本發(fā)明涉及基因表觀遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后的基因甲基化面板，以及利用該基因甲基化面板診斷肝癌、預(yù)測(cè)療效和復(fù)發(fā)情況，以及預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)的方法。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一。由于肝癌起病隱匿，早期沒(méi)有癥狀，且多數(shù)患者缺乏普查意識(shí)，往往出現(xiàn)癥狀才到醫(yī)院就診而被診斷為晚期肝癌，而晚期肝癌治療效果很不理想，平均生存期一般只有3-6個(gè)月。對(duì)于肝癌患者而言，如果早期發(fā)現(xiàn)和診斷肝癌，就更有可能接受根治性治療(手術(shù)、消融等)，其治療效果和預(yù)后均明顯優(yōu)于晚期肝癌。因此，肝癌的早期診斷意義非常重大。

正常生理?xiàng)l件下，人體血循環(huán)中存在由凋亡和壞死的細(xì)胞釋放的游離dna(cellfreedna，cfdna)，腫瘤患者的血循環(huán)中還可檢測(cè)到游離循環(huán)腫瘤dna(circulatingtumordna,ctdna)，由于ctdna攜帶有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學(xué)改變，并且能全面的反映患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的遺傳信息和演變進(jìn)程，可以作為理想的腫瘤標(biāo)志物，用于腫瘤的診斷、分子分型、療效評(píng)價(jià)和追蹤以及預(yù)后評(píng)估。

腫瘤細(xì)胞中的遺傳學(xué)異常表現(xiàn)多樣且存在明顯的個(gè)體性，包括突變(mutation)，拷貝數(shù)變異(copy-numbervariation)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability)，雜合性缺失(lossofheterozygosity)等。這些異常不僅在不同腫瘤之間差異很大，即使在同一腫瘤的不同患者之間也具有高度的個(gè)體異質(zhì)性(individualheterogeneity)，使得在ctdna中檢測(cè)這些改變和結(jié)果分析異常復(fù)雜。與此相比，在多種腫瘤的ctdna中可檢測(cè)到相似的甲基化改變，而同一類型腫瘤ctdna的甲基化譜則更為穩(wěn)定和一致。隨著甲基化特異性pcr、二代測(cè)序(next-generationsequencing，ngs)等技術(shù)的飛速發(fā)展，使得高通量、準(zhǔn)確、相對(duì)廉價(jià)的dna甲基化譜檢測(cè)成為可能，也促使ctdna甲基化譜的檢測(cè)日益成為目前液體活檢技術(shù)的熱點(diǎn)之一，可以準(zhǔn)確篩查早期或超早期癌癥，有助于癌癥的早期診斷、早期評(píng)估、早期預(yù)防、早期治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后的基因甲基化面板，以及利用該面板診斷肝癌、預(yù)測(cè)療效和復(fù)發(fā)情況，以及預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)的方法

第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后的基因甲基化面板，所述基因甲基化面板包括第一組甲基化基因和第二組甲基化基因，所述第一組甲基化基因包括bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20，所述第二組甲基化基因包括sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2和tmem8b。

進(jìn)一步地，所述基因甲基化面板測(cè)定肝癌患者血漿中的bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20的甲基化水平改變，以診斷肝癌和預(yù)測(cè)肝癌的治療療效、預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)。

進(jìn)一步地，所述基因甲基化面板測(cè)定肝癌患者血漿中的sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2和tmem8b的甲基化水平改變，以預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)。

第二個(gè)方面，本發(fā)明提供一種上述用于預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的基因甲基化面板的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

第一步，在血漿中提取ctdna；

第二步，對(duì)提取的所述ctdna進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，使所述ctdna中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，得到亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna；

第三步，用深度測(cè)序的方法測(cè)定所述亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna的甲基化水平的改變；

第四步，探針的設(shè)計(jì)和合成；

第五步，通過(guò)所述探針對(duì)所述亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna進(jìn)行捕獲擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序；

第六步，數(shù)據(jù)的分析和模型的建立。

在本發(fā)明的檢測(cè)方法的第一步中，血漿可以是正常人的血漿或者肝癌患者的血漿。ctdna(circulatingtumordna)是指循環(huán)腫瘤dna。

在本發(fā)明中，深度測(cè)序也稱高通量測(cè)序技術(shù)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的一種測(cè)序技術(shù)。

進(jìn)一步地，第四步所述探針的設(shè)計(jì)和合成采取以下步驟；

首先，對(duì)tcga和gse數(shù)據(jù)庫(kù)里的肝癌組織樣本和正常人血漿樣本的450k基因甲基化芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出甲基化水平明顯差異的基因；

然后，在同一患者的肝癌組織和血漿樣本中用深度測(cè)序的方法測(cè)定上一步篩選出的所述基因的甲基化水平的改變，進(jìn)一步篩選出同時(shí)能在患者肝癌組織和血漿中檢測(cè)出來(lái)且甲基化水平變化一致的基因；其中，“測(cè)定上一步篩選出的所述基因的甲基化水平的改變”是指對(duì)450k基因甲基化芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的步驟中所篩選出的甲基化水平明顯差異的基因，對(duì)這些基因的甲基化水平的改變進(jìn)行測(cè)定。

針對(duì)篩選出來(lái)的甲基化水平變化一致的基因設(shè)計(jì)探針并合成。

在本發(fā)明中，采用常規(guī)探針設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)探針，例如采用ppdesigner軟件設(shè)計(jì)上述同時(shí)能在同一患者的肝癌組織和血漿里檢測(cè)出來(lái)且甲基化水平變化一致的基因探針。探針的合成方法采用現(xiàn)有成熟技術(shù)即可，例如可應(yīng)用核酸雜交技術(shù)，用單獨(dú)的寡核苷酸進(jìn)行探針合成。

在本發(fā)明中，可以通過(guò)本領(lǐng)域常用方法使用探針捕獲亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna，經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行相應(yīng)測(cè)序?；蛘?，采用以下步驟進(jìn)行捕獲擴(kuò)增后并測(cè)序：

首先，將所述亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna與第四步中合成的所述探針混合于反應(yīng)緩沖液中形成反應(yīng)液，在所述反應(yīng)液上加礦物油；

然后，對(duì)所述反應(yīng)液進(jìn)行退火和變性，pcr擴(kuò)增并給每個(gè)血漿樣本附上條碼，pcr反應(yīng)建立文庫(kù)，并保留有效的捕獲，去除空白的捕獲；

用illumina公司的適配引物和濃度以pcr方法純化所建文庫(kù)，采用illumina公司的miseq和hiseq2500系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果。

在本發(fā)明中，所述反應(yīng)緩沖液采用本領(lǐng)域中在進(jìn)行dna捕獲時(shí)的常用反應(yīng)緩沖液即可。

優(yōu)選地，所述亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna與所述探針按照1:20000的摩爾比混合；在本發(fā)明中，在所述反應(yīng)液上加礦物油的目的是防止反應(yīng)液蒸發(fā)。

進(jìn)一步地，在所述用于預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的基因甲基化面板的檢測(cè)方法中，還包括在第五步后進(jìn)行優(yōu)化捕獲：對(duì)所述測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相對(duì)效率計(jì)算，混合探針時(shí)根據(jù)采用調(diào)節(jié)后的摩爾比率進(jìn)行混合。

在本發(fā)明中，由于在第五步中，測(cè)序的原始捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(即測(cè)序結(jié)果)在高效率的探針和低效率的探針中讀取的結(jié)果有顯著差異，為了改善這種情況，故需進(jìn)行優(yōu)化捕獲，使測(cè)序的覆蓋更加均勻、測(cè)序結(jié)果更加合理。

進(jìn)一步地，第六步中，所述數(shù)據(jù)的分析和模型的建立采取以下步驟：

首先，通過(guò)將肝癌血漿樣本和正常對(duì)照的血漿樣本隨機(jī)按2:1的比例分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，選用lasso和隨機(jī)森林的方法對(duì)第五步中的所述基因的甲基化測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選，兩種方法重疊的基因有10個(gè)，分別為bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2，chr8:20；

然后，通過(guò)邏輯回歸方法，采用這10個(gè)重疊的甲基化基因作為協(xié)變量建立診斷預(yù)測(cè)模型，計(jì)算聯(lián)合診斷指數(shù)，并在所述驗(yàn)證集中進(jìn)行驗(yàn)證；

同樣，將肝癌血漿樣本分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，先通過(guò)對(duì)每一個(gè)基因作為協(xié)變量建立一個(gè)單變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，篩選出與患者預(yù)后相關(guān)(p<0.05)的基因進(jìn)行下一步分析；

接著，采用lasso-cox多因素回歸分析，最終篩選出8個(gè)甲基化基因進(jìn)行預(yù)后的分析，分別為sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2，tmem8b；

最后，通過(guò)擬合多變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，在訓(xùn)練集確定這8個(gè)甲基化基因中每一個(gè)基因的系數(shù)，計(jì)算合并后的預(yù)后評(píng)分指數(shù)，并在驗(yàn)證集中進(jìn)行驗(yàn)證。

在本發(fā)明中，聯(lián)合診斷指數(shù)(combineddiagnosisscore)定義為cd-score。預(yù)后評(píng)分指數(shù)(combinedprognosticscore)定義為cp-score。

進(jìn)一步地，在所述lasso方法中，采用二次抽樣方法不重復(fù)抽樣75％的數(shù)據(jù)集500次，選擇出現(xiàn)頻率超過(guò)450次的甲基化基因共30個(gè)。

進(jìn)一步地，在所述隨機(jī)森林方法中，使用oob誤差最小化準(zhǔn)則，通過(guò)設(shè)置變量每次重復(fù)的分?jǐn)?shù)下降0.3的原則進(jìn)行隨機(jī)變量的消除，最后篩選出24個(gè)甲基化基因。在本發(fā)明中oob是指out-of-bag，泛化誤差估計(jì)的方法。

第三個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)測(cè)肝癌的復(fù)發(fā)的方法，包括以下步驟：

提供一種如上述的基因甲基化面板，包括第一組甲基化基因，所述第一組甲基化基因包括bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20；

以第一組甲基化基因構(gòu)建診斷預(yù)測(cè)模型；

提供肝癌血漿樣本，根據(jù)所述診斷預(yù)測(cè)模型計(jì)算出肝癌血漿樣本的聯(lián)合診斷指數(shù)，以預(yù)測(cè)肝癌的復(fù)發(fā)情況。

第四個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后的方法，包括以下步驟：

提供一種如上述的基因甲基化面板，包括第二組甲基化基因，所述第二組甲基化基因包括sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2和tmem8b；

以第二組甲基化基因構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型；提供肝癌血漿樣本，根據(jù)所述預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算出肝癌血漿樣本的預(yù)后評(píng)分指數(shù)，以預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后情況。

本發(fā)明的技術(shù)效果：本發(fā)明提供一種用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后的基因甲基化面板，同時(shí)提供了利用該基因甲基化面板診斷，預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的方法，可用于早期診斷原發(fā)性肝癌，并可預(yù)測(cè)肝癌患者的治療效果、復(fù)發(fā)和預(yù)后，該基因甲基化面板共包含18個(gè)基因，通過(guò)檢測(cè)患者血漿中bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2，chr8:20共10個(gè)基因甲基化水平的改變，可以用于診斷肝癌和預(yù)測(cè)肝癌的治療療效，通過(guò)檢測(cè)患者血漿中sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2，tmem8b共8個(gè)基因甲基化水平的改變，可以用于預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)，提高了通過(guò)肝癌患者血液診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1至圖3是本發(fā)明用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效復(fù)發(fā)和預(yù)后的基因甲基化面板的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明實(shí)施例的術(shù)語(yǔ)“包括”和“具有”以及它們的任何變形，意圖在于覆蓋不排他的包含，例如，包含了一系列步驟或單元的過(guò)程、方法、系統(tǒng)、產(chǎn)品或設(shè)備不必限于清楚地列出的那些步驟或單元，而是可包括沒(méi)有清楚地列出的或?qū)τ谶@些過(guò)程、方法、產(chǎn)品或設(shè)備固有的其它步驟或單元。

本實(shí)施例公開(kāi)了一種用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后的基因甲基化面板，該基因甲基化面板包括第一組甲基化基因和第二組甲基化基因，第一組甲基化基因包括bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20，第二組甲基化基因包括sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2和tmem8b。該基因甲基化面板測(cè)定肝癌患者血漿中的bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20的甲基化水平改變，用于診斷肝癌和預(yù)測(cè)肝癌的治療療效、預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)。該基因甲基化面板測(cè)定肝癌患者血漿中的sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2和tmem8b的甲基化水平改變，用于預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)施例還公開(kāi)了上述用于預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的基因甲基化面板的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

第一步，在血漿中提取ctdna；

第二步，對(duì)提取的所述ctdna進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，使所述ctdna中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，得到亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna；

第三步，用深度測(cè)序的方法測(cè)定所述亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna的甲基化水平的改變；

第四步，探針的設(shè)計(jì)和合成；具體是：首先，對(duì)tcga和gse數(shù)據(jù)庫(kù)里的肝癌組織樣本和正常人血漿樣本的450k基因甲基化芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出甲基化水平明顯差異的基因；然后，在同一病人的組織和血漿樣本中用深度測(cè)序的方法測(cè)定上一步篩選出的基因的甲基化水平的改變，并篩選出同時(shí)能在組織和血漿里檢測(cè)出來(lái)且甲基化水平變化一致的基因；用ppdesigner軟件設(shè)計(jì)篩選出來(lái)的甲基化水平變化一致的基因的探針，并進(jìn)行合成，例如應(yīng)用核酸雜交技術(shù)，用單獨(dú)的寡核苷酸進(jìn)行探針合成。

第五步，通過(guò)所述探針對(duì)所述亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化ctdna進(jìn)行捕獲；具體是：將10ng亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化dna與上述合成的探針按1:20000摩爾比混合于20ul反應(yīng)緩沖液中形成反應(yīng)液，反應(yīng)液上加50ul礦物油以防止液體蒸發(fā)。對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行退火和變性，pcr擴(kuò)增并給每個(gè)血漿樣本附上條碼。pcr反應(yīng)建立文庫(kù)，并保留有效的捕獲，去除空白的捕獲。用illumina公司的適配引物和濃度以pcr方法純化所建文庫(kù)，采用illumina公司的miseq和hiseq2500系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果。

接著，由于測(cè)序的原始捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(即測(cè)序結(jié)果)在高效率的探針和低效率的探針中讀取的結(jié)果有的顯著差異，為了改善這種情況，對(duì)原始的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相對(duì)效率計(jì)算，混合探針時(shí)根據(jù)采用調(diào)節(jié)后的摩爾比率進(jìn)行混合。

第六步，數(shù)據(jù)的分析和模型的建立。具體是：將肝癌血漿樣本和正常對(duì)照的血漿樣本隨機(jī)按2:1的比例分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，選用lasso和隨機(jī)森林的方法針對(duì)第五步中的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行基因篩選；

在lasso方法中，采用二次抽樣方法不重復(fù)抽樣75％的數(shù)據(jù)集500次，選擇出現(xiàn)頻率超過(guò)450次的甲基化基因共30個(gè)；

在隨機(jī)森林的方法中，使用oob誤差最小化準(zhǔn)則，通過(guò)設(shè)置變量每次重復(fù)的分?jǐn)?shù)下降0.3的原則進(jìn)行隨機(jī)變量的消除，最后篩選出24個(gè)甲基化基因；

上述兩種方法重疊的甲基化基因有10個(gè)(如表1所示)，分別是bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20。

然后，采用這10個(gè)重疊的甲基化基因作為協(xié)變量建立一個(gè)邏輯回歸模型模型，并獲得一個(gè)聯(lián)合診斷指數(shù)(cd-score)，并在驗(yàn)證集中進(jìn)行驗(yàn)證；

同樣，將肝癌血漿樣本分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，為方便計(jì)算分析：先通過(guò)對(duì)每一個(gè)基因作為協(xié)變量建立一個(gè)單變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，篩選出與患者預(yù)后相關(guān)(p<0.05)的基因進(jìn)行下一步分析；

接著，采用lasso-cox多因素回歸分析，最終篩選出8個(gè)甲基化基因進(jìn)行預(yù)后的分析(如表2所示)，分別為sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2，tmem8b；

最后，通過(guò)擬合多變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，在訓(xùn)練集確定這8個(gè)甲基化基因中每一個(gè)基因的系數(shù)，計(jì)算合并后的預(yù)后評(píng)分指數(shù)(cp-score)，并在驗(yàn)證集中進(jìn)行驗(yàn)證(如表3所示)。

應(yīng)用例1：

通過(guò)邏輯回歸方法，用基因甲基化面板(包括10個(gè)甲基化基因：bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2和chr8:20)構(gòu)建了一個(gè)診斷預(yù)測(cè)模型。應(yīng)用該模型診斷肝癌，在訓(xùn)練集中的敏感性94.3％，特異性85.7，驗(yàn)證集中的敏感性為90.5％，特異性83.2％)。這個(gè)模型可以非常好的區(qū)分肝癌與正常對(duì)照組在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集(auc＝0.966)和驗(yàn)證數(shù)據(jù)集(auc＝0.944)(圖1)。證實(shí)這10個(gè)基因甲基化面板可以用于區(qū)分肝癌和正常對(duì)照。

應(yīng)用例2：

采用上述建立的診斷預(yù)測(cè)模型，計(jì)算出每個(gè)樣本的聯(lián)合診斷指數(shù)(cd-score)，采用這個(gè)聯(lián)合診斷指數(shù)，可以很好的預(yù)測(cè)肝癌患者的治療療效和腫瘤復(fù)發(fā)(如圖2所示)。有腫瘤負(fù)荷的患者的cd-scores值明顯高于腫瘤已切除的患者和正常對(duì)照組(p<0.0001，圖2a)。同樣，治療前患者cd-scores明顯高于治療后有效的患者，而治療無(wú)效腫瘤進(jìn)展的患者cd-scores會(huì)進(jìn)一步升高(p<0.0001，圖2b)。此外，手術(shù)后病人的cd-scores較手術(shù)前明顯降低，患者術(shù)后出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，cd-scores則會(huì)再度升高(p<0.0001，圖2c)。此外，cd-scores的值與腫瘤分期相關(guān)。早期患者(i，ii期)的cd-scores明顯高于正常對(duì)照組，而明顯低于晚期(iii，iv期)患者(p<0.05，圖2d)。說(shuō)明根據(jù)這10個(gè)基因甲基化水平建立的模型可用于肝癌的早期診斷、治療療效的判斷、預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)。

應(yīng)用例3：

通過(guò)擬合多變量cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，用基因甲基化面板(包括8個(gè)甲基化基因：h3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2和tmem8b)構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，并計(jì)算出每個(gè)樣本的預(yù)后評(píng)分指數(shù)(指定為cp-score)。選取-0.24為cut-off值，將肝癌患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。無(wú)論在訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集，低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存均明顯優(yōu)于高風(fēng)險(xiǎn)組(如圖3所示)。多元變量分析表明，cp-score與死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，并且cp-score的生存是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素(如表3所示)。分期也是肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而聯(lián)合cp-score和分期，可進(jìn)一步的改進(jìn)對(duì)肝癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力(如圖3所示)。

表1:10個(gè)用于診斷早期肝癌的基因

表2：8個(gè)用于預(yù)測(cè)預(yù)后的基因

表3：肝癌患者多變量生存分析

基于上述技術(shù)方案，本發(fā)明所述的基因甲基化面板及檢測(cè)方法，可有效的用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后。該甲基化面板共包含18個(gè)基因，通過(guò)檢測(cè)患者血漿中bmpr1a，psd4，arhgap25，klf3，plac8，atxn1，chr6:170，chr6:3，atad2，chr8:20共10個(gè)基因甲基化水平的改變，可以用于診斷肝癌和預(yù)測(cè)肝癌的治療療效，通過(guò)檢測(cè)患者血漿中sh3pxd2a，c11orf9，ppfia1，chr17:78，serpinb5，notch3，grhl2，tmem8b共8個(gè)基因的甲基化水平改變，可以用于預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)，并且通過(guò)檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。從而提高了通過(guò)肝癌患者血液診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)的一種用于診斷、預(yù)測(cè)肝癌療效和預(yù)后的基因甲基化面板及檢測(cè)方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。