本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種利用單拷貝核基因檢測(cè)食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：由于綿羊肉與山羊肉的區(qū)分一直存在很大的困難，因此在很多的食品與飼料的檢測(cè)當(dāng)中通常不去區(qū)分山羊和綿羊，只檢測(cè)是否含有羊成分，這在無(wú)形當(dāng)中對(duì)食品安全埋下了隱患，也使得一些不法分子進(jìn)行摻假牟利有了可乘之機(jī)。2013年初，瑞典、英國(guó)等多個(gè)歐洲國(guó)家卷入“馬肉風(fēng)波”丑聞中，引起各國(guó)對(duì)肉及肉制品摻假問(wèn)題的關(guān)注。在我國(guó)，“摻假”問(wèn)題一直是消費(fèi)者投訴的焦點(diǎn)和社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。一些不法商販和企業(yè)因利益驅(qū)使，將豬、鴨等低成本原料摻入牛、羊等高價(jià)肉及肉制品中。這些行為不僅侵害消費(fèi)者利益，還可能因某些宗教食品中含有非清真成分引起糾紛，如果未經(jīng)檢疫還有可能引起疫病的傳播，不利于維護(hù)社會(huì)安定和人民身體健康，如果問(wèn)題產(chǎn)品出口到國(guó)外更會(huì)損害我國(guó)食品企業(yè)的整體形象。為了打擊肉類(lèi)摻假的違法行為，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益和生命安全，保障食品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，制定嚴(yán)格的法律法規(guī)來(lái)約束生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者的行為是極為重要的，同時(shí)也需要制訂準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。常見(jiàn)的肉及肉制品真?zhèn)舞b別技術(shù)主要包括：(1)基于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的免疫分析技術(shù)等；基于蛋白大分子結(jié)構(gòu)的免疫分析方法具有高靈敏度、高通量、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣品的快速檢測(cè)。例如，macedo-silva等通過(guò)制備抗牛、雞、豬、馬白蛋白的抗血清建立了elisa方法用于鑒別漢堡中可能摻入的廉價(jià)肉類(lèi)成分，靈敏度可達(dá)0.6％。但是，基于抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫分析方法對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)在食物加工過(guò)程中可能受到破壞而影響抗體識(shí)別也是該方法的重要不足之處。(2)基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)，如pcr、實(shí)時(shí)熒光pcr和分子指紋技術(shù)等；基于dna序列特異性的分子生物學(xué)技術(shù)以動(dòng)物種屬間遺傳信息的差異作為肉種鑒別的檢測(cè)靶點(diǎn)而被廣泛使用。相比于蛋白質(zhì)，dna由于熱穩(wěn)定性高，在加工過(guò)程中雖然存在一定程度的降解，但仍能提取出小片段dna用于pcr等分析。同時(shí)dna具有特異性高、靈敏度高、不受組織類(lèi)別限制等諸多優(yōu)勢(shì)，對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種具有較高的分辨能力。近年來(lái)，基于dna檢測(cè)技術(shù)的肉及肉制品真實(shí)性鑒別方法的研究越來(lái)越多。目前主要集中于以pcr為基礎(chǔ)的各類(lèi)分析方法，其中包括dna測(cè)序、多重pcr、實(shí)時(shí)熒光定量pcr等。特別是實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)在動(dòng)物源性成分的檢測(cè)領(lǐng)域，日漸成為主流檢測(cè)技術(shù)。pcr技術(shù)通過(guò)一段特異的寡核苷酸與目標(biāo)dna序列結(jié)合而在體外合成數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的dna拷貝。通過(guò)物種特異性引物對(duì)dna片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖電泳分離并觀察特異性條帶是pcr技術(shù)鑒別物種成分的最基本方法。線粒體dna在細(xì)胞中拷貝數(shù)量大、靈敏度高、進(jìn)化速度快，具有較高的種間多樣性和較低的種內(nèi)變異，已被廣泛應(yīng)用于引物設(shè)計(jì)和靶序列的擴(kuò)增。如常用的線粒體基因有細(xì)胞色素b基因、12s和16s核糖體rna亞基、d-loop區(qū)。但是，由于線粒體dna序列的拷貝數(shù)高且不恒定，只能應(yīng)用于動(dòng)物源性成分的定性檢測(cè)，很難應(yīng)用于定量檢測(cè)?！皊peciesidentificationandquantificationinmeatandmeatproductsusingdropletdigitalpcr(ddpcr)analyticalmethods”,c.floren,i.wiedemann,b.brenig,e.schütz,j.beck,foodchemistry173(2015)1054–1058，該文章的結(jié)論明確了在定量的時(shí)候使用線粒體源的引物和探針會(huì)引起結(jié)果偏差。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)動(dòng)物成分的引物和探針一般都是針對(duì)線粒體基因設(shè)計(jì)的，線粒體基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)在5000-6000拷貝或更多。但在實(shí)際研究工作中發(fā)現(xiàn)：利用多拷貝的線粒體基因設(shè)計(jì)出一套引物和探針進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其ct值可低達(dá)為13左右，如此低的ct值，當(dāng)樣品中動(dòng)物源性成分在0.00000001％時(shí)，ct值仍然在37左右。在目標(biāo)檢測(cè)物如此低的檢測(cè)濃度，出現(xiàn)這樣的ct值，使檢測(cè)人員很難判斷實(shí)際樣品是真正含有目標(biāo)成分，還是樣品受到非常輕微的污染。所以利用線粒體基因設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行檢測(cè)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或很難判斷低目標(biāo)含量下的檢測(cè)結(jié)果。如果根據(jù)這么低的ct值來(lái)出具陽(yáng)性檢測(cè)報(bào)告，會(huì)引出很大的貿(mào)易糾紛。因此，有必要建立一套特異性好、靈敏度高、可以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等的食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：檢測(cè)某一個(gè)動(dòng)物純?nèi)鈽悠分械膭?dòng)物源性成分，利用單拷貝的核基因設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行檢測(cè)，其ct值為22-24時(shí)；當(dāng)樣品中動(dòng)物源性成分在0.001％時(shí)，ct值在37左右。為此本發(fā)明利用單拷貝的核基因進(jìn)行物種鑒別檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用單拷貝基因檢測(cè)可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或很難判斷結(jié)果的情況發(fā)生，并且利用單拷貝的核基因進(jìn)行檢測(cè)，還能進(jìn)行定量檢測(cè)，所以尋找單拷貝的核基因進(jìn)行檢測(cè)并據(jù)此建立標(biāo)準(zhǔn)方法顯得非常必要。本發(fā)明首要目的在于提供一種食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的難于定量檢測(cè)、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等的不足。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法的引物對(duì)和探針。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：作為本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種利用單拷貝核基因檢測(cè)食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：第一步，以待測(cè)樣品的dna為模板，進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；第二步，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；第三步，以檢測(cè)結(jié)果的ct值判定樣品中是否含有綿羊源性成分以及定量檢測(cè)樣品中的綿羊源性成分的含量；其中，用于pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有擴(kuò)增綿羊源性成分的特異性引物對(duì)和綿羊源性成分的特異性探針，所述擴(kuò)增綿羊源性成分的特異性引物對(duì)的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述綿羊源性成分的特異性探針的序列如seqidno.3所示。根據(jù)本發(fā)明，所述pcr擴(kuò)增的條件如下：反應(yīng)體系為25μl：實(shí)時(shí)熒光pcr試劑(2×)12.5μl，引物各10μm，探針5μm，dna模板5μl；pcr反應(yīng)條件：95℃10min；95℃15s；60℃1min；共45個(gè)循環(huán)。作為本發(fā)明的第二個(gè)方面，一種綿羊源性成分的檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒含有以下試劑：(a)擴(kuò)增綿羊源性成分的特異性引物對(duì)；(b)綿羊源性成分的特異性探針；其中，所述擴(kuò)增綿羊源性成分的特異性引物對(duì)的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述綿羊源性成分的特異性探針的序列如seqidno.3所示。進(jìn)一步的，所述檢測(cè)試劑盒還包括：(c)標(biāo)準(zhǔn)參照物，用于定量檢測(cè)樣品中的綿羊源性成分的含量。作為本發(fā)明的第三個(gè)方面，一種所述的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，所述檢測(cè)試劑盒用于定性或定量檢測(cè)食品或飼料中的綿羊源性成分。作為本發(fā)明的第四個(gè)方面，一種綿羊源性成分的特異性引物對(duì)和探針，所述特異性引物對(duì)的序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述特異性探針的序列如seqidno.3所示。本發(fā)明的有益效果是：1、提供了一種來(lái)源于核基因的可特異性鑒定綿羊源性成分的引物對(duì)和探針，其特異性良好，對(duì)于綿羊源性成分能夠?qū)崿F(xiàn)特異性擴(kuò)增，而對(duì)于綿羊以外的其它成分則不能特異性擴(kuò)增；而且，所述引物對(duì)和探針具有良好的再現(xiàn)性、結(jié)果穩(wěn)定可靠。2、利用所述的引物對(duì)和探針可快速、大批量地檢測(cè)食品或飼料中是否存在綿羊源性成分以及定量檢測(cè)食品或飼料中的綿羊源性成分的含量，并且所需樣品量少，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高。3、本發(fā)明的綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法，其適用范圍廣，特別適用于各類(lèi)食品或飼料中的綿羊源性成分的檢測(cè)，因此可以推廣應(yīng)用，對(duì)保障產(chǎn)品的質(zhì)量，保護(hù)消費(fèi)者知情權(quán)和選擇權(quán)，維護(hù)正常的經(jīng)濟(jì)秩序等提供了技術(shù)支持，為食品的市場(chǎng)監(jiān)督部門(mén)和檢驗(yàn)檢疫部門(mén)提供了技術(shù)支持。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例的第一組引物對(duì)和探針的實(shí)時(shí)熒光pcr靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖。其中，擴(kuò)增曲線從左到右分別是40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl綿羊dna樣品。圖2為實(shí)施例1的第二組引物對(duì)和探針的實(shí)時(shí)熒光pcr靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖。其中，擴(kuò)增曲線從左到右分別是40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl綿羊dna樣品。圖3為實(shí)施例1的第一組引物對(duì)和探針的實(shí)時(shí)熒光pcr引物特異性試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線圖。其中，擴(kuò)增曲線為綿羊標(biāo)準(zhǔn)品。圖4為綿羊源性成分的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件或廠商提供的條件進(jìn)行。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料如下：(1)山羊(caprahircus)、綿羊(ovisaries)、家牛(bostaurus)、驢(equusasinus)、馬(equuscaballus)、雞(gallusgallus)、鴨(anasplatyrhynchos)、鵝(anseranser)、火雞(meleagrisgallopavo)、豬(susscrofa)、鵪鶉(coturnixcoturnix)、駱駝(camelusdromedarius)、家貓(feliscatus)的dna標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自于美國(guó)zyagenlaboratories公司。(2)山羊肉、牛肉、鳊魚(yú)肉、鯧魚(yú)肉、黃魚(yú)肉、大馬哈魚(yú)肉等動(dòng)物成分為市售產(chǎn)品。(3)大鼠肉、小鼠肉購(gòu)買(mǎi)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。(4)大米、玉米、黃豆、小米、綠豆、紅薯、馬鈴薯、白云豆、蘋(píng)果、芹菜等植物成分為市售產(chǎn)品。(5)用于實(shí)際驗(yàn)證的羊肉味狗糧、羊排、牛肉味貓糧、雞肉火腿臘腸(進(jìn)口)、豬肉火腿臘腸(進(jìn)口)、牛肉火腿臘腸(進(jìn)口)、牛肉午餐肉、豬肉午餐肉、紅燒牛肉罐頭、牛肉干、豬肉脯、牛肉丸、咖喱牛肉醬、雞肉味狗糧(進(jìn)口)、牛肉味狗糧(進(jìn)口)、吞拿魚(yú)貓罐頭(進(jìn)口)為市售產(chǎn)品。(6)澳大利亞寵物級(jí)雞肉骨粉由上海海關(guān)口岸提供。實(shí)施例1引物對(duì)和探針的設(shè)計(jì)(1)第一組引物對(duì)和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)ncbi中已發(fā)表的綿羊(ovineprolactinreceptorshortformmrna(prlr))dna序列(登錄號(hào)：af041979.1)，選取合適的序列片段進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。針對(duì)綿羊源性成分的目的片段長(zhǎng)度為88bp。熒光pcr引物對(duì)和探針的序列如下：ovine-88bp-f：5’-ccaacatgcctttaaaccctcaa-3’(seqidno：1)ovine-88bp-r：5’-ggaactgtagccttctgactcg-3’(seqidno：2)ovine-88bp-p：fam-tgcctttccttccccgccagtctc-tamra(seqidno：3)其中，fam表示熒光報(bào)告基團(tuán)，tamra表示淬滅基團(tuán)。本發(fā)明采用熒光探針?lè)?，其檢測(cè)原理是利用熒光標(biāo)記特異性探針來(lái)識(shí)別模板。與現(xiàn)有技術(shù)中sybr染料法相比，本發(fā)明熒光標(biāo)記特異性探針的特異性更強(qiáng)，背景干擾更低。(2)第二組引物對(duì)和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)ncbi中已發(fā)表的綿羊(ovisariesbreedtexel)染色體1基因序列(登錄號(hào)：nc_019458.2)，選取當(dāng)中合適的片段設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針，引物對(duì)和探針如下：ovis-110bp-f：5’-attattctcagcccgtccttacg-3’(seqidno：4)ovis-110bp-r：5’-agtagaacagtaaattggatagccttc-3’(seqidno：5)ovis-110bp-p：fam-aagagcctaactatcaacgaagaacagacacgaga-tamra(seqidno：6)其中，fam表示熒光報(bào)告基團(tuán)，tamra表示淬滅基團(tuán)。本發(fā)明采用熒光探針?lè)?，其檢測(cè)原理是利用熒光標(biāo)記特異性探針來(lái)識(shí)別模板。與現(xiàn)有技術(shù)中sybr染料法相比，本發(fā)明熒光標(biāo)記特異性探針的特異性更強(qiáng)，背景干擾更低。(3)第一組引物對(duì)和探針和第二組引物對(duì)和探針的實(shí)時(shí)熒光pcr的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)崟r(shí)熒光pcr反應(yīng)體系見(jiàn)表1：其中，實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min；95℃15s,60℃1min；共45個(gè)循環(huán)。表1綿羊源性成分實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)體系實(shí)施例2測(cè)試樣品的準(zhǔn)備動(dòng)物肉類(lèi)樣品經(jīng)撕碎、烘干后，使用冷凍研磨機(jī)(spex6850)磨成粉末狀。植物樣品和用于實(shí)際驗(yàn)證的樣品直接使用冷凍研磨機(jī)(spex6850)磨成粉末狀。實(shí)施例3dna的抽提使用動(dòng)物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司；目錄號(hào)：dp323)提取動(dòng)物樣品dna，使用植物基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司；目錄號(hào)：dp305)提取植物樣品dna，使用動(dòng)物源性植物飼料基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司；目錄號(hào)：dp323)提取混合樣品及實(shí)際驗(yàn)證樣品dna，提取方法詳見(jiàn)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。dna溶液置于-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例4第一組綿羊源性成分的引物對(duì)和探針和第二組綿羊源性成分的引物對(duì)和探針的靈敏度檢測(cè)以綿羊dna含量40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl和0.0001ng/μl為樣品dna為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)6次。結(jié)果：(1)第一組引物對(duì)和探針：在6次檢測(cè)中，40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl的綿羊樣品dna中均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而0.001ng/μl和0.0001ng/μl綿羊樣品dna未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，如圖1。(2)第二組引物對(duì)和探針：在6次檢測(cè)中，40ng/μl，20ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl的綿羊樣品dna中均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但是擴(kuò)增曲線與dna濃度不成比例，而0.01ng/ul,0.001ng/μl和0.0001ng/μl綿羊樣品dna未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，如圖2。結(jié)論：1、第一組引物對(duì)和探針在模板使用量為0.01ng/μl時(shí)，有明顯s型擴(kuò)增曲線，檢出靈敏度達(dá)到0.01ng/μl；第一組綿羊源性成分的引物對(duì)和探針具有較好的準(zhǔn)確性；2、第二組引物對(duì)和探針和第一組引物對(duì)和探針存在明顯差異。第二組引物對(duì)和探針在靈敏度檢測(cè)中的效果不明顯。由于第二組綿羊源性成分的引物對(duì)和探針在靈敏度檢測(cè)中的效果不明顯，因此后續(xù)試驗(yàn)僅針對(duì)第一組綿羊源性成分的引物對(duì)和探針。實(shí)施例5綿羊源性成分的引物對(duì)和探針的特異性檢測(cè)本實(shí)施例使用實(shí)施例1的綿羊源性成分的引物對(duì)和探針對(duì)實(shí)施例3供試的32種動(dòng)植物材料dna樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)。檢測(cè)結(jié)果的總結(jié)見(jiàn)表2和圖3。表2綿羊源性成分的特異性檢測(cè)結(jié)果序號(hào)樣品名稱(chēng)試驗(yàn)結(jié)果序號(hào)樣品名稱(chēng)試驗(yàn)結(jié)果1綿羊dna+17牛肉—2山羊dna—18鳊魚(yú)肉—3驢dna—19鯧魚(yú)肉—4家牛dna—20黃魚(yú)肉—5馬dna—21大馬哈魚(yú)肉—6雞dna—22大鼠肉—7鴨dna—23小鼠肉—8鵝dna—24大米—9鵪鶉dna—25玉米—10火雞dna—26黃豆—11豬dna—27小米—12駱駝dna—28綠豆—13家貓dna—29紅薯—14狗dna—30馬鈴薯—15鹿dna—31白云豆—16芹菜—32蘋(píng)果—從圖3和表2可以看出，引物對(duì)和探針僅對(duì)綿羊dna肉樣品擴(kuò)增陽(yáng)性，有明顯s型擴(kuò)增曲線，而對(duì)其它多個(gè)物種dna樣品均擴(kuò)增陰性，無(wú)明顯s型擴(kuò)增曲線。結(jié)論：本發(fā)明的檢測(cè)方法具有良好的物種特異性。實(shí)施例6綿羊源性成分的引物對(duì)和探針的實(shí)際驗(yàn)證采用實(shí)施例4的檢測(cè)方法，對(duì)市場(chǎng)上、進(jìn)出口貿(mào)易途徑收集的17份肉質(zhì)食品和動(dòng)物飼料等樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表3。表317份待測(cè)樣品的綿羊源性成分的檢測(cè)結(jié)果從表3可以看出，在1份肉質(zhì)食品(羊排)和兩份飼料中檢測(cè)出綿羊源性成分；其余食品和飼料中未檢出綿羊源性成分。結(jié)論：除飼料(牛肉味貓糧)外，其他抽取樣品的肉質(zhì)來(lái)源與檢測(cè)結(jié)果相符。說(shuō)明飼料(牛肉味貓糧)存在摻假可能。同時(shí)也說(shuō)明采用實(shí)施例5的檢測(cè)方法可以大批量地檢測(cè)食品或飼料中是否存在綿羊源性成分。實(shí)施例7定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(1)綿羊源性成分引物對(duì)和探針的定量檢測(cè)將實(shí)施例3抽提獲得的綿羊dna稀釋成100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，共五個(gè)濃度梯度，使用實(shí)施例1的引物對(duì)和探針進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)，獲得ct值。陰性對(duì)照為水。如表4所示，其中ct值為6個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值。表4實(shí)時(shí)熒光pcr定量檢測(cè)試驗(yàn)的ct值模板用量(ng/ul)ct值10023.9111026.799130.6780.134.6140.0138.192陰性對(duì)照-結(jié)論：可以看出隨著綿羊源性成分的濃度降低，擴(kuò)增ct值呈梯度增大，并呈一定的線性關(guān)系(r2＝0.997)。(2)數(shù)據(jù)的處理和計(jì)算結(jié)果如圖4所示，以dna濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以樣品的6次重復(fù)試驗(yàn)的ct值的平均值為縱坐標(biāo)，取點(diǎn)進(jìn)行曲線擬合，得定量標(biāo)準(zhǔn)直線，線性方程為y＝3.637x+19.92，且r2＝0.997。對(duì)于需定量的樣品，每次測(cè)得待測(cè)樣品的各自的ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式求得相應(yīng)的x值。即能得出待測(cè)樣品的綿羊源性成份的含量。(3)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證按實(shí)施例3的方法抽提dna，分別稀釋定量6個(gè)獨(dú)立的樣本，濃度分別為50ng/μl和0.5ng/μl的，檢測(cè)各自的ct值，并通過(guò)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中的綿羊源性成份的含量，用以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，50ng樣品測(cè)得值的平均值為51.7ng，0.5ng樣品測(cè)得值的平均值為0.47ng。結(jié)論：說(shuō)明采用本實(shí)施例的方法在一定動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)具有精確定量的能力。從而證明本發(fā)明的方法實(shí)際測(cè)得值與理論值相符，重復(fù)性好。本發(fā)明建立了利用單拷貝核基因檢測(cè)食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr方法，針對(duì)綿羊物種的核基因設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針，僅需結(jié)合實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線圖，不超過(guò)兩個(gè)小時(shí)就能準(zhǔn)確檢測(cè)到樣品中是否存在綿羊源性成份，其靈敏度為0.01ng/μl。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)的綿羊源性成份實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增的特異性引物對(duì)和探針不僅特異性好，而且靈敏度高，為快速準(zhǔn)確地區(qū)分食品或飼料中是否含有綿羊源性成分提供了一種很好的檢測(cè)方法，在食品安全領(lǐng)域的檢測(cè)把關(guān)上，具有良好的應(yīng)用前景。而且，所述特異性引物對(duì)和探針可采用本領(lǐng)域中已知的方法，進(jìn)一步制成檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒除了所述特異性引物對(duì)和探針外，還可以包括標(biāo)準(zhǔn)參照物，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等同物界定。序列表<110>上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>利用單拷貝核基因檢測(cè)食品和飼料中綿羊源性成分的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法<130>171007<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccaacatgcctttaaaccctcaa23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<400>2ggaactgtagccttctgactcg22<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tgcctttccttccccgccagtctc24<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4attattctcagcccgtccttacg23<210>5<211>27<212>dna<213>人工序列<400>5agtagaacagtaaattggatagccttc27<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<400>6aagagcctaactatcaacgaagaacagacacgaga35當(dāng)前第1頁(yè)12