本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種豫南香稻品種badh2基因功能標(biāo)記的檢測(cè)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻(oryzasatival.)是世界上最重要的糧食作物之一，全世界有超過一半的人口且我國(guó)有三分之二的人口以稻米為主食。隨著生活水平的提高，人們對(duì)優(yōu)質(zhì)稻米的需求正在不斷增加。然而稻米品質(zhì)性狀復(fù)雜，主要包括營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、外觀品質(zhì)、研磨加工品質(zhì)、蒸煮和食味品質(zhì)等幾個(gè)方面，而在這些品質(zhì)當(dāng)中，消費(fèi)者往往更注重稻米的蒸煮和食味品質(zhì)。而作為栽培稻特殊類型的香稻，由于香氣馥郁、米飯芬芳、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高等特點(diǎn)，被視為稻米中的珍品。傳統(tǒng)的香稻品種地域性強(qiáng)、抗性較差且產(chǎn)量偏低，難以大面積推廣，故香米價(jià)格較高，但是人們對(duì)香米的需求近年來卻顯著增加。因此，香稻的遺傳育種受到國(guó)內(nèi)外水稻遺傳學(xué)家和育種學(xué)家的高度關(guān)注。
目前，在水稻中已經(jīng)有超過200種揮發(fā)性物質(zhì)被分離并得到鑒定，其中2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-ap)被認(rèn)為是香稻中主要的揮發(fā)性物質(zhì)之一，且2-ap在較低的濃度條件下就能夠被檢測(cè)到。已經(jīng)有多種方法用來檢測(cè)水稻材料中的香味，其中咀嚼法和koh法是在傳統(tǒng)育種過程中最為常用的方法，但是這兩種依靠人的感官來進(jìn)行判定香味的方法準(zhǔn)確性較差。前期研究表明：位于水稻第8染色體上的隱性基因fgr，是一個(gè)與香味密切相關(guān)的基因，該基因隨后被分離克隆。進(jìn)一步研究揭示：基因fgr編碼甜菜堿醛脫氫酶(betainealdehydedehydrogenasehomologue2,badh2)，抑制fgr基因的表達(dá)、敲除fgr基因或者fgr基因發(fā)生變異，導(dǎo)致badh2酶功能的缺失，都會(huì)使2ap前體物質(zhì)增加，進(jìn)而積累2ap使水稻產(chǎn)生香味。因此，fgr基因和badh2基因?yàn)橥粋€(gè)香味基因。
針對(duì)badh2基因，在280份普通野生稻和242份普通栽培稻中的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)：除了在第2外顯子存在一個(gè)7-bp的缺失和第8外顯子存在一個(gè)7-bp的插入突變之外，在badh2基因的第1、10、13、和14外顯子均存在變異位點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：在badh2基因的第4和5外顯子、第1外顯子和第1內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)、啟動(dòng)子區(qū)域及其5’utr區(qū)也有插入、缺失或者單個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)。目前已經(jīng)開發(fā)了多個(gè)與水稻香味有關(guān)的分子標(biāo)記，并用于水稻新品種或者恢復(fù)系的選育。然而，這些分子標(biāo)記大多是單核苷酸多態(tài)性分子標(biāo)記、插入或者缺失類型的分子標(biāo)記，且pcr產(chǎn)物的堿基差異比較小，必須利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離分析。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作的過程比較繁瑣，不利于大規(guī)模利用分子標(biāo)記進(jìn)行準(zhǔn)確地檢測(cè)與分析工作。同時(shí)，基于dna的分子標(biāo)記一般是利用其基因組序列的多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)，往往標(biāo)記與目的基因較遠(yuǎn)，會(huì)發(fā)生標(biāo)記與對(duì)應(yīng)的表型不完全吻合的現(xiàn)象?；虻墓δ軜?biāo)記，是針對(duì)特異的基因而設(shè)計(jì)的，與基因?qū)?yīng)的表型是完全吻合的，相對(duì)于普通的香味相關(guān)的分子標(biāo)記，badh2基因的功能標(biāo)記在作物的遺傳改良過程中更加準(zhǔn)確。由于badh2基因在不同的香稻品種中存在不同的突變類型，而一個(gè)badh2基因功能標(biāo)記只能夠檢測(cè)一種類型的突變，在利用已經(jīng)開發(fā)的分子標(biāo)記或者功能標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種的過程中，將多個(gè)badh2等位基因的功能標(biāo)記同時(shí)用于豫南香稻品種的檢測(cè)與分析還未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)水稻香味基因相關(guān)的分子標(biāo)記在香稻遺傳育種過程中可能會(huì)出現(xiàn)篩選不準(zhǔn)確，篩選過程比較繁瑣，不利于大規(guī)模針對(duì)香稻育種中間材料進(jìn)行準(zhǔn)確快速地檢測(cè)與分析的問題，提供了一種豫南香稻品種badh2基因功能標(biāo)記的檢測(cè)及應(yīng)用，本發(fā)明利用badh2基因開發(fā)的7個(gè)基因功能標(biāo)記，針對(duì)香稻品種進(jìn)行了檢測(cè)與分析，旨在明確香稻資源香味基因的變異類型，進(jìn)而利用分子標(biāo)記輔助選擇香稻資源進(jìn)行香稻的分子育種，為優(yōu)質(zhì)香稻新品種的培育奠定基礎(chǔ)。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用badh2基因功能標(biāo)記檢測(cè)豫南香稻品種的方法，包括以下步驟：
步驟1、pcr擴(kuò)增：對(duì)豫南香稻品種的葉片采用ctab法提取全基因組的dna；
步驟2、利用badh2基因功能標(biāo)記所提取的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；
步驟3、將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察結(jié)果。
進(jìn)一步地，所述badh2基因功能標(biāo)記包括fmu1-2、fme2、fme4-5、fme7、fme12、fme13和fme14引物對(duì)；所述fmu1-2引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.1所示fmu1-2f引物和核苷酸序列如seqidno.2所示的fmu1-2r引物；所述fme2引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.3所示fme2f引物和核苷酸序列如seqidno.4所示的fme2r引物；所述fme4-5引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.5所示fme4-5f引物和核苷酸序列如seqidno.6所示的fme4-5r引物；所述fme7引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.7所示的fme7f1引物和核苷酸序列如seqidno.8所示的fme7r1引物；以及如seqidno.9所示的fme7f2引物和核苷酸序列如seqidno.10所示的fme7r2引物；所述的fme12引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.11所示fme12f引物和核苷酸序列如seqidno.12所示的fme12r引物；所述的fme13引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.13所示fme13f引物和核苷酸序列如seqidno.14所示的fme13r引物；所述的fme14引物對(duì)包括核苷酸序列如seqidno.15所示fme14f引物和核苷酸序列如seqidno.16所示的fme14r引物。
進(jìn)一步地，pcr反應(yīng)體系包括dna模板2μl，10×buffer2.5μl，25mmol·l-1的mgcl21.5μl，2.5mmol·l-1的dntp2.0μl，正向和反向引物(12.5μmol·l-1)各1.0μl，5u·μl-1的taq酶0.4μl，補(bǔ)充無菌水至20μl。
進(jìn)一步地，pcr反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s,55℃～61℃退火30s，72℃延伸30s～90s，反應(yīng)32個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10min，25℃保存。
進(jìn)一步地，功能標(biāo)記fme4-5和fme7的pcr產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察結(jié)果；fme2基因功能標(biāo)記的pcr產(chǎn)物均在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后硝酸銀銀染后觀察。
本發(fā)明還公開了一種上述的badh2基因功能標(biāo)記在香稻品種的育種中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
1)本發(fā)明可以針對(duì)水稻中badh2基因的多個(gè)功能性位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確快速地檢測(cè)與分析。
2)本發(fā)明能夠利用badh2基因開發(fā)的7個(gè)基因功能標(biāo)記，鑒定不同的豫南香稻品種中的badh2基因的變異類型及其對(duì)應(yīng)的基因型。
3)本發(fā)明能夠利用badh2基因的功能標(biāo)記，直接利用分子標(biāo)記輔助選擇培育優(yōu)質(zhì)豫南香稻新品種。
當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
附圖說明
此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
圖1是本發(fā)明7個(gè)badh2基因功能標(biāo)記對(duì)16個(gè)香稻和4個(gè)非香水稻材料電泳檢測(cè)圖；其中，a為功能標(biāo)記fmu1-2的pcr檢測(cè)條帶；b為功能標(biāo)記fme2的pcr檢測(cè)條帶；c為功能標(biāo)記fme4-5的pcr檢測(cè)條帶；d為功能標(biāo)記fme7的pcr檢測(cè)條帶；e為功能標(biāo)記fme12-13的pcr檢測(cè)條帶；f為功能標(biāo)記fme14的pcr檢測(cè)條帶；wt為4個(gè)非香水稻品種(信粳46、豫農(nóng)31、豫農(nóng)32和豫農(nóng)9)混合樣品，1～16全部為香稻品種，其編號(hào)對(duì)應(yīng)于表1。
具體實(shí)施方式
以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
本發(fā)明中所有的材料均為粳稻類型的水稻品種，其中來源于豫南地區(qū)16份香稻資源具有廣泛的代表性，有14份常規(guī)香稻和2份糯型香稻，并選取4種常規(guī)粳稻品種作為對(duì)照(表1)。所有的香稻品種及其對(duì)照材料均于2016年播種在信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院同一試驗(yàn)大田中，每個(gè)品種種植2行，每行12株，株行距為16.5×26.4cm。從播種到種子成熟期間實(shí)行普通大田常規(guī)栽培管理。
表1試驗(yàn)材料及其來源
實(shí)施例11.2基因功能標(biāo)記
香味基因badh2在自然群體中存在多種等位基因的形式，并且不同的等位基因其香味有所差別，針對(duì)badh2基因在5’utr區(qū)、第2、4、5、7、12、13和14外顯子存在插入、缺失或者單核苷酸變異位點(diǎn)開發(fā)了7個(gè)badh2基因功能標(biāo)記。其中功能標(biāo)記fme14是酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記(thecleavedamplifiedpolymorphicsequencemarker,caps)，其余的均為普通pcr分子標(biāo)記，各個(gè)badh2基因功能標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、引物的序列、退火溫度等詳細(xì)信息見表2。所有的引物均為南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并且通過預(yù)試驗(yàn)表明，該7個(gè)badh2基因功能標(biāo)記均在反應(yīng)體系表現(xiàn)穩(wěn)定、結(jié)果清晰可靠。
表2badh2基因功能標(biāo)記信息
實(shí)施例2豫南香稻品種badh2基因功能標(biāo)記的檢測(cè)
1)pcr擴(kuò)增：豫南香稻品種和4個(gè)對(duì)照粳稻的葉片均采用ctab法提取全基因組的dna。
pcr反應(yīng)體系包括dna模板2μl，10×buffer2.5μl，25mmol·l-1的mgcl21.5μl，2.5mmol·l-1的dntp2.0μl，正向和反向引物(12.5μmol·l-1)各1.0μl，5u·μl-1的taq酶0.4μl，補(bǔ)充無菌水至20μl。所用的試劑采購于上海生工生物工程技術(shù)有限公司。
pcr反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s,55℃～61℃退火30s,72℃延伸30s～90s，反應(yīng)32個(gè)循環(huán)后72℃再延伸10min，25℃保存。
2)pcr產(chǎn)物檢測(cè)
功能標(biāo)記fme14的pcr產(chǎn)物先經(jīng)過bslⅰ限制性內(nèi)切酶(在cutsmart緩沖液條件下)在55℃反應(yīng)3小時(shí)，然后在1.5％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳；功能標(biāo)記fme4-5和fme7的pcr產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察結(jié)果。其余的badh2基因功能標(biāo)記的pcr產(chǎn)物均在6％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后硝酸銀銀染后觀察。
3)試驗(yàn)結(jié)果：
3.1)功能標(biāo)記fme2的檢測(cè)結(jié)果
分別以16份豫南香稻品種和4份常規(guī)粳稻品種的基因組dna為模板，利用badh2基因功能標(biāo)記fme2進(jìn)行pcr擴(kuò)增，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果(圖1b)表明：信香粳1號(hào)、香粳805、常香粳101和農(nóng)香粳共有4份香稻品種能夠擴(kuò)增出100bp大小的片段，說明這4份香稻材料在badh2基因的第2外顯子處都存在一個(gè)7bp的缺失片段，它們屬于同一種香味基因的變異類型。其余的4份常規(guī)粳稻品種和12份豫南香稻品種都擴(kuò)增出一條107bp大小的片段，說明這12份豫南香稻材料不屬于badh2基因的第2外顯子突變類型。
3.2)功能標(biāo)記fme4-5的檢測(cè)結(jié)果
以16份豫南香稻品種和4份常規(guī)粳稻品種的基因組dna為模板，利用badh2基因功能標(biāo)記fme4-5分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，采用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果(圖1c)表明：白香粳和香粳805可以擴(kuò)增出321bp大小的片段，說明這2份香稻材料在badh2基因的第4和5外顯子處都存在一個(gè)803bp的缺失片段，它們屬于同一種香味基因的變異類型。其余的4份常規(guī)粳稻品種和14份豫南香稻品種都擴(kuò)增出一條1123bp大小的片段，說明這14份豫南香稻材料不屬于badh2基因的第4和5外顯子突變類型。
3.3)功能標(biāo)記fme7的檢測(cè)結(jié)果
分別以16份豫南香稻品種和4份常規(guī)粳稻品種的基因組dna為模板，利用badh2基因功能標(biāo)記fme7進(jìn)行pcr擴(kuò)增，采用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果(圖1d)表明：矮稈香稻丸、信香糯933、香豐916、淮濱香香稻和息縣香稻丸均能夠擴(kuò)增出大小為583bp和169bp的2個(gè)片段，說明這5份香稻材料在badh2基因的第7外顯子處存在一個(gè)8bp的缺失片段和3bp的突變，它們屬于同一種香味基因的突變類型。其余的4份常規(guī)粳稻品種和11份豫南香稻品種擴(kuò)增出大小分別為591bp和449bp的2個(gè)條帶，說明這11份豫南香稻材料不屬于badh2基因的第7外顯子突變類型。
3.4)功能標(biāo)記fmu1-2、fme12-13和fme14的檢測(cè)結(jié)果
以16份豫南香稻品種和4份常規(guī)粳稻品種的基因組dna為模板，分別利用badh2基因功能標(biāo)記fmu1-2、fme12-13和fme14進(jìn)行pcr擴(kuò)增，采用凝膠電泳分別檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果(圖1d)表明：利用badh2基因功能標(biāo)記fmu1-2和fme12-13，所有的香稻品種和對(duì)照材料都只擴(kuò)增出一條條帶，大小分別為163bp(圖1a)和192bp(圖1e)的片段，說明這16份香稻品種在badh2基因的5’-utr區(qū)、第12和13外顯子處均不存在突變，它們都屬于這種香味基因突變類型。利用badh2基因功能標(biāo)記fme14做pcr擴(kuò)增，然后采用限制性內(nèi)切酶bslⅰ酶切檢測(cè)，結(jié)果表明所有的香稻材料和非香稻材料都能夠被bslⅰ酶切出205bp大小的條帶，說明這16份豫南香稻品種在badh2基因的第14外顯子處并不存在一個(gè)1bp的插入突變(圖1f)。
在本試驗(yàn)材料中，香寶2號(hào)、鄭香粳11、黑香稻193、農(nóng)香粳4號(hào)、香糯1862和香寶1號(hào)共6份香稻材料在已知的badh2基因變異位點(diǎn)(5’-utr區(qū)、第12、13和14外顯子)處，并沒有發(fā)現(xiàn)變異發(fā)生(圖1a、e和f)。其余的10份香稻材料分別在badh2基因的第2、4、5和7外顯子處存在突變，其中香粳805在badh2基因的第二外顯子處存在一個(gè)7bp的缺失，并且在第4和5外顯子處存在一個(gè)803bp的缺失片段，詳細(xì)的結(jié)果見表3。
表316份豫南香稻品種badh2基因功能標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果分類
4)結(jié)論：
4.1)香稻分子標(biāo)記的檢測(cè)：本發(fā)明利用上述7個(gè)badh2基因功能標(biāo)記對(duì)16份豫南香稻品種進(jìn)行了檢測(cè)分類，共有4份香稻材料在badh2基因的第2外顯子處存在變異；2份香稻材料在badh2基因的第4和5外顯子處存在803bp的缺失；有4份香稻材料在badh2基因的第7外顯子處存在8bp的缺失和3bp的突變(圖1；表3)，其余的香稻材料在badh2基因的5’-utr區(qū)、第12、13和14外顯子處并沒有發(fā)現(xiàn)變異發(fā)生(圖1)。因此，針對(duì)特定的香稻品種開展分子標(biāo)記的檢測(cè)與分析，能夠極大地提高香稻新品種的育種效率。
4.2)豫南香稻功能標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用
優(yōu)質(zhì)香稻在市場(chǎng)上深受廣大消費(fèi)者的青睞，其稻米中的香味是非常重要的食味品質(zhì)性狀。香味基因功能標(biāo)記總是與特定的稻米香氣性狀聯(lián)系在一起，那么針對(duì)豫南香稻品種資源，開展香稻badh2基因功能標(biāo)記的檢測(cè)與分析，將為優(yōu)質(zhì)香稻新品種的培育提供重要參考與借鑒。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豫南香稻品種中有10份材料在badh2基因的第2、4、5或者7外顯子處存在變異，可以利用現(xiàn)有的功能標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記選擇來加快優(yōu)質(zhì)香稻新品種的育種。而香寶2號(hào)、鄭香粳11、黑香稻193、農(nóng)香粳4號(hào)、香糯1862和香寶1號(hào)共6份香稻材料和4份非香水稻材料在這7個(gè)功能性分子標(biāo)記檢測(cè)的結(jié)果是一樣的。因此，這6份香稻材料有可能是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的badh2基因的其他突變類型，需要進(jìn)一步鑒定這些香稻材料的功能標(biāo)記；也有可能這6份香稻材料中存在尚未發(fā)現(xiàn)的badh2基因的新等位基因類型，根據(jù)這些香稻材料可以在今后進(jìn)行新基因的定位、分離、克隆和功能標(biāo)記的開發(fā)與利用。
上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
sequencelisting
<110>信陽中國(guó)師范學(xué)院
<120>一種豫南香稻品種badh2基因功能標(biāo)記的檢測(cè)及應(yīng)用
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