本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種手足口病臨床樣品中腸道病毒71型的檢測方法。

背景技術(shù)：

手足口病(hand-foot-mouthdisease,hfmd)是由多種人類腸道病毒引起的常見傳染病,以五歲以下嬰幼兒發(fā)病為主,以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征,多數(shù)患者癥狀輕微預(yù)后良好,少數(shù)患者可并發(fā)呼吸道感染、肺水腫、心肌炎和無菌性腦膜炎等,病情進展快,易發(fā)生死亡。hfmd的流行已成為中國和東南亞國家的重大公共衛(wèi)生問題之一。

目前已經(jīng)明確引起手足口病的病原體有二十多種,主要為小rna病毒科腸道病毒屬的柯薩奇病毒a組16、4、5、7、9、10型,b組2、5、13型、?？刹《?echoviruses)以及人腸道病毒71型（enterovirus71，ev-a71）,其中以ev-a71和柯薩奇a組16型（coxsackievirusa16，cv-a16）最為常見。多種腸道病毒的共同感染和/或混合感染普遍存在，而多種腸道病毒的共感染和/或混合感染又會加重疾病和/或延長病程。

在臨床實踐中，當手足口病已經(jīng)被鑒定為某種腸道病毒感染后，想要鑒定是否還同時存在ev-a71的感染，通常的做法是還需要用ev-a71的特異引物進行rt-pcr，然后巢式或半巢式pcr，1%瓊脂糖電泳以確定其片段大小而鑒定為ev-a71感染。這需要進行兩次rt-pcr，增加了費用和時間，尤其是對于大規(guī)模流行病調(diào)查，花費的成本是巨大的，因此，探索簡單易行的在ev-a71檢測方法非常必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上所述缺陷，提供一種檢測速度快、準確率高、減少費用的腸道病毒71型的檢測方法。

為了解決以上所述技術(shù)問題，本發(fā)明所述手足口病混合感染中腸道病毒71型的檢測方法，所述方法包括以下步驟：

（1）提取病毒rna，根據(jù)腸道病毒vp1的特點設(shè)計腸道病毒a組通用引物entaf（5’tncargcwgcngaracngg3’）entaro（5’anggrttngtngmwgtytgcca3’）進行rt-pcr擴增，然后用引物entaf和entari（5’ggnggnacrwacatrtaytg3’）進行半巢式pcr擴增，測序并進行ncbiblast比對，如果該核苷酸序列與genbank數(shù)據(jù)庫中腸道病毒參考株核苷酸序列同源性大于75%，即認為是同一血清型，檢測出手足口病患者感染的腸道病毒種類（即認為該病毒感染）；

（2）經(jīng)過所述步驟（1）的鑒定，如果未檢測出腸道病毒71型，根據(jù)腸道病毒a組通用引物和ev-a71序列設(shè)計特異ev-a71上游引物ev71afo（5’aggggttagtggcggtttgcca3’）和下游引物ev71ari（5’ggtggcacaaacatatattg3’），以所述步驟（1）中rt-pcr產(chǎn)物為模板進行巢式pcr擴增，取擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，即可鑒定。

本發(fā)明的有益效果：相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明省略一步rt-pcr法，就可完成該樣品的ev-a71鑒定，一個樣品可節(jié)約成本近30元人民幣，時間也從原來4小時縮短到1.5小時，而且只需一次rt-pcr即可完成，因此該方法能夠快速、簡便、而且大幅度降低成本，為大規(guī)模的腸道病毒混合感染中ev-a71分子流行病學監(jiān)測提供了保障。

附圖說明

圖1為所述實施例的腸道病毒1%瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為所述實施例的ev-a711%瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3為所述實施例所測一個樣本的ev-a71序列；

圖4為ev-a71部分vp1基因擴增示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

本發(fā)明所述手足口病混合感染中腸道病毒71型的檢測方法，所述方法包括以下步驟：

（1）提取病毒rna，根據(jù)腸道病毒vp1的特點設(shè)計腸道病毒a組通用引物entaf（5’tncargcwgcngaracngg3’）entaro（5’anggrttngtngmwgtytgcca3’）進行rt-pcr擴增，然后用引物entaf和entari（5’ggnggnacrwacatrtaytg3’）進行半巢式pcr擴增，測序并進行ncbiblast比對，如果該核苷酸序列與genbank數(shù)據(jù)庫中腸道病毒參考株核苷酸序列同源性大于75%，即認為是同一血清型，檢測出手足口病患者感染的腸道病毒種類（即認為該病毒感染）；

（2）經(jīng)過所述步驟（1）的鑒定，如果未檢測出腸道病毒71型，根據(jù)腸道病毒a組通用引物和ev-a71序列設(shè)計特異ev-a71上游引物ev71ar0（5’tccaagctgctgaaattgg3’）和下游引物ev71ari（5’ggtggcacaaacatatattg3’），以所述步驟（1）中rt-pcr產(chǎn)物為模板進行巢式pcr擴增，取擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，即可鑒定。

本發(fā)明所述方法，從臨床病人的糞便中提取病毒rna，用腸道病毒a組通用引物entaf－entaro先進行rt－pcr，然后以其產(chǎn)物為模板進行entaf和entari半巢式pcr，通過測序并在ncbiblast（美國國家生物技術(shù)信息中心的一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或dna數(shù)據(jù)庫中進行相似性比較的分析工具，blast程序能迅速與公開數(shù)據(jù)庫進行相似性序列比較，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)比對，確定為不是ev-a71感染，再用所設(shè)計引物做巢式pcr即可。舉例如下：

實施例：

1、樣品處理

取1克糞便標本，加入5mlpbs充分振蕩混勻，3000r/min離心30min，取上清液，保存于-80℃；

2、病毒rna提取

病毒rna的提取按試劑盒（qiampviralrnaminikit）說明書操作，具體如下：取560avl加入1.5ml離心管，再加入140μl上清液，顛倒混合15sec，室溫放置10min；加入560μl無水乙醇，顛倒混合15sec；將上述溶液630μl加入qiamp吸附柱中，8000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，加入500μlaw1，8000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；加入500μlaw2，14000rpm離心3min，倒掉收集管中的廢液；將吸附柱放入空收集管中，14000rpm離心1min；將吸附柱放入一個干凈的離心管中，加ave洗脫緩沖液，室溫放置1min，8000rpm離心1min；-20℃貯存；

3、擴增與測序

rt-pcr根據(jù)superonesteprt-pcrkit操作說明，具體如下：2хreactionbuffer25μl，rt-pcrmix1μl，entaf20pmol，entaro20pmol，rna10μl加水至50μl，混勻離心后50℃逆轉(zhuǎn)錄40min，按94℃5min,94℃0.5min,52℃0.5min,72℃1min,30個循環(huán)；72℃延伸10min,此為第一步；然后再取rt-pcr產(chǎn)物10μl，用2хtaqpcrmastermix25μl，以entaf和entari引物按以上第一步的條件（即94℃5min,94℃0.5min,52℃0.5min,72℃1min,30個循環(huán)；72℃延伸10min）擴增，取擴增產(chǎn)物5μl1%瓊脂糖凝膠電泳（所得到的電泳圖見附圖1）。有相應(yīng)大小的特異片段（約328bp）用abi3730xl高自動化測序儀測序(基于sanger雙脫氧終止法)。

以上測序結(jié)果均通過用ncbiblast比對后，確定為何種腸道病毒。

4.非ev-a71的樣品再次pcr

隨機抽取13個通過以上步驟未檢測出ev-a71感染的樣品，用步驟3中第一步得到的rt-pcr產(chǎn)物10μl，用2хtaqpcrmastermix25μl，以ev71af0和ev71ari引物，按以上步驟3中第一步的條件（即94℃5min,94℃0.5min,52℃0.5min,72℃1min,30個循環(huán)；72℃延伸10min）擴增；取擴增產(chǎn)物2μl1%瓊脂糖凝膠電泳（所得到的電泳圖見附圖2）。

從電泳圖（附圖2）上可看到，凡是感染了ev-a71的樣本均有約289bp大小特異片段顯示，再將該片段用abi3730xl高自動化測序儀測序（基于sanger雙脫氧終止法），序列通過ncbiblast比對，所用陽性樣品的序列（見附圖3，以一個樣品的序列為例）與ev-a71同源大于75%，均為ev-a71感染。這說明通過特異引物擴增的片段，測序結(jié)果與電泳圖是相吻合的，在以后的工作中，只需通過1%瓊脂糖凝膠電泳，不需要再測序，即可判斷為ev-a71感染，這大大簡化了工作步驟，程序簡易，縮短時間，減少費用，對大規(guī)模流行病的調(diào)查意義重大。