本發(fā)明涉及遺傳病基因檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種擴(kuò)增pkd1外顯子超長(zhǎng)片段的pcr引物、檢測(cè)pkd1基因突變的試劑盒，以及所述pcr引物和試劑盒作為成人型多囊腎病致病基因檢測(cè)試劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多囊腎病(polycystickidneydisease，pkd)是一種雙側(cè)腎臟實(shí)質(zhì)發(fā)生多個(gè)囊樣腫塊的遺傳性腎臟疾病。根據(jù)發(fā)病年齡和遺傳的特點(diǎn)，可以分為兩種類型：常染色體隱性遺傳型(嬰兒型)多囊腎；常染色體顯性遺傳型(成年型)多囊腎。成人型多囊腎較為常見，人群中的發(fā)病率為1/400-1/1000；成人型多囊腎為常染色體顯性遺傳病，其特點(diǎn)是具有家族聚集性，男女均可發(fā)病，大部分患者在30-50歲才出現(xiàn)典型癥狀，故稱“成人型”。成人型多囊腎的病理特征是雙側(cè)腎臟腫大，皮質(zhì)、髓質(zhì)出現(xiàn)多個(gè)大小不一的囊泡，且進(jìn)行性增大，引起腎臟結(jié)構(gòu)和功能損害。成人型多囊腎起病隱匿，患者早期臨床癥狀輕，甚至無癥狀，多數(shù)在無意發(fā)現(xiàn)腹部有包塊，或者體檢中發(fā)現(xiàn)。隨著年齡增長(zhǎng)囊腫逐漸增大后，腎實(shí)質(zhì)減少腎功能出現(xiàn)損害，臨床癥狀明顯。本病常累及腎外多個(gè)器官，患者常伴有多囊肝、高血壓、多囊脾臟、多囊胰腺、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤等。約50％的患者在60歲時(shí)進(jìn)入終末期腎功能衰竭。目前尚無任何有效方法可以阻止多囊腎病的發(fā)展，成人型多囊腎家系成員非常關(guān)注尚無癥狀的幼年兄弟姐妹或子女的將來患病的風(fēng)險(xiǎn)，及患病人員生育下一代的問題。目前多囊腎病的診斷主要依據(jù)是雙腎的超聲、ct等影像學(xué)檢查?；?qū)用娴拇_診對(duì)明確多囊腎病類型、早期干預(yù)及產(chǎn)前診斷預(yù)防該病發(fā)生起著更為關(guān)鍵的作用。

成人型多囊腎主要是由pkd1和pkd2基因突變致病，其中約85-90％的患者為pkd1基因突變導(dǎo)致的，約10-15％為pkd2基因突變，pkd1是成人型多囊腎的主要致病基因。pkd1基因編碼的蛋白為多囊蛋白1(pc1)，是11次跨膜大分子蛋白，主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，負(fù)責(zé)將細(xì)胞外環(huán)境信號(hào)傳遞給胞內(nèi)信號(hào)分子。pkd1基因位于染色體16p13.3區(qū)，基因體長(zhǎng)達(dá)52kb，共有46個(gè)外顯子，編碼區(qū)長(zhǎng)達(dá)12906bp。研究統(tǒng)計(jì)表明，成人型多囊腎基因缺陷以點(diǎn)突變致病為主，并且沒有明顯的突變熱點(diǎn)或者熱區(qū)，整個(gè)基因外顯子區(qū)及內(nèi)含子剪切位點(diǎn)附近均可能發(fā)生突變而致病。pkd1基因存在6個(gè)高度同源的假基因，與pkd1基因1-33外顯子序列同源性高達(dá)97.7％，普通的pcr難以避免假基因的干擾。另外，pkd1基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，部分區(qū)域gc含量超過70％，增加了pcr和sanger測(cè)序的難度。以上pkd1的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和突變特點(diǎn)，給pkd1基因檢測(cè)帶來的巨大的困難，突變檢出率較低。

根據(jù)pkd1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和突變類型，在新技術(shù)不斷革新的背景下，pkd1基因突變的檢測(cè)方法也在不斷地創(chuàng)新與優(yōu)化，先后提出的檢測(cè)方法有：lr-pcr，變性高效液相色譜(dhplc)、多重連接探針擴(kuò)增(mlpa)、lr-pcr-高通量測(cè)序(ngs)、外顯子捕獲-高通量測(cè)序(ngs)。

傳統(tǒng)的巢式pcr-sanger測(cè)序，先用若干個(gè)長(zhǎng)片段pcr分別擴(kuò)增pkd1基因的各個(gè)區(qū)域，然后針對(duì)每一個(gè)外顯子單獨(dú)pcr擴(kuò)增，再測(cè)序。雖然pcr結(jié)合sanger測(cè)序被認(rèn)為是檢測(cè)基因突變的經(jīng)典方法，但是對(duì)于由46個(gè)外顯子構(gòu)成、編碼區(qū)長(zhǎng)達(dá)12906bp的pkd1基因而言，傳統(tǒng)的巢式pcr-sanger測(cè)序技術(shù)耗費(fèi)大量人力，成本高昂，效率低下。

巢式pcr-dhplc方法，根據(jù)雙鏈dna解鏈特征的差異，可以對(duì)pkd1基因巢式pcr產(chǎn)物進(jìn)行初步篩查，快速篩查有無突變。該方法的局限性是只能提供有無突變，不能得出具體的突變類型，不能直接檢測(cè)純合突變，并且結(jié)果判讀容易出錯(cuò)。mlpa方法主要用于對(duì)pkd1基因大片段的缺失、重復(fù)或者重排，此類變異只占到pkd1異?；颊叩?-3％。

由于高度同源的假基因和富含gc含量區(qū)域的存在，常規(guī)的高通量測(cè)序(ngs)方法設(shè)計(jì)的引物panel在pkd1基因外顯子上的覆蓋度很低(＜70％)，達(dá)不到預(yù)期目的。us7553644b2、cn104531883a公開了一種檢測(cè)pkd1基因突變的檢測(cè)方法和試劑盒，先利用5-8對(duì)lr-pcr引物組，擴(kuò)增pkd1基因第2_46外顯子；然后以純化的lr-pcr產(chǎn)物為模板，通過擴(kuò)增子的方法或者酶切的方法構(gòu)建文庫(kù)。這種方法，已經(jīng)應(yīng)用到iontorrent或者illumina公司高通量測(cè)序平臺(tái)。該方法具有高通量、快速、低成本的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多樣本、多基因的同時(shí)檢測(cè)。該方法的缺點(diǎn)是：需要用到利用5-8對(duì)lr-pcr引物擴(kuò)增，其中任何一個(gè)lr-pcr擴(kuò)增失敗，均需要重新制備，并且lr-pcr產(chǎn)物需要切膠純化并精確定量；這種方法前期處理的工作量大，程序復(fù)雜。

因此，本領(lǐng)域仍然需尋求一種新的檢測(cè)pkd1基因突變的方法，提高診斷準(zhǔn)確率，簡(jiǎn)化操作流程，提高時(shí)效性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種擴(kuò)增pkd1外顯子超長(zhǎng)片段的pcr引物、檢測(cè)pkd1基因突變的試劑盒，以及所述pcr引物和試劑盒作為成人型多囊腎病致病基因檢測(cè)試劑的應(yīng)用。通過先獲得超長(zhǎng)片段lr-pcr產(chǎn)物，再以lr-pcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，尋找致病突變，明確成人型多囊腎的遺傳學(xué)病因，為臨床提供遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論依據(jù)。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增pkd1外顯子超長(zhǎng)片段的pcr引物，所述pkd1外顯子為第2至第46外顯子，該pcr引物為具有如seqidno：1和seqidno：2所示堿基序列的引物。

長(zhǎng)片段pcr(longrange-pcr，lr-pcr)是指擴(kuò)增長(zhǎng)度大于5kb的pcr，與常規(guī)的短片段pcr相比，最大的區(qū)別在于，其受dna模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物的特異性和退火溫度、以及不理想的循環(huán)條件等因素影響較大，以至于超長(zhǎng)片段pcr的擴(kuò)增難度較大。另外，pkd1基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了存在多個(gè)高度同源的假基因外，其部分區(qū)域gc含量超過75％，增加了pcr擴(kuò)增的難度。通過本發(fā)明提供的引物，可以完整擴(kuò)增得到pkd1第2至第46外顯子的超長(zhǎng)片段。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)pkd1基因突變的試劑盒，該試劑盒包括權(quán)利要求1所述的pcr引物，以及能夠分別檢測(cè)pkd1基因第2至第46外顯子的擴(kuò)增引物組合。

pkd1-e2_46_fl_forwordprimer：5′-gttcatttgggtcttccatcagaaagt-3′(seqidno：1)

pkd1_e2_46_fl_reverseprimer：5′-ggctagaaaccgtccaatactgctgt-3′(seqidno：2)

所述能夠分別檢測(cè)pkd1基因第2至第46外顯子的擴(kuò)增引物組合可以根據(jù)本發(fā)明的常規(guī)方法設(shè)計(jì)得到。優(yōu)選地，經(jīng)過本發(fā)明的發(fā)明人大量實(shí)驗(yàn)，為避免引物間相互干擾，所述能夠分別檢測(cè)pkd1基因第2至第46外顯子的擴(kuò)增引物組合包括兩個(gè)引物池，分別為引物池1和引物池2，所述引物池1包括具有seqidno：3至seqidno：108所示堿基序列的引物，所述引物池2包括具有序列表seqidno：109至seqidno：214所示堿基序列的引物。每個(gè)引物池中各引物濃度為100-1000nm。

根據(jù)本發(fā)明，為便于操作，該試劑盒還優(yōu)選包括：

用于所述擴(kuò)增引物組合進(jìn)行多重pcr反應(yīng)的試劑；和/或

用于處理多重pcr擴(kuò)增產(chǎn)物以使得多重pcr擴(kuò)增產(chǎn)物能用于高通量測(cè)序的試劑。

其中，所述用于所述擴(kuò)增引物組合進(jìn)行多重pcr反應(yīng)的試劑包括但不限于為dna聚合酶、pcr反應(yīng)緩沖液和dntps。所述dna聚合酶優(yōu)選為擴(kuò)增效率高、高保真性、延伸性能好、適用于gc含量高的dna聚合酶。

常用的高通量測(cè)序平臺(tái)是illumiahiseq/miseq和iontorrentpgm/proton測(cè)序儀。優(yōu)選的，高通量測(cè)序儀為iontorrent測(cè)序平臺(tái)。iontorrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)結(jié)合擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，與其他測(cè)序技術(shù)相比，具有通量選擇靈活、測(cè)序周期短、運(yùn)行成本低的特點(diǎn)，非常適合于單基因遺傳病的基因診斷。

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還優(yōu)選包括用于從樣品中提取基因組dna的試劑。

上述試劑可配制也可商購(gòu)獲得。配制方法或商購(gòu)?fù)緩綖楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供上述pcr引物和/或上述試劑盒作為成人型多囊腎病致病基因檢測(cè)試劑的應(yīng)用。

具體地，可通過如下方法利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)成人型多囊腎致病基因-pkd1基因突變：

(1)取受檢者樣本，如外周血、唾液、組織器官，提取基因組dna；

(2)采用高保真、高效的dna聚合酶，利用優(yōu)選的引物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)增覆蓋pkd1基因第2至第46外顯子的長(zhǎng)片段；

(3)對(duì)步驟(2)得到的長(zhǎng)片段pcr產(chǎn)物純化；

(4)利用引物池1和引物池2的dna文庫(kù)從iontorrent高通量測(cè)序平臺(tái)自動(dòng)合成覆蓋pkd1基因第2至第46外顯子的擴(kuò)增引物文庫(kù)，以上述lr-pcr產(chǎn)物為模板，在適于擴(kuò)增目的dna片段的條件下，采用多重pcr技術(shù)對(duì)45個(gè)外顯子進(jìn)行靶向擴(kuò)增；

(5)對(duì)步驟(4)得到的多重pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，消化引物序列；

(6)對(duì)步驟(5)得到的酶切產(chǎn)物加標(biāo)簽序列(barcode接頭)。優(yōu)選8個(gè)堿基的核苷酸序列，如ionxpressbarcodeadapters33-48kit。所述標(biāo)簽只是為了區(qū)別每個(gè)樣品，以便用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要以及通常的引物設(shè)計(jì)原則選擇使用不同的標(biāo)簽，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的；

(7)對(duì)步驟(6)得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；

(8)對(duì)步驟(7)得到的純化產(chǎn)物用通用引物進(jìn)行二次擴(kuò)增；優(yōu)選的，該通用引物來自于高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒；

(9)對(duì)步驟(8)得到的二次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行，進(jìn)一步純化、去除大片段dna，選擇保留文庫(kù)擴(kuò)增片段，并進(jìn)行精確的濃度測(cè)定，即完成待測(cè)樣本目標(biāo)區(qū)域文庫(kù)擴(kuò)增；

(10)對(duì)步驟(9)所得到的文庫(kù)進(jìn)行等量混合，經(jīng)過乳液pcr擴(kuò)增反應(yīng)(onetouch)后，將待測(cè)序目的片段進(jìn)一步擴(kuò)增并連接于isp珠子，得到反應(yīng)液；

(11)對(duì)步驟(10)得到的isp珠子連接的擴(kuò)增產(chǎn)物富集、純化；

(12)將步驟(11)得到的產(chǎn)物負(fù)載加入芯片，上ionpgm測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序；

(13)將步驟(12)得到的測(cè)序信息進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)處理，排除多態(tài)性變異，獲取每個(gè)樣本pkd1基因的突變；

(14)對(duì)步驟(13)得到的突變位點(diǎn)進(jìn)行pcr-sanger測(cè)序法驗(yàn)證。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)采用基于超長(zhǎng)片段pcr產(chǎn)物為模板的高通量測(cè)序技術(shù)，每個(gè)待測(cè)樣本只需要經(jīng)過一個(gè)超長(zhǎng)片段pcr反應(yīng)，pcr產(chǎn)物只需簡(jiǎn)單純化或者不經(jīng)純化即可以用于后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建。為了完成對(duì)pkd1基因高覆蓋度，現(xiàn)有技術(shù)采用的多管長(zhǎng)片段pcr方法需要在反應(yīng)之后切膠純化、精確定量，操作復(fù)雜；并且，在多管長(zhǎng)片段pcr方法中，其中任何一個(gè)lr-pcr擴(kuò)增失敗，均需要重新制備，這種方法前期處理的工作量大，程序復(fù)雜。本發(fā)明簡(jiǎn)化了操作流程，降低了成本，縮短了實(shí)驗(yàn)周期；具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)、適用于高通量的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多樣本、多個(gè)外顯子的同時(shí)檢測(cè)。

(2)設(shè)計(jì)的引物密集，擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋范圍廣，能夠在一次測(cè)序反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)pkd1基因第2至第46外顯子及毗鄰區(qū)域，覆蓋度為96.7％，針對(duì)hgmd和pkdmutationdatabase(http://pkdb.mayo.edu)已報(bào)道的致病突變的覆蓋大于95％。

(3)利用高通量測(cè)序，特別是iontorrent高通量測(cè)序平臺(tái)，讀長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)300bp，準(zhǔn)確性高(99.9％)；采用iontorrent測(cè)序平臺(tái)，能根據(jù)不同芯片數(shù)據(jù)量的大小，調(diào)整檢測(cè)樣本數(shù)量，在保證平均測(cè)序深度在200×的前提下，ion316^tm芯片檢測(cè)樣本量可以多達(dá)到100個(gè)，大大降低了擴(kuò)增反應(yīng)的成本；整個(gè)檢測(cè)流程(從提取dna、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析判讀)能夠在2.5天內(nèi)完成，提高了時(shí)效性，尤其適合于臨床診斷服務(wù)。

(4)通過對(duì)目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的測(cè)序和數(shù)據(jù)判讀，能夠準(zhǔn)確識(shí)別與疾病相關(guān)的突變，判斷疾病種類和病因，為臨床提供及時(shí)可靠的檢測(cè)報(bào)告。本發(fā)明高通量測(cè)序檢測(cè)到的點(diǎn)突變、微小缺失/重復(fù)，經(jīng)過sanger測(cè)序法驗(yàn)證；對(duì)高通量測(cè)序深度達(dá)到100×的點(diǎn)突變，本發(fā)明的準(zhǔn)確度超過99％。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行更詳細(xì)的描述。

圖1示出了引物組合的設(shè)計(jì)。以人類基因組(hg19)chr16：2089483-2119546序列為參考序列，覆蓋pkd1基因第1內(nèi)含子/第2外顯子毗鄰位置(ivs2-168)到3’-端非翻譯區(qū)(c.*1267)位置，將該段序列為customreference，針對(duì)外顯子及毗鄰區(qū)域設(shè)計(jì)多重pcr引物。引物池1和引物池2對(duì)于目標(biāo)區(qū)域的覆蓋為96.74％，缺失區(qū)域占3.26％。

圖2示出了8個(gè)樣本的超長(zhǎng)片段pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果。目的條帶大小為30064bp，電泳結(jié)果與預(yù)期一致。

圖3示出了一個(gè)樣本的iontorrentpgm測(cè)序的整體覆蓋度和深度，圖中顯示所有pkd1基因e2_46外顯子區(qū)平均覆蓋深度達(dá)到1200*，除外顯子部分區(qū)域因高gc含量不能完全檢測(cè)外，目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度完全。

圖4示出了一個(gè)樣本的iontorrentpgm測(cè)序結(jié)果中pkd1基因e2_46各外顯子區(qū)的覆蓋圖。

圖5①-⑧為8個(gè)pkd1基因突變檢測(cè)為陽性的樣本的igv視圖(上)和sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果(下)。其中，圖5①為c.6832g＞a雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5②為c.12053_12054inst雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5③為c.10540c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5④為c.9713-1g＞a雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑤為c.11537g＞c雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑥為c.3349c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑦為c.4669c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑧為c.9013c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

所用到的試劑：

kodfxneodna聚合酶，ionampliseqlibrarykit2.0，ionpgmtemplateot2200kitv3，ionpgmsequencing200kitv2，ionxpressbarcordeadaptor33-48kit，ion316chipkitv2bc。

1、提取待檢測(cè)的樣本全基因組dna；

使用omega“基因組dna抽提試劑盒”提取外周血dna，同時(shí)去除rna。提取的dna總體積約為100ul，濃度在20-200ng/μl；a260/280在1.8-2.0之間。

2、超長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增pkd1基因第2至第46外顯子；

pcr擴(kuò)增試劑選用kodfxneo(東洋紡，toyobolifescience)dna聚合酶，以基因組dna為模板最大可擴(kuò)增40kb的片段，具有高擴(kuò)增效率、高保真性的特點(diǎn)，并且適用于高gc含量片段的擴(kuò)增。

擴(kuò)增程序：

pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由圖2可見，檢測(cè)擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段大小一致。

3、超長(zhǎng)片段pcr產(chǎn)物的純化

pcr產(chǎn)物使用xp試劑1.2×樣本體積純化，70％乙醇洗滌2次。dna片段被吸附在ampure磁珠上。

4、以長(zhǎng)片段pcr產(chǎn)物為模板，經(jīng)多重pcr擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域

取純化的長(zhǎng)片段pcr產(chǎn)物，稀釋500倍作為使用液，用兩個(gè)引物組(引物池1和引物池2)同時(shí)擴(kuò)增。每個(gè)引物池中引物的濃度為400nm。

擴(kuò)增程序：

5、消化引物序列

pcr擴(kuò)增結(jié)束，離心，將每個(gè)樣本的引物池1和引物池2兩管反應(yīng)液合并為一管，然后加入2μlfupareagent，總體系達(dá)到22μl，渦旋混勻。

反應(yīng)條件：50℃，10min；55℃，15min，60℃，20min；4℃保持

6、barcode連接至擴(kuò)增產(chǎn)物并純化

反應(yīng)條件：22℃，30min；72℃，15min；4℃保持

產(chǎn)物使用xp試劑1.5×樣本體積(45μl)純化，70％乙醇洗滌2次。dna片段被吸附在ampure磁珠上。

7、文庫(kù)擴(kuò)增、純化和測(cè)定

擴(kuò)增程序：

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物需經(jīng)過兩次純化，分別去除基因組dna和pcr反應(yīng)中的各類離子、引物、酶。純化步驟按照ionampliseqlibrarypreparation操作手冊(cè)進(jìn)行。純化產(chǎn)物，經(jīng)qubit2.0fluorometer定量，即制備成片段大小200bp左右的文庫(kù)。大于0.1ng/μl的文庫(kù)可以進(jìn)入后續(xù)乳液pcr反應(yīng)。

8、乳液pcr反應(yīng)(采用ionpgmtemplateot2200kitv3)：

將構(gòu)建好的文庫(kù)，按照分子量和濃度等比例混合，配制成2pg/μl的文庫(kù)混合液，上述反應(yīng)體系加入onetouch2中進(jìn)行乳液pcr反應(yīng)，制備template-positiveot2200ionsphereparticles。

9、高通量測(cè)序(采用ionsequencing200kitv2)：

乳液pcr反應(yīng)完成后，連接有測(cè)序模板的ionsphereparticles，經(jīng)過onetouches富集、純化。加入測(cè)序引物，退火處理，模板與引物結(jié)合，然后加入dna聚合酶，室溫孵育5min后，將反應(yīng)液載入iontorrent316v2芯片，轉(zhuǎn)移至ionpgm測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

結(jié)果分析

torrentsuite對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)提取、清除接頭序列、濾過質(zhì)量差的讀常；結(jié)果與人類基因組參考序列hg19進(jìn)行序列比對(duì)、及snvs和indel提取，測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過coverageanalysis和variantcaller分析，得到堿基序列和突變位點(diǎn)信息(vcf文件和bam、bai文件)；經(jīng)過ionreporter在線軟件注釋后，得到pkd1基因突變信息。針對(duì)得到的突變位點(diǎn)，采用pcr-sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。圖3和圖4顯示一個(gè)樣本的iontorrentpgm測(cè)序的覆蓋度和深度，圖中顯示所有pkd1基因e2_46外顯子區(qū)平均覆蓋深度達(dá)到1200*，除極少部分區(qū)域因高gc含量不能完全覆蓋外，其余所有外顯子的覆蓋率為100％。圖5①-⑧為8個(gè)pkd1基因突變檢測(cè)為陽性的樣本的igv視圖(上)和sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果(下)。圖5①為c.6832g＞a雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5②為c.12053_12054inst雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5③為c.10540c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5④為c.9713-1g＞a雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑤為c.11537g＞c雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑥為c.3349c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑦為c.4669c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果；圖5⑧為c.9013c＞t雜合突變的igv視圖和驗(yàn)證結(jié)果。高通量測(cè)序篩出的pkd1基因突變結(jié)果與sanger測(cè)序的結(jié)果是一致的，說明本發(fā)明的方法是可行的。

受屏幕分辨率和附圖尺寸所限，圖1、圖5①-圖5⑧中部分字體顯示不清，但并不影響本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案和技術(shù)效果的理解。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實(shí)施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實(shí)施例。在不偏離所說明的各實(shí)施例的范圍和精神的情況下，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。

sequencelisting

<110>鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

<120>擴(kuò)增pkd1外顯子超長(zhǎng)片段的pcr引物、檢測(cè)pkd1基因突變的試劑盒及應(yīng)用

<130>1700032

<160>214

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gttcatttgggtcttccatcagaaagt27

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggctagaaaccgtccaatactgctgt26

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggatggcctctggcctacta20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gattcggcaaagctgatggaag22

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gggctggcatagaccctt18

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cctggctgggaaggacaga19

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cctgacaacagctcaggca19

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggaagacgtgctggagga18

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cagctagcagccttccacat20

<210>10

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcgaggctctcgtcactct19

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gcccacactgaccgttga18

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gcgggactgtccaccattg19

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gctgtgagggtgggaggat19

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

gctcgcagacgtagctgtg19

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

ccagtctgttcgtcctggt19

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ttggcgagacccacagtg18

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

cccaccaggtcatggtattcc21

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gcagacgtgaaagctcagaga21

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

ctggagccaacatctgcttg20

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ctgaggagatgcagggaacaga22

<210>21

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

acggccaggatgtcctca18

<210>22

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

tccagggttgggcctcaag19

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

cacaacctctcctgcagctt20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

ggcagtgctaccactgagaa20

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

cgtgtactgcagggagtccta21

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

tgactttccaggaatttaaagccca25

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

ggtggaccatcaacgacaag20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ctcgggcagcatgaagcaga20

<210>29

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

ccgtgaactacaacgtaaccgt22

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

ttacctcccaacagacagggaaac24

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

ctcagtgctgctacacctgt20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

gctgcgtcaggttctcgaag20

<210>33

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

ggtgttctttacacgtgggactt23

<210>34

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>34

gaaggtccacgtgatgttgtc21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

caacagtggagcatgtgtacct22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

aggtccagtcgaagaggtagtg22

<210>37

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>37

gcgcattacttcaccagcatct22

<210>38

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>38

cattggcagcagagatgttgttg23

<210>39

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>39

gaggtcacccacgcttacaa20

<210>40

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>40

cggaaggtgtaagagatggtagga24

<210>41

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

caggccgtggttagggat18

<210>42

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

gctgcccagcatgttggt18

<210>43

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>43

ggtgtcgtatacacttggtcctt23

<210>44

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>44

cacctgcacatccacttcca20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

ccctcatgtcaccatggtcttc22

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>46

cagcaggatctgaaaatggacca23

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

cccgtttctcccacagctt19

<210>48

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

agtcgccctggaccttct18

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

gctggtgctggaggttca18

<210>50

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>50

ctgggctcatctgtgtcct19

<210>51

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

ctccaacctggtgagcttct20

<210>52

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>52

cggtactcagtctggtaggtga22

<210>53

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

cgcctggtgcccatcatt18

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

gggtgttctctgggctcat19

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

ttggaaggtggcaaaccggat21

<210>56

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

gccctccaagtacacgtagga21

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>57

gcacgtacgttcagcaacaa20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>58

gtgcattcgaagtgcacctt20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>59

cgaggagttctgtgtctacaagg23

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

gtgatggccaaagacctacga21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

gcacgtcatcgagtactcgttg22

<210>62

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>62

gggtcactgggatttatctctgg23

<210>63

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

gcaagaacatcacggagactct22

<210>64

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>64

ctgcgttcacacaggacagaac22

<210>65

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

ccatcggagacagcatcct19

<210>66

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

ggagaaaagggatggtaatagggaag26

<210>67

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>67

gtcccaggcctacaacct18

<210>68

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

gattggagtccaccagaaagatga24

<210>69

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>69

caactacaccgtctccaccaa21

<210>70

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>70

cgtatagttgagctgcagatgca23

<210>71

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<212>dna

<213>人工序列

<400>71

gggtgtctctggtgaaatttgc22

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>72

gctccgagtgtaggtagactg21

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<212>dna

<213>人工序列

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gggcatcatgggtcagcatt20

<210>74

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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gtcctcctcgctgaagtactg21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>75

ctatcctgagaaggcacagctt22

<210>76

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>76

gacgaggatctcgtacttgaagc23

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>77

cacaggccaaagctgagatg20

<210>78

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>78

cgcacaaacctttgttgtcgt21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>79

cgccttcttcctggtcaatgac22

<210>80

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>80

agatgtgcttgtcaaagaagcca23

<210>81

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>81

acatctggctctccatatggga22

<210>82

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>82

ggctcagcctggacacatg19

<210>83

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>83

gtgtccagcgtggttgtcta20

<210>84

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>84

tgctcaagtgtgttgaccctt21

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>85

cgcagcttggactcaagaca20

<210>86

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>86

ctgggcttccgagcaaacct20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>87

cgtccattgtgggtagcaatct22

<210>88

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>88

cctgctggatcaggtcttcatc22

<210>89

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

gcccaggttaacatgggctt20

<210>90

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>90

gaagcagagacagacctgtga21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>91

ccagcttcctggcctcattc20

<210>92

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

ctaccagggtgtcatcttcatcc23

<210>93

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<212>dna

<213>人工序列

<400>93

ccaaagccctgctgtcact19

<210>94

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<212>dna

<213>人工序列

<400>94

gtctggctggactaaaggca20

<210>95

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>95

caggaaacactcctgttgggtt22

<210>96

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>96

cactcctggagaactactccctt23

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<212>dna

<213>人工序列

<400>97

cttcctgcagctgcacaa18

<210>98

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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agagggtgcgggtcagta18

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<212>dna

<213>人工序列

<400>99

cctctgctcacctcggt17

<210>100

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>100

agcaggcacacctgtgg17

<210>101

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<212>dna

<213>人工序列

<400>101

ccagtggacccgtttcgt18

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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acgagaaatctgtctgcttgca22

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>103

ggccatcctggtaggtgact20

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>104

ctcggcaggacacagggtaga21

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>105

ccttgcgtggagagctgta19

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<212>dna

<213>人工序列

<400>106

gcggctccatcccttcaa18

<210>107

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>107

gccctgctcacccagttt18

<210>108

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>108

atgggccacgggaagatc18

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>109

cttccatcagctttgccgaa20

<210>110

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>110

ggagggcagaagggatattgg21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>111

actgggcagggctcaggaa19

<210>112

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>112

gtgggcagctgaaaaggacac21

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<212>dna

<213>人工序列

<400>113

ccacgaaggcctgcttca18

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<212>dna

<213>人工序列

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ctagctggccagaggccaga20

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<213>人工序列

<400>115

gacagacgtgcaggtggaa19

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<211>19

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<213>人工序列

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gggtgtcaacggtcagtgt19

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<213>人工序列

<400>117

ccctcggacacggagatctt20

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<212>dna

<213>人工序列

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gcttcagagatctcccaacctatg24

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<212>dna

<213>人工序列

<400>119

gtggtgtaacaccgacctgt20

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>120

tggcgagtgcacagtgag18

<210>121

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>121

gacagtttccaccggagtctt21

<210>122

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>122

gctcctgggtcccaaattcg20

<210>123

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>123

gagacctgtcctcacagcaa20

<210>124

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>124

ccctgacgtgcagccatt18

<210>125

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>125

gctccttcctgtctgcca18

<210>126

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>126

ctgcaagccaacgaggtc18

<210>127

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>127

ttgcagccacggaacagctc20

<210>128

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>128

ttggtgggcacgtagagg18

<210>129

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>129

ccctgggagaccaacgata19

<210>130

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>130

tggagcctcggccatact18

<210>131

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>131

gtccaggaggcgacaggctaa21

<210>132

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>132

acattgaagaccacgttctggaag24

<210>133

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>133

caccttcacctctgccttct20

<210>134

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>134

gcagaccctgcatcctgttc20

<210>135

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>135

cctgtcccggttcactca18

<210>136

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>136

ctcagagcctgaaaggcagt20

<210>137

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>137

ctgaccgtgctggcatctaa20

<210>138

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>138

ctcgaggcataggtgtggtt20

<210>139

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>139

gcgcctggaggtcaacaa18

<210>140

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>140

ccacggtcactgtgcagt18

<210>141

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>141

ggcccactacctcttcga18

<210>142

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>142

cccgagctgcacaaactg18

<210>143

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>143

ccaggctcctatcttgtgaca21

<210>144

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>144

ccaccctaacggtgaagtca20

<210>145

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>145

ctattcctgggtgctctgtga21

<210>146

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>146

ggcagtccagctgtaggaga20

<210>147

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>147

cggcacctaccatgtgca18

<210>148

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>148

gaagctatgggtggtaaatggct23

<210>149

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>149

cctgcacttggtcaccatga20

<210>150

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>150

gggaagaccatggtgacatgag22

<210>151

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>151

gggtctcagccacgtacaac20

<210>152

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>152

ccagctcacgtggtttttgc20

<210>153

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>153

tcgcctacgcctggtact18

<210>154

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>154

ctctgcagggccacatact19

<210>155

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>155

ggcctaccactgggactttg20

<210>156

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>156

tccaagtagttgcgctgtgat21

<210>157

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>157

tgctttgtgtttgtcgtgtcattt24

<210>158

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>158

gtctgaccacacgcggtat19

<210>159

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>159

cgggctctgctttaaaactgg21

<210>160

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>160

ctgggctgtccaaggcaa18

<210>161

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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ttggagtgtgtgtcctgcaa20

<210>162

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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gtcttgttgctgaacgtacgt21

<210>163

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>163

cggcgagggatacacctt18

<210>164

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>164

ctccgtgacgtcacagagt19

<210>165

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>165

ctgtggtcgccctcaaca18

<210>166

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>166

gctgcactcacctcgttca19

<210>167

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>167

gcccatgaagaaacagctcagt22

<210>168

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>168

gctggatgtcatccacagtgt21

<210>169

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>169

aggtgaggacccgtgtaga19

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>170

gcggcacctgtgatgttg18

<210>171

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>171

tccctctacctccctgtctct21

<210>172

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>172

gcatgaggatgcgcatga18

<210>173

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>173

cctggccaacctcagtga18

<210>174

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>174

cggcctgtgtctggaatg18

<210>175

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>175

gtcaccctggacagcagcaa20

<210>176

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>176

atggaagccctacgagaaacg21

<210>177

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>177

actacctgtctgaggaacctga22

<210>178

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>178

ggcaatgctgacccatgatg20

<210>179

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>179

tctgaacctctccagccactt21

<210>180

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>180

gtcactcacaggaaacacaaagc23

<210>181

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>181

cctggtgacctacatggtcatg22

<210>182

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>182

tgcaaaaactgccttgttctgac23

<210>183

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>183

ctgggtagcgtgtggaagat20

<210>184

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>184

gccagtcattgaccaggaagaag23

<210>185

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>185

cgagtaaggcctcgttccat20

<210>186

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>186

ggatgcgagtgaaacggcta20

<210>187

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>187

cctgctgcgttctcctcatc20

<210>188

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>188

gagaaaaaggatggccaggtaga23

<210>189

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>189

ctgaggaggtggcttctcat20

<210>190

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>190

tgcacagtgtcttgagtccaag22

<210>191

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>191

gggctgtgtgtgtgacacat20

<210>192

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>192

tgatgctgagaaggatttggca22

<210>193

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>193

ccctatgcctcctgtacctcta22

<210>194

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>194

agaggttcagagaagtgaagtggt24

<210>195

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>195

tgcctctcacaggtctgtct20

<210>196

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>196

tgatggaggcctgtagccta20

<210>197

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>197

ggaagccctgtacttctcactg22

<210>198

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>198

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>199

gctggagcgtgtgactgatg20

<210>200

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>200

caacaagaggaacgatttaagtcttgg27

<210>201

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<212>dna

<213>人工序列

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gcgtctacgccaaggacaa19

<210>202

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>202

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>203

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<210>204

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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gcgtaccgaggtgagca17

<210>205

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>205

ccacaggtgtgcctgct17

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>206

tcgaagctagtgaagcggc19

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>209

cagctcgtgtcttcctgtgt20

<210>210

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>210

aactccaccatctcgtagtcct22

<210>211

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>211

ccagttccgccacaaagtc19

<210>212

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>212

cctctgtggcctggttga18

<210>213

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>213

ctggagcagcagctgcaca19

<210>214

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>214

ggtgtccactccgactcca19