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾rna之后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結(jié)果說明ensg00000267416能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>生物標(biāo)記物ensg00000267416在癌癥中的應(yīng)用

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>699

<212>dna

<213>人源

<400>1

gaatggcgtgaacccgggaggcagggcttgcaatgagccaagatcgcgccactgcactcc60

agcctgggcgacagagcgagactccgtctcagaaaaaaaaaaaaagaaagaaattggctt120

ggagatttttcgccggccactccttcttgagccctgactgaaaagaaaaatgaacagggc180

taccttctgcctggactcacccaaaagccggtctcctgcagcctgaagctcttgtacctc240

taggctgaagatgatgaggatcacaggaggaggaaggctgccaacttcatgttgctgttg300

gaaggctttggaaaaacacagcagggctgagagcagctgaaatttataccttccacccgc360

tgagctggaatgcaaggccaggggtgggactagggactgcagacacctaagccctgccca420

gaaactgacatttctggagaatagccacccaccctgtgtaccctgggtccttctacatta480

cctaagcaaggctctgagccaagggaacgccctcctctgacagaaaaataagactcctac540

accaggccagttgcagtggctcacatctgtaatcccagcactttgggaggccaaggcagg600

aggatcatttgagcccaggagttcaagaccagcctgggtaacaagagcaagaccctgtct660

ctacaaaattaaaaaaaaaaaaagttaaataatgaaaaa699

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgggtccttctacattac18

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctggtgtaggagtcttat18

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccgggaaactgtggcgtgatgg22

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aggtggaggagtgggtgtcgctgtt25

<210>6

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>6

uucuccgaacgugucacgu19

<210>7

<211>19

<212>rna

<213>人工序列

<400>7

acgugacacguucggagaa19

<210>8

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>8

uguucauuuuucuuuucaguc21

<210>9

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>9

cugaaaagaaaaaugaacagg21

<210>10

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>10

uucuuuuuuuuuuuuucugag21

<210>11

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>11

cagaaaaaaaaaaaaagaaag21

<210>12

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>12

uucauuuuucuuuucagucag21

<210>13

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<400>13

gacugaaaagaaaaaugaaca21