本發(fā)明隸屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及魚類性別特異分子標(biāo)記、及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在脊椎動(dòng)物中，魚類進(jìn)化出了最多樣化的性別決定機(jī)制。在一些魚類中，性別是由遺傳因素決定的，即它們?cè)诜趸臅r(shí)候就有了確定的性別；但是另一些魚類的性別卻很大程度受環(huán)境的影響，如溫度、ph、鹽度等外界環(huán)境條件；魚類最終的性別是遺傳、環(huán)境及二者互作的結(jié)果(devlinetal.sexdeterminationandsexdifferentiationinfish:anoverviewofgenetic,physiological,andenvironmentalinfluences.aquacμlture,2002,208(3):191-364.)。遺傳因素性別決定的魚類主要被分為兩種類型，即xx/xy型和zw/zz型。第一種類型的魚雄性含有性別決定區(qū)域或性染色體，而第二種類型的魚，性別決定區(qū)域或性染色則位于雌性魚的基因組中。確定一個(gè)物種的性別決定機(jī)制，通常通過以下三種方法：a.從細(xì)胞遺傳學(xué)的核型分析中尋找性別染色體；b.在實(shí)驗(yàn)室中培育性反轉(zhuǎn)個(gè)體；c.發(fā)掘性別特異的分子標(biāo)記(gambleetal.identificationofsex‐specificmolecμlarmarkersusingrestrictionsite‐associateddnasequencing[j].molecμlarecologyresources,2014,14(5):902-913.)。前兩種方法在魚類性別鑒定中都有較大難度，例如大多數(shù)魚類還沒有形成像哺乳類動(dòng)物那樣的可以從視覺上區(qū)別的性別染色體；而且很多魚類由于繁殖周期和養(yǎng)殖條件等原因在實(shí)驗(yàn)室條件下較難培育性反轉(zhuǎn)群體，這就使得開發(fā)性別特異分子標(biāo)記成為最有前途的研究魚類性別機(jī)制的方法。

鳙(hypophthalmichthysnobilis)是我國(guó)四大家魚之一，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。據(jù)世界糧農(nóng)組織(fao)2015年統(tǒng)計(jì)，鳙全世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到340萬噸，2015年國(guó)內(nèi)鳙的產(chǎn)量已經(jīng)上升到336萬噸，占全世界總養(yǎng)殖產(chǎn)量的98.72％，鳙產(chǎn)量位列我國(guó)淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的第三位。隨著我國(guó)居民生活水平的提高，對(duì)魚肉等優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的需求越來越大，這將進(jìn)一步刺激國(guó)內(nèi)鳙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。鳙的性成熟年齡在我國(guó)中部和南方約需4-5年，北方至少需6年以上。由于鳙性成熟錢從外觀上無法鑒別其性別，性成熟個(gè)體也只有在繁殖季節(jié)通過其所產(chǎn)配子類型才可準(zhǔn)確鑒定其性別，這給鳙的生產(chǎn)和繁殖造成了極大不便。為了在性成熟前提前鑒定鳙的性別，亟需開發(fā)鳙性別特異分子標(biāo)記。

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(restrictionsiteassociateddnasequencing,rad-seq)是最近幾年發(fā)展起來的將酶切和高通量測(cè)序相結(jié)合的一種技術(shù)。它可以通過不同的內(nèi)切酶，在基因組中酶切產(chǎn)生特異切口片斷，將這些片斷富集之后作為模板，構(gòu)建高通量測(cè)序文庫，然后借助高通量測(cè)序，獲得大量酶切片斷的序列。這種方法既可以獲得基因組中大量特定片斷，又降低了測(cè)序成本，已經(jīng)成為一種通用而高效的遺傳分型方法(daveyetal.genome-widegeneticmarkerdiscoveryandgenotypingusingnext-generationsequencing.natrevgenet.2011.12,7499-510)。雖然該方法已成功運(yùn)用在多種動(dòng)物和植物的性別遺傳標(biāo)記開發(fā)中，但它還是存在一些明顯的缺點(diǎn)，例如它鑒定出來的通常為性別相關(guān)snp標(biāo)記，存在遺傳分型方法比較復(fù)雜等不足(carmichaeletal.identificationofasex-linkedsnpmarkerinthesalmonlouse(lepeophtheirussalmonis)usingradsequencing.plosone.2013.8,10,e77832)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中不易鑒定鳙幼魚性別的缺陷，本發(fā)明提供一種鳙性別特異分子標(biāo)記的篩選方法，并應(yīng)用該方法鑒定到一條雄鳙特異長(zhǎng)序列，基于該長(zhǎng)序列開發(fā)出一種簡(jiǎn)便、快速、可靠鑒定鳙的性別的方法，為批量鑒定鳙性別奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明的第一方面提供一種鳙性別特異分子標(biāo)記的篩選方法，包括如下步驟：

(1)雄鳙特異短序列的鑒定

利用本實(shí)驗(yàn)室已有的已知性別的5雌5雄鳙為樣品，取尾鰭提取基因組dna，按照2b-rad方法進(jìn)行測(cè)序文庫構(gòu)建，測(cè)序文庫檢驗(yàn)合格之后上機(jī)進(jìn)行測(cè)序；對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾之后，使用stacksv1.31進(jìn)行性別特異序列鑒定，得到一個(gè)序列在5尾雄鳙中均出現(xiàn)，但是在5尾雌鳙中均沒出現(xiàn)，此序列即雄鳙特異短序列，其核酸序列為seqidno:1；

(2)雄鳙基因組測(cè)序

步驟(1)中鑒定到的短序列僅有32bp，無法進(jìn)行普通pcr引物設(shè)計(jì)，因此需要更長(zhǎng)的基因組序列。于是對(duì)5尾雄鳙中的一尾進(jìn)行高通量全基因組測(cè)序，然后使用soapdenovov1.2.0軟件進(jìn)行從頭組裝，獲得雄鳙全基因組序列；

(3)將(1)中獲得的雄鳙特異短序列在(2)中獲得的雄鳙全基因組序列中進(jìn)行blast比對(duì)搜索，獲得一條922bp的長(zhǎng)序列，此序列的核酸序列為seqidno:2。

本發(fā)明的第二方面，提供一種鳙性別特異分子標(biāo)記，其核苷酸序列如seqidno:2所示。

本發(fā)明的第三方面，提供一種鳙性別特異分子標(biāo)記seqidno:2在鳙性別鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面，提供一種快速檢測(cè)鳙性別差異的引物，以seqidno:2為模板進(jìn)行pcr引物設(shè)計(jì)，獲得一對(duì)能夠分辨鳙性別的引物，引物名稱為ars-9-1f和ars-9-1r，引物序列如seqidno:3和seqidno:4所示。

本發(fā)明的第五方面，提供一種用所述鳙性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，包括如下步驟：

(1)采集待測(cè)鳙的基因組dna；

(2)用所述鳙性別特異分子標(biāo)記的引物對(duì)鳙基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增得到366bp的條帶所對(duì)應(yīng)的為雄性個(gè)體，沒有擴(kuò)增條帶所對(duì)應(yīng)的為雌性個(gè)體。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中的pcr反應(yīng)的體系為：dna模板1μl(50ng/μl)，上下游引物5μmars-9-1f和ars-9-1r混合物0.4μl，2.5mmdntp0.4μl，10xbuffer1.25μl，5u/μltaq酶0.075μl，補(bǔ)充水至12.5μl。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中的pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

(1)本發(fā)明所提供的遺傳性別鑒定方法能夠以基因組dna為模板，僅僅通過簡(jiǎn)單的pcr和電泳結(jié)果就能夠進(jìn)行性別的鑒定。該方法不受個(gè)體發(fā)育時(shí)期、環(huán)境的影響，從而克服其他方法操作較繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，尤其適合于對(duì)大樣本進(jìn)行快速鑒定。

(2)本發(fā)明成本低、操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，并適合于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為利用已知性別鳙對(duì)引物ars-9-1進(jìn)行準(zhǔn)確性驗(yàn)證，

圖2為利用引物ars-9-1對(duì)雌核發(fā)育鳙子代進(jìn)行性別鑒定，

圖中所示雌核發(fā)育鳙子代均為雌性，驗(yàn)證了鳙性別決定機(jī)制為xx/xy型。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實(shí)施例1】雄鳙特異短序列的鑒定

本實(shí)施例主要包含以下步驟，即酶切、連接、擴(kuò)增、回收和分析。

酶切：

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的且已知性別的5雌5雄鳙進(jìn)行2b-rad建庫，具體過程如下(以下為每個(gè)個(gè)體使用量)：

混勻之后37.0℃下酶切反應(yīng)4小時(shí),然后65℃保溫20分鐘使酶滅活。

連接：

測(cè)序接頭連接。將上面的酶切產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)的illumina測(cè)序接頭(slx-ad1和slx-ad2)分別進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系(27.0μl)：

混勻離心后置于16℃下連接反應(yīng)過夜(8h)。

擴(kuò)增：

pcr反應(yīng)體系包含兩對(duì)pcr引物(slx-1st-primer1&slx-1st-primer2,slx-2nd-primer&slx-barcodeprimer),其中in-rad-barcodeprimer為帶有特異性barcode的引物，使每個(gè)個(gè)體構(gòu)建文庫的barcode不同，用來后續(xù)數(shù)據(jù)分析區(qū)分個(gè)體。pcr反應(yīng)體系如下：

每個(gè)樣品按如上體系平行擴(kuò)增2管?；靹螂x心后置于pcr儀中，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性30s，擴(kuò)增16個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)98℃變性20s，63℃退火50s，72℃延伸40s，最后在72℃下終延伸5min，4℃保存。

回收：

合并擴(kuò)增產(chǎn)物通過8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)切膠回收片段大小約170bp的文庫產(chǎn)物。使用omegapoly-geldnaextractionkit(d2561-02)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作流程參照試劑盒說明書，最終用30μl超純水洗脫。使用熒光定量pcr對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行定量，然后根據(jù)測(cè)序量需求進(jìn)行混樣測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為illuminahiseq2500se50(illμmina,usa)。建庫過程所使用的接頭及引物序列詳見表1。

表12b-rad測(cè)序文庫構(gòu)建接頭及引物序列

分析：

對(duì)10尾親本進(jìn)行2b-rad測(cè)序，一共得到30.9mreads的原始數(shù)據(jù)和過濾后的26.7m高質(zhì)量reads。從5個(gè)母本中測(cè)得16.1m條高質(zhì)量reads，從5個(gè)父本測(cè)得10.6m條高質(zhì)量reads。對(duì)測(cè)序下機(jī)產(chǎn)生的fastq格式序列進(jìn)行過濾之后，使用stacksv1.31軟件進(jìn)行位點(diǎn)重建和性別特異位點(diǎn)的鑒定。最后獲得一個(gè)雄鳙特異的短序列，此序列在5尾雄鳙中均存在，但是在5尾雌鳙中都不存在。其核酸序列為seqidno:1。

【實(shí)施例2】雄鳙全基因組測(cè)序及雄鳙特異短序列的延長(zhǎng)

a)從5尾雄鳙中選擇一尾進(jìn)行小片段文庫構(gòu)建并用于illumina全基因組測(cè)序。測(cè)序獲得48.2mpe150bp的illumina原始序列，然后使用soapdenovov1.20進(jìn)行全基因組組裝；

b)將實(shí)施例1中鑒定到的雄鳙特異短序列在全基因組中進(jìn)行blast比對(duì)搜索，獲得一條長(zhǎng)911bp的長(zhǎng)序列，其核酸序列為seqidno:2。

【實(shí)施例3】基于雄鳙特異長(zhǎng)序列的性別引物設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

a)依據(jù)seqidno:2設(shè)計(jì)一對(duì)性別引物，其序列為：

ars-9-1f:gctccttactcagcaact

ars-9-1r:tcagtaaacagacgagca

b)從本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的已知性別的鳙群體中選擇30尾，包括15尾雄性和15為雌性，對(duì)其基因組dna樣品進(jìn)行pcr驗(yàn)證，pcr反應(yīng)程序如下：

pcr加樣信息

pcr程序設(shè)置

所述的電泳分析，其方法是：將變性好的擴(kuò)增產(chǎn)物用10％的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；電泳條件：電壓230v，時(shí)間2小時(shí)；然后對(duì)電泳產(chǎn)物通過溴化乙錠(eb)染色對(duì)dna條帶進(jìn)行觀察、照相和分析。結(jié)果如圖1所示，雄魚可擴(kuò)增出特異的366bp大小的核苷酸片段，雌魚則無此擴(kuò)增產(chǎn)物。共驗(yàn)證30尾，其中雌性15尾，雄性15尾。

b)使用本實(shí)驗(yàn)室繁殖的30尾鳙雌核發(fā)育群體進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證條件如本實(shí)施例步驟a所示，結(jié)果如圖2。共驗(yàn)證30尾雌核發(fā)育個(gè)體，全為雌性。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所

<120>一種鳙性別特異分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>鳙

<400>1

agtaaacagacgagcaaactgcagcaaaagaa32

<210>2

<211>911

<212>dna

<213>鳙

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aactcaatctcgtgaactatctcgtcacacccctgtgtcagtaatcaatatctctgttat60

tcgtgttaatgaactaacctctgagctgctgttctaggctcagaatgatggcagtggcct120

ggtgcaggatttccagtttggtctggggtttgtcactcttcaggtgttgttgacatatgc180

atctaagctcttcaaaggcatcattcatggcacaatcatgctccttactcagcaactcct240

cctcttcctcctcaccataaacgctgctgctgcaaaagtgtttacaccttcaatgctcat300

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ggtaagatcatttagtctcattactttaatgaagatgattgtgttttgatcgtctaagac540

ttacttttggtttcttttgctgcagtttgctcgtctgtttactgaggagatgctcagctg600

ctcatatgcgctgatgcgcactgtcatatttgggtaattctacagaaatgtccacttttg660

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tttttttcacaacatgtatgcttattatgatgcacaaatctcaattttaacaatgaaaag900

taatacagaca911

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

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