本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種用于檢測阿司匹林和硝酸甘油精準用藥的方法及專用引物。
背景技術(shù)：
：精準用藥是精準醫(yī)療的重要組成部分。遺傳藥理學(xué)和藥物基因組學(xué)研究已經(jīng)證實，不同患者攜帶的基因(如藥物轉(zhuǎn)運蛋白基因、藥物代謝酶基因、dna修復(fù)基因)單核苷酸多態(tài)性不同，對藥物的反應(yīng)不同，同一藥物對不同患者的療效作用也有很大的差異，因此，從藥物療效的角度出發(fā)，進行基因檢測指導(dǎo)精準用藥，幫助醫(yī)生篩選出有效的治療方案，對病人做出最正確的治療決策，既節(jié)省了患者無效的醫(yī)療費用，而且提高了治療效果。阿司匹林是臨床上常用的預(yù)防和治療動脈血栓性疾病類的基礎(chǔ)藥物，硝酸甘油是臨床上常用的心腦血管急救藥物。然而，在臨床上，存在阿司匹林抵抗現(xiàn)象，即阿司匹林并非對所有的血栓患者都有效果，部分患者即使服用阿司匹林也不能抑制血小板聚集和預(yù)防血栓形成，從而達不到臨床治療效果。硝酸甘油使用無效現(xiàn)象在臨床上也非常常見，即人們在需要急救的危急時刻，即使?fàn)幏謯Z秒服用的硝酸甘油，也不能挽救生命。阿司匹林抵抗現(xiàn)象、硝酸甘油使用無效現(xiàn)象與基因多態(tài)性密切相關(guān)。傳統(tǒng)的檢測方法主要采用sanger測序，熒光定量pcr等方法。以上方法雖然也可能在臨床上提供較好的價值，但是存在費時、經(jīng)濟成本高、時間成本高等原因，未能在臨床上大規(guī)模推廣使用?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)技術(shù)可同時檢測多個基因多態(tài)性位點，具有兼容性強、通量高、精準度高、性價比高的優(yōu)點，可用于同時檢測阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗的精準用藥相關(guān)基因信息。目前尚未有將基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)技術(shù)應(yīng)用于阿司匹林抵抗、硝酸甘油抵抗的精準用藥基因檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點的專用引物。本發(fā)明提供的專用引物，包括引物組1和引物組2；所述引物組1由引物對1、引物對2、引物對3和引物對4組成；所述引物對1由序列1所示的單鏈dna分子和序列2所示的單鏈dna分子組成；所述引物對2由序列3所示的單鏈dna分子和序列4所示的單鏈dna分子組成；所述引物對3由序列5所示的單鏈dna分子和序列6所示的單鏈dna分子組成；所述引物對4由序列7所示的單鏈dna分子和序列8所示的單鏈dna分子組成；所述引物組2由單鏈延伸引物1、單鏈延伸引物2、單鏈延伸引物3和單鏈延伸引物4組成；所述單鏈延伸引物1的核苷酸序列為序列9；所述單鏈延伸引物2的核苷酸序列為序列10；所述單鏈延伸引物3的核苷酸序列為序列11；所述單鏈延伸引物4的核苷酸序列為序列12。上述專用引物中，所述引物對1、引物對2、引物對3和引物對4中的各條引物的摩爾比為等摩爾比；或所述單鏈延伸引物1、單鏈延伸引物2、單鏈延伸引物3和單鏈延伸引物4的摩爾比為1:1:1:1。本發(fā)明另一個目的是提供一種檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點的pcr試劑。本發(fā)明提供的pcr試劑，包括pcr試劑1和pcr試劑2；所述pcr試劑1包括權(quán)利要求1所述專用引物中引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、pcr緩沖液、mgcl2、dntp和dna聚合酶；所述pcr試劑2包括權(quán)利要求2所述專用引物中單鏈延伸引物1、單鏈延伸引物2、單鏈延伸引物3、單鏈延伸引物4、單鏈延伸緩沖液和單鏈延伸酶。上述pcr試劑中，所述引物對1、引物對2、引物對3、引物對4中的各條引物在所述pcr試劑1中的濃度均為0.1μm；或，所述mgcl2在所述pcr試劑1中的濃度為2mm；或，所述dntp在所述pcr試劑1中的濃度為0.5mm；或，所述dna聚合酶在所述pcr試劑1中的濃度為0.2u/μl；所述單鏈延伸引物1、單鏈延伸引物2、單鏈延伸引物3、單鏈延伸引物4在所述pcr試劑2中的濃度均為0.05μm。本發(fā)明第3個目的是提供一種檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的專用引物或上述的pcr試劑。上述的專用引物或上述的pcr試劑或上述的試劑盒在制備檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點基因型產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述的專用引物或上述的pcr試劑或上述的試劑盒在檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點基因型中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述的專用引物或上述的pcr試劑或上述的試劑盒在對待測樣本進行阿司匹林和硝酸甘油指導(dǎo)用藥中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述的專用引物或上述的pcr試劑或上述的試劑盒在制備對待測樣本進行阿司匹林和硝酸甘油指導(dǎo)用藥產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明第4個目的是提供一種檢測待測樣本中阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點基因型的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：1)、用上述的專用引物中的引物對1-4對待測樣本進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物；2)將所述pcr擴增產(chǎn)物進行堿性磷酸酶消化，得到消化產(chǎn)物；3)將所述消化產(chǎn)物用上述的專用引物中的單鏈延伸引物1、單鏈延伸引物2、單鏈延伸引物3和單鏈延伸引物4進行單堿基延伸反應(yīng)，得到單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物；4)將所述單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過純化后，進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測，得到待測樣本中阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位的基因型。上述方法中，所述pcr擴增的模板為待測樣本的基因組dna。上述方法中，所述pcr擴增的程序為先94℃2min，再94℃20s、56℃30s、72℃60s進行45個循環(huán)，再72℃3min；或所述堿性磷酸酶消化的程序為：37℃，40min；85℃，5min，4℃保存；或所述單堿基延伸反應(yīng)的程序為：先94℃30s，再94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5個循環(huán)，進行40個循環(huán)，再72℃3min；或所述純化為樹脂純化。上述中，所述snp位點為rs5918(對應(yīng)引物對1和單鏈延伸引物1)、rs1330344(對應(yīng)引物對2和單鏈延伸引物2)、rs20417(對應(yīng)引物對3和單鏈延伸引物3)和rs671(對應(yīng)引物對4和單鏈延伸引物4)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明高效一次性實驗完成與阿司匹林和硝酸甘油抵抗相關(guān)的多個snp位點檢測，一次性實驗完成阿司匹林和硝酸甘油的精準用藥基因檢測，減少實驗成本；本發(fā)明根據(jù)每個snp位點設(shè)計的pcr引物及獨特的uep引物，具有較高的特異性。本發(fā)明對于指導(dǎo)阿司匹林和硝酸甘油的臨床精準用藥具有非常高的應(yīng)用價值，適于推廣應(yīng)用。附圖說明圖1為rs5918檢測結(jié)果。圖2為rs1330344檢測結(jié)果。圖3為rs20417檢測結(jié)果。圖4為rs671檢測結(jié)果。圖5為rs5918引物組1檢測結(jié)果。圖6為rs5918引物組2檢測結(jié)果。圖7為rs1330344引物組1檢測結(jié)果。圖8為rs1330344引物組2檢測結(jié)果。圖9為rs20417引物組1檢測結(jié)果。圖10為rs20417引物組2檢測結(jié)果。圖11為rs671引物組1檢測結(jié)果。圖12為rs671引物組2檢測結(jié)果。圖13為rs671優(yōu)化1檢測結(jié)果。圖14為rs671優(yōu)化2檢測結(jié)果。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點的方法及專用引物一、檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點專用引物根據(jù)阿司匹林和硝酸甘油抗藥性基因的相關(guān)snp位點rs5918、rs1330344、rs20417和rs671，設(shè)計特異性pcr引物和uep引物，利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)技術(shù)實現(xiàn)阿司匹林和硝酸甘油抗藥性基因檢測。特異性pcr引物和uep引物包括：rs5918pcr引物1：acgttggatgtctttgggctcctgtcttac(序列1)；rs5918pcr引物2：acgttggatgagcagattctccttcaggtc(序列2)；rs1330344pcr引物1：acgttggatgaggtcacgctatggaagaag(序列3)；rs1330344pcr引物2：acgttggatgaagaaacacttgtgtggccc(序列4)；rs20417pcr引物1：acgttggatgacagggtaactgcttaggac(序列5)；rs20417pcr引物2：acgttggatgactgttctccgtaccttcac(序列6)；rs671pcr引物1：acgttggatgttggtggctacaagatgtcg(序列7)；rs671pcr引物2：acgttggatgaggtcccacactcacagttt(序列8)；rs5918uep引物：ttacaggccctgcctc(序列9)；rs1330344uep引物：tgaaggctcttcccat(序列10)；rs20417uep引物：aggagaatttacctttccc(序列11)；rs671uep引物:ccacactcacagttttcactt(序列12)二、檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點的方法1、模板dna的提取提取192例離體外周血的基因組dna，濃度在20-30ng/μl。2、pcr反應(yīng)在5μlpcr96孔板中配制反應(yīng)體系：模板dna1μl，引物混合液1μl(反應(yīng)體系中各條引物的終濃度為0.1μm)，10×buffer(含15mmmg2+)0.5μl，mgcl2(25mm)0.4μl(反應(yīng)體系中mgcl2的終濃度為2mm)，dntp(25mm)0.1μl(反應(yīng)體系中dntp的終濃度為0.5mm)，hotstartaq(5u/μl)0.2μl(反應(yīng)體系中hotstartaq的終濃度為0.2u/μl)，用mbg水補齊到5μl。用封口膜將384孔板密封。引物混合液由序列1-8所示的引物和水組成，其中，每條引物濃度為0.5μm。將上述反應(yīng)體系進行pcr反應(yīng)，得到pcr擴增產(chǎn)物。上述pcr反應(yīng)程序設(shè)置如下：3、堿性磷酸酶處理(sap消化反應(yīng))向上述2得到pcr擴增產(chǎn)物中加入如下：sapbuffer0.17μl，sapenzyme(agenabioscience,產(chǎn)品ref:100021,lot:0000021450)0.30μl，mbg水1.53μl，得到sap消化反應(yīng)體系。將sap消化反應(yīng)體系進行消化反應(yīng)，得到消化反應(yīng)產(chǎn)物。上述消化反應(yīng)程序：37℃，40min；85℃，5min；4℃，∞。4、單堿基延伸反應(yīng)向上述3得到消化反應(yīng)產(chǎn)物中加入如下：iplexbufferplus(agenabioscience，ref:01431,lot:0000021844)0.2μl，iplexterminator(agenabioscience，ref:01430,lot:0000021435)0.2μl，iplexenzyme(agenabioscience，ref:01432,lot:0000021845)0.041μl，mbg水0.619μl，引物mix0.940μl(各條引物在單堿基延伸反應(yīng)體中的終濃度為0.05μm)，得到單堿基延伸反應(yīng)體系。上述引物mix由序列9-12所示的引物和水組成，且每條引物濃度為0.5μm。將單堿基延伸反應(yīng)體系進行單堿基延伸反應(yīng)，得到單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物。上述單堿基延伸反應(yīng)程序如下：5、樹脂純化將上述4得到的單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物進行樹脂純化，具體如下：1)將上述4得到裝有單堿基延伸產(chǎn)物的384反應(yīng)板3000rpm離心2min，每孔加16μlmbg水，用封口膜將反應(yīng)板封好，3000rpm瞬時離心。2)取一張干凈的a4紙，將樹脂板(規(guī)格為6mg)置于其上，用小勺取適量樹脂(agenabioscience,產(chǎn)品ref:08040,lot:0000022403)置于樹脂板上，用塑料蓋板反復(fù)左右推平樹脂，壓實，使每孔樹脂含量均勻。3)將離心后的384反應(yīng)板倒置在已經(jīng)鋪好樹脂的樹脂板上，兩塊板的孔一一對應(yīng)。翻轉(zhuǎn)兩個板，使樹脂板在上，384反應(yīng)板在下。均勻輕輕敲打樹脂板背面，使樹脂落入裝有單堿基延伸產(chǎn)物的384反應(yīng)板中。4)用封口膜將裝有單堿基延伸產(chǎn)物和樹脂的384反應(yīng)板密封，搖床低速垂直旋轉(zhuǎn)30min，使樹脂與反應(yīng)物充分接觸。5)將反應(yīng)完成后的384反應(yīng)板3000rpm離心5min使樹脂沉入管底，上清即為純化產(chǎn)物。6、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)檢測將上述5得到的純化產(chǎn)物通過點樣儀轉(zhuǎn)移到芯片(agenabioscience,產(chǎn)品ref:01509,lot:0000022421)上，放入質(zhì)譜儀中，進行質(zhì)譜檢測(質(zhì)譜檢測分子量范圍：4500-8000道爾頓)。結(jié)果如圖1-4所示，得到rs5918、rs1330344、rs20417和rs671位點的基因型；可以看出，本發(fā)明的引物對和方法可以用于這些位點的基因分型。。根據(jù)上述檢測的基因型進行精準用藥分析，指導(dǎo)臨床用藥，具體如表1。表1為基因型指導(dǎo)臨床用藥檢測位點臨床意義rs5918基因型cc和ct,相比基因型tt更容易發(fā)生阿司匹林抵抗rs1330344基因型ct和cc,相比基因型tt更容易發(fā)生阿司匹林抵抗rs20417基因型cc和gg,相比基因型gg更容易發(fā)生阿司匹林抵抗rs671基因型ga和aa,相比基因型gg更容易發(fā)生硝酸甘油抵抗實施例2、檢測阿司匹林和硝酸甘油抗藥性snp位點的方法及專用引物的應(yīng)用1、模板dna的提取將5名受檢者外周血(均有高血壓和血栓等癥狀)作為待檢樣本1-5，按照實施例1的二的1的方法提取dna。2、pcr反應(yīng)：與實施例1的二的2相同。3、堿性磷酸酶處理(sap消化反應(yīng))：與實施例1的二的3相同。4、單堿基延伸反應(yīng)：與實施例1的二的4相同。5、樹脂純化：與實施例1的二的5相同。6、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof-ms)檢測：方法與實施例1的二的6相同，結(jié)果如下表2：表2為待檢樣本的snp位點樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5rs5918ttttttttttrs1330344ttctctctttrs20417gggcgcgcgcrs671gggggagaca根據(jù)表1的分析結(jié)果，可以看出：樣本1對阿司匹林對敏感，不易發(fā)生阿司匹林抵抗，樣本5有一定的阿司匹林抵抗，樣本2,3,4易發(fā)生阿司匹林抵抗，應(yīng)加大藥物用量；樣本1,2服用急救藥物硝酸甘油有效，而樣本3,4,5服用急救藥物硝酸甘油無效，應(yīng)選擇其他急救藥物；經(jīng)過臨床用藥驗證：樣本1患者對阿司匹林對敏感，不易發(fā)生阿司匹林抵抗，樣本5患者有一定的阿司匹林抵抗，樣本2,3,4患者易發(fā)生阿司匹林抵抗，加大藥物用量；樣本1,2服用急救藥物硝酸甘油有效，而樣本3,4,5服用急救藥物硝酸甘油無效，選擇其他急救藥物；這與本發(fā)明的結(jié)果一致，表明本發(fā)明正確。對比例1、引物設(shè)計是該項檢測工作的關(guān)鍵，引物與模板的結(jié)合率直接影響pcr擴增效率，從而影響檢測結(jié)果的靈敏度和檢出率，尤其是uep引物的設(shè)計要求非常高，除了要求序列與檢測位點前的序列完全堿基互補配對外，這4條uep引物在長度設(shè)計上，必須呈梯度遞增，以便產(chǎn)生分子量差異，實現(xiàn)質(zhì)譜檢測。引物與模板的非特異性結(jié)合，出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物，也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。針對每個snp位點，發(fā)明人平行設(shè)計了3組pcr引物和uep引物(實施例1為引物組3)，按照實施例1的方法將192個樣本用3組引物分別檢測，通過比較，實施例1中的引物組3檢測效果最好：檢出率高，靈敏度高，聚類效果好，特異性高。表3為引物組1表4為引物組2引物組3見上述序列1-序列12。引物1組，引物2組均出現(xiàn)有位點檢出率低，聚類效果差的情況，結(jié)果如圖5-圖12。對比例2、在摸索出實施例1的反應(yīng)體系時，做出了如下平行反應(yīng)條件摸索實驗：1、優(yōu)化條件1：⑴pcr反應(yīng)：每條引物終濃度均為：0.1μmmgcl2的終濃度2mmdntp的終濃度是0.5mmhotstartaq的終濃度是0.15u/μlpcr反應(yīng)程序設(shè)置如下：⑵sap酶消化：消化反應(yīng)程序：37℃，45min；85℃，5min；4℃，∞。⑶單堿基延伸反應(yīng)優(yōu)化條件2：⑴pcr反應(yīng)：每條引物終濃度均為：0.1μmmgcl2的終濃度2mmdntp的終濃度是0.5mmhotstartaq的終濃度是0.1u/μlpcr反應(yīng)程序設(shè)置如下：⑵sap酶消化：消化反應(yīng)程序：37℃，40min；85℃，5min；4℃，∞。⑶單堿基延伸反應(yīng)采用實施例1的引物組、對照引物組1和引物組2檢測實施例1的192個同樣的樣本的rs671位點，檢測的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為上述優(yōu)化條件1，結(jié)果如圖13所示，可以看出，優(yōu)化條件1的位點檢出率低，聚類效果差。效果比實施例1的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件差。采用實施例1的引物組、對照引物組1和引物組2檢測實施例1的192個同樣的樣本的rs671位點，檢測的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為上述優(yōu)化條件2，結(jié)果如圖14所示，可以看出，優(yōu)化條件2的位點檢出率低，聚類效果差。效果比實施例1的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件差。序列表<110>李愛娟<120>一種用于檢測阿司匹林和硝酸甘油精準用藥的方法及專用引物<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1acgttggatgtctttgggctcctgtcttac30<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2acgttggatgagcagattctccttcaggtc30<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3acgttggatgaggtcacgctatggaagaag30<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4acgttggatgaagaaacacttgtgtggccc30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5acgttggatgacagggtaactgcttaggac30<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6acgttggatgactgttctccgtaccttcac30<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7acgttggatgttggtggctacaagatgtcg30<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8acgttggatgaggtcccacactcacagttt30<210>9<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9ttacaggccctgcctc16<210>10<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10tgaaggctcttcccat16<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11aggagaatttacctttccc19<210>12<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>12ccacactcacagttttcactt21當(dāng)前第1頁12