本發(fā)明屬于地黃常見栽培品種的鑒別方法技術領域，具體涉及一種地黃分子標記指紋圖譜的構建及其常見栽培品種的鑒別方法。

背景技術：

地黃(rehmanniaglutinosa)是玄參科地黃屬多年生草本植物，包括天目地黃、裂葉地黃、高地黃、湖北地黃、茄葉地黃和地黃6個種，分布于中國、日本和韓國等國家。在我國，地黃主要分布于河南、山西、遼寧、山東、陜西和安徽等地。地黃根作為藥材和食材，具有重要的經(jīng)濟價值。因此，地黃備受人們青睞，廣為研究。

目標起始密碼子多態(tài)性分子標記(startcodontargetedpolymorphism，scot)是一種基于單引物擴增反應的新型目的基因分子標記，是根據(jù)植物基因atg起始密碼子側(cè)翼保守區(qū)域設計單引物，對基因組中atg兩側(cè)的區(qū)域進行擴增，產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)顯性多態(tài)性標記，具有能獲得與性狀聯(lián)系緊密的目的基因、能對性狀進行跟蹤、操作簡單、重復性好﹑多態(tài)性豐富與引物通用性好等優(yōu)點，已被廣泛應用于硬粒小麥遺傳多樣性分析、中間偃麥草與普通小麥種的系統(tǒng)關系、突尼斯柑橘種的鑒定、君遷子分類、指紋圖譜構建、間接器官發(fā)生途徑再生火索麻植株的遺傳純合率、基因差異表達和分子遺傳連鎖圖譜構建等方面。但是，scot標記在地黃上未見報道。

另外，由于地黃長期營養(yǎng)繁殖和區(qū)間的引種交流，多數(shù)品種經(jīng)過長年栽種后品種退化，質(zhì)量和產(chǎn)量嚴重下降，外部形態(tài)參差不齊。然而，現(xiàn)在對地黃的研究主要包括育種、化學調(diào)控和病蟲害防治等方面，從分子角度探討地黃遺傳多樣性和親緣關系的研究相對較少。所以，本發(fā)明研究以地黃為材料，構建與優(yōu)化地黃scot-pcr體系，并篩選合適引物，對30份種質(zhì)進行了scot指紋圖譜的構建，為地黃遺傳多樣性分析和品種鑒定等研究奠定基礎，也為地黃常見的7個栽培品種紅薯王、抗育831、北京3號、北京2號、金狀元、金九和溫85-5的區(qū)分提供方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術問題是提供了一種鑒定操作簡單、重復性好且分辨率高的地黃分子標記指紋圖譜的構建及其常見栽培品種的鑒別方法。

本發(fā)明為解決上述技術問題采用如下技術方案，地黃分子標記指紋圖譜的構建及其常見栽培品種的鑒別方法，其特征在于具體步驟為：

(1)新鮮地黃樣品的收集和預處理，試驗用地黃種質(zhì)收集于河南4個市縣、山東2個區(qū)縣和上海華東師范大學，包括裂葉地黃和地黃這2個種，共30份種質(zhì)，均經(jīng)過its測序與ncbi比對，確定為裂葉地黃或地黃種質(zhì)，取其葉片保存于-70℃冰箱備用，為dna的提取備用；

(2)新鮮地黃樣品基因組dna的提取與純化，取新鮮地黃葉片，根據(jù)改良的ctba提取葉片dna，并用1wt％瓊脂糖凝膠電泳檢測dna完整性，再用紫外分光光度計測定其濃度和純度，將樣品按所需濃度稀釋后置于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)scot-pcr擴增，利用所提取的dna為模板，在mjresearchptc.200型擴增儀上進行scot-pcr擴增，pcr擴增體系特征為：總體積為25μl，含有8μlddh2o、1μl濃度為80ng·μl^-1的模板dna、1μl濃度為8μmol·l^-1的引物和15μlmix，退火溫度為45℃，擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，36個循環(huán)，4℃保存，所用的scot-pcr擴增引物為下列6條單引物：

scot4accatggctaccaccgcg，

scot5acgacatggcgaccgcga，

scot11caacaatggctaccacgt，

scot15acgacatggcgaccatcg，

scot27ccatggctaccaccgcct，

scot29acgacatggcgaccaacg；

(4)瓊脂糖凝膠電泳，擴增結束后，吸取擴增產(chǎn)物8-10μl進行1wt％瓊脂糖凝膠電泳，電極緩沖液為1×tae，在geldoctmez凝膠成像儀拍照；

(5)構建各供試樣品的scot分子標記指紋圖譜，根據(jù)6條引物scot4、scot5、scot11、scot15、scot27和scot29的擴增結果，對電泳圖譜上清晰且可辨認的條帶記為1，無條帶記為0，缺失記為9，模糊不清的不予記錄，建立30份地黃種質(zhì)的scot指紋圖譜數(shù)字化表格；

(6)利用構建的scot分子標記指紋圖譜進行7種地黃常見栽培品種的鑒別，利用引物scot4擴增出的特異性條帶將北京2號、金狀元和金九區(qū)分出來，利用引物scot27擴增出的特異性條帶將紅薯王和抗育831區(qū)分出來，利用引物scot15擴增出的特異性條帶將紅薯王和金狀元區(qū)分出來，利用引物scot5擴增出的特異性條帶將北京3號鑒別出來，利用引物scot11擴增出的特異性條帶將溫85-5鑒別出來，利用引物scot27擴增出的特異性條帶將金九鑒別出來。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明采用scot分子標記技術構建地黃分子標記指紋圖譜，對在幼苗期的地黃葉片材料就可以鑒定，保證了材料基源的準確性和穩(wěn)定性，通過對30份地黃種質(zhì)的dna提取與純化、scot-pcr的擴增、瓊脂糖凝膠電泳就能得到準確可靠的鑒別圖譜，省時省力且成本低廉；

2、本發(fā)明通過正交試驗對pcr擴增的反應體系和擴增程序進行了優(yōu)化，使得結果更加穩(wěn)定可靠；

3、本發(fā)明構建地黃分子指紋標記指紋圖譜，可根據(jù)種質(zhì)資源的添加不斷更新，以滿足發(fā)展的需要；

4、本發(fā)明提供的地黃分子標記指紋圖譜構建及其常見栽培品種的鑒定方法，除了可以應用于地黃的種質(zhì)鑒定之外，也可以應用于其它物種的種質(zhì)鑒定；

5、利用本發(fā)明提供的瓊脂糖凝膠電泳圖示，也可采用bandscan軟件進行指紋圖譜的構建，實現(xiàn)地黃種質(zhì)鑒定的自動化；

6、本發(fā)明所篩選出的引物，擴增產(chǎn)物多態(tài)性豐富、條帶清晰，可用于種間鑒別和種內(nèi)居群間的鑒定。

附圖說明

圖1是引物scot4對地黃2個種共30份種質(zhì)的scot-pcr擴增結果電泳圖；

圖2是引物scot5對地黃2個種共30份種質(zhì)的scot-pcr擴增結果電泳圖；

圖3是引物scot11對地黃2個種共30份種質(zhì)的scot-pcr擴增結果電泳圖；

圖4是引物scot15對地黃2個種共30份種質(zhì)的scot-pcr擴增結果電泳圖；

圖5是引物scot27對地黃2個種共30份種質(zhì)的scot-pcr擴增結果電泳圖；

圖6是引物scot29對地黃2個種共30份種質(zhì)的scot-pcr擴增結果電泳圖。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例

試驗用地黃種質(zhì)收集于河南4個市縣、山東2個區(qū)縣和上海華東師范大學，包括裂葉地黃和地黃這2個種，共30份種質(zhì)，均經(jīng)過its測序與ncbi比對，確定為裂葉地黃或地黃種質(zhì)，提取基因組dna，用篩選的引物進行scot分子標記分析，以凝膠電泳呈現(xiàn)的條帶建立30份種質(zhì)的scot-pcr分子標記指紋圖譜，將所構建的分子標記指紋圖譜用于地黃常見7個栽培品種的鑒定。

表130份種質(zhì)地黃的名稱及采集地

具體操作步驟如下：

1、dna的提取與檢測

取新鮮地黃葉片，根據(jù)改良的ctba提取葉片dna，并用1wt％瓊脂糖凝膠電泳檢測dna完整性，再用紫外分光光度計測定其濃度和純度，將樣品按所需濃度稀釋后置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2、基礎scot-pcr體系的建立與目標引物的篩選

根據(jù)文獻初步建立基礎的地黃的scot-pcr反應體系，以溫85-5、金九、金狀元、紅薯王等地黃常見栽培種質(zhì)的dna模板，對設計的32條引物進行初次的篩選。scot-pcr反應體系為20μl，包含8μlddh2o、1μl模板dna(80ng·μl^-1)、1μl引物(8μmol·l^-1)和10μlmix。擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，36個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。采用1wt％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr擴增產(chǎn)物，拍照分析。初次獲得擴增產(chǎn)物清晰、重復性好且多態(tài)性條帶相對較高的14條引物，并正式用于pcr擴增。

3、scot-pcr的正交實驗設計

溫85-5為地黃最常見的栽培品種。選取溫85-5品種dna為模板，以篩選的scot15為引物，針對模板dna濃度、引物濃度,ddh2o體積、pcr反應體系中mix的用量和退火溫度5種因素設置5個不同水平，采用l25(5⁶)正交試驗設計對基礎scot-pcr進行體系優(yōu)化，2次重復。pcr擴增反應在梯度pcr儀tgradient上進行，擴增程序為：94℃預變性4min；94℃變性1min，退火溫度的設定依據(jù)正交表1min，72℃延伸2min，36個循環(huán)；4℃保存。擴增結束后，吸取擴增產(chǎn)物8-10μl進行1wt％瓊脂糖凝膠電泳，電極緩沖液為1×tae，在geldoctmez凝膠成像儀拍照9+。8號和9號處理組合擴增譜帶清晰、易于辨認，呈現(xiàn)多態(tài)性。綜合各個條帶的直觀分析，最終確定地黃scot-pcr的最佳反應體系為：ddh2o8μl、模板dna用量80ng·μl^-11μl、引物8μmol·l^-11μl和mix15μl，退火溫度45℃，總體積25μl。

表2scot-pcr的正交實驗設計參數(shù)

4、退火溫度優(yōu)化

退火溫度是影響pcr特異性的重要因素。根據(jù)正交試驗篩選出的最有體系設計單因素實驗，對退火溫度再次進行梯度優(yōu)化。試驗設置了5個溫度梯度：45.0℃、47.0℃、51.3℃、53.3℃、55.0℃。除退火溫度不同外，反應程序與篩選出的正交試驗體系相同。以條帶擴增清晰、呈現(xiàn)多態(tài)性為依據(jù)，確定本試驗的最佳退火溫度為45.0℃。

5、正交試驗最優(yōu)體系的驗證

用篩選的14條引物和優(yōu)化后的正交體系，對30份地黃種質(zhì)dna模板進行擴增，用1wt％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，驗證該體系的穩(wěn)定性、通用性和重復性，同時對14條引物進行第二次篩選。對所得的scot譜帶保存并進行數(shù)據(jù)分析。除scot21和scot25外，所用引物均能在供試材料中擴增出條帶清晰、亮度適中、多態(tài)性高的條帶。如scot4、scot5、scot11、scot15、scot27和scot29在30份地黃材料中的擴增譜帶清晰、易于辨認，呈現(xiàn)多態(tài)性。由此說明建立和優(yōu)化的scot分子標記反應體系適用于地黃基因組dna的遺傳多樣性等后續(xù)研究。

6、指紋圖譜構建

根據(jù)6條引物scot4、scot5、scot11、scot15、scot27和scot29的擴增結果，數(shù)據(jù)用人工讀帶的方法，根據(jù)scot-pcr擴增產(chǎn)物在凝膠電泳上的相對位置，依據(jù)分子量從大到小的順序讀帶，對電泳圖譜上清晰且可辨認的條帶記為1，無條帶記為0，缺失記為9，模糊不清的不予記錄，建立30份地黃種質(zhì)的scot指紋圖譜數(shù)字化表格。

表36條引物構建30份地黃材料的指紋圖譜

8、地黃常見栽培品種的鑒別

利用此6條scot多態(tài)性引物可有效區(qū)分地黃7個常用栽培品種(紅薯王、抗育831、北京3號、北京2號、金狀元、金九和溫85-5)。利用引物scot4擴增出的特異性條帶將北京2號、金狀元和金九區(qū)分出來，利用引物scot27擴增出的特異性條帶將紅薯王和抗育831區(qū)分出來，利用引物scot15擴增出的特異性條帶將紅薯王和金狀元區(qū)分出來，利用引物scot5擴增出的特異性條帶將北京3號鑒別出來，利用引物scot11擴增出的特異性條帶將溫85-5鑒別出來，利用引物scot27擴增出的特異性條帶將金九鑒別出來

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理，主要特征和優(yōu)點，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍。

sequencelisting

<110>河南師范大學

<120>地黃分子標記指紋圖譜的構建及其常見栽培品種的鑒別方法

<130>2017

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<170>patentinversion3.3

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