專利名稱：：檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的間接elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明為檢測(cè)兔出血癥病毒(RHDV)抗體檢測(cè)試劑盒，屬于獸醫(yī)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。用于兔出血癥病毒抗體的檢測(cè)，以此監(jiān)測(cè)兔群中兔出血癥疫苗免疫狀況，為兔出血癥疫苗的免疫提供技術(shù)依據(jù)。二
背景技術(shù)：
：兔出血癥(RHD)，又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種以急性、高度傳染性、大面積死亡為特征的兔傳染病，感染兔通常4872h死亡，主要特征為傳染性極強(qiáng)、呼吸系統(tǒng)出血、肝壞死、臟器水腫、淤血和出血等變化，給全世界養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際獸醫(yī)局將該病列為B類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部96號(hào)令頒布為二類疫病。RHDV屬杯狀病毒，病毒粒子呈球型，為二十面體對(duì)稱，無(wú)囊膜。病毒含有一條單股正鏈RNA，由7437個(gè)核苷酸組成，與一般的杯狀病毒不同，RHDV只有2個(gè)開(kāi)放閱讀框架(0RF)，0RFI位于基因組5'端，從核苷酸10延伸至核苷酸7041，約占整個(gè)基因組的94%。RHDV的ORFI基因序列為NH2-P16-P23-2C解旋酶-P30-VPg-3C樣蛋白酶-3D聚合酶-衣殼蛋白-COOH。衣殼蛋白是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，稱為VP60，其基因片段長(zhǎng)度為l740bp，共編碼580個(gè)氨基酸，與誘導(dǎo)抗病毒感染的免疫反應(yīng)直接相關(guān)。目前，檢測(cè)RHDV抗體的方法有血凝抑制法(HI)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。血凝抑制法(HI)因多種因素影響往往重復(fù)性不好，而以病毒作為包被抗原的ELISA，往往因病毒純化不良等因素，易出現(xiàn)非特異性，而且用RHDV作為包被抗原存在潛在散毒的危險(xiǎn)。本發(fā)明應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法，由于重組VP60蛋白具有與天然RHDV—樣優(yōu)良的抗原性，同時(shí)兔血清中不存在昆蟲(chóng)細(xì)胞相關(guān)蛋白的抗體，因此該間接ELISA方法具有背景反應(yīng)低，陰陽(yáng)性血清顯色OD值對(duì)比明顯，結(jié)果易判斷的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為檢測(cè)兔出血癥病毒(RHDV)抗體提供一種安全、特異、敏感、快速、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的試劑盒，為兔出血癥免疫監(jiān)測(cè)等方面提供技術(shù)手段和工具。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的ELISA試劑盒，用于兔出血癥病毒的抗體檢測(cè)。該試劑盒以真核表達(dá)的重組蛋白為基礎(chǔ)，通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)研制而成，具有高度的安全性、特異性、敏感性，操作簡(jiǎn)單、快速，可大量生產(chǎn)，檢測(cè)成本低廉，適于推廣。本發(fā)明可應(yīng)用于養(yǎng)兔業(yè)中兔出血癥抗體的免疫監(jiān)測(cè)等。技術(shù)方案本發(fā)明的目的是以真核表達(dá)的重組蛋白為基礎(chǔ)，通過(guò)酶聯(lián)免疫技術(shù)研制一種檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的試劑盒。首先是桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白及其含量測(cè)定；重組蛋白包被酶標(biāo)板；間接ELISA最佳反應(yīng)條件的確定；試劑盒的組裝；試劑盒阻斷試驗(yàn)、特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)；初步應(yīng)用；最終制備成檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的試劑盒。本發(fā)明采用的具體技術(shù)路線包括以下幾個(gè)方面1包被抗原重組VP60蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RHDVVP60蛋白作為包被抗原。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，獲得了高效表達(dá)RHDV衣殼蛋白(VP60蛋白)的重組桿狀病毒，用重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，經(jīng)鑒定證明重組VP60蛋白具有很好的抗原性，從而為本發(fā)明打下良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)多次的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證建立了本發(fā)明中包被抗原的制備方法1)參照文獻(xiàn)"兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)家兔的免疫保護(hù)效果".畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(10)，1382~1387."中描述的方法，用重組病毒rAcV-Bac-VP60，感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，感染后7天收集細(xì)胞及培養(yǎng)液；2)將上述收集物于-20。C反復(fù)凍融三次，以10000rpm/min，離心10min，收集上清，將上清液用0.45脾濾膜過(guò)濾后，用血凝試驗(yàn)(HA)檢測(cè)上清液中重組VP60蛋白的血凝效價(jià)為13!og2，測(cè)得蛋白濃度為591mg/L，分裝后于-20'C保存?zhèn)溆谩?標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陽(yáng)性血清與標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陰性血清的制備方法在ELISA檢測(cè)過(guò)程中，不同操作人員和不同的檢測(cè)批次間會(huì)存在一定的誤差，操作誤差會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)樣品OD值的誤差，但待檢樣品OD值/標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品OD值可消除誤差、準(zhǔn)確反映檢測(cè)結(jié)果，是優(yōu)化的判定標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明研制了標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陽(yáng)性血清與標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陰性血清，用于檢測(cè)條件的優(yōu)化和檢測(cè)結(jié)果的判定。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的制備取3月齡以上非免兔，用RHDV肝臟組織甲醛滅活疫苗通過(guò)肌肉注射接種2mL，21天后，同法免疫一次，再間隔14天，同法免疫一次，再間隔7天，同法免疫一次，最后一次免疫后6天采集兔耳緣靜脈血，分離血清，并用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)其血凝抑制效價(jià)^8(log2)，次日無(wú)菌心臟釆血，分離血清，并加萬(wàn)分之一的硫柳汞防腐。以0.5!111量分裝于無(wú)菌玻璃瓶中，加塞密封，-20'0保存。標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的制備取經(jīng)檢驗(yàn)合格的SPF兔，心臟采血，分離血清，并加萬(wàn)分之一的硫柳汞防腐。以0.51111量分裝于無(wú)菌玻璃瓶中，加塞密封，-20'(:保存。3ELISA檢測(cè)板條的抗原包被劑量和包被方法包被檢測(cè)抗原的微孔板條是ELISA試劑盒的核心材料，包被抗原的劑量是一個(gè)重5要的參數(shù)?？乖涣窟^(guò)高會(huì)使檢測(cè)樣品產(chǎn)生較高的背景反應(yīng)，抗原包被量過(guò)低又不能與樣本中抗體的充分結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。本發(fā)明通過(guò)方陣試驗(yàn)確定了包被抗原的最佳包被濃度選擇為4.62pg/mL，每孔100pL。微孔板條的包被方法如下1)將重組RHDVVP60蛋白(血凝效價(jià)為13log2)用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液進(jìn)行l(wèi):27,濃度為4.62pg/mL;2)按100nL/孔將稀釋的重組RHDVVP60蛋白包被96孔酶標(biāo)板，置4'C包被過(guò)夜；3)將包被了抗原的微孔板用PBST(PBS+0.05。/。Tween-20)洗滌3次后，每次5min，最后一次拍干，以2%明膠封閉每孔，200uL/孔，37'C放置2h;4)用PBST洗滌3次，室溫晾干，每次5min，最后一次拍干，室溫晾干，真空包裝，置4'C保存。4上述試劑盒用于檢測(cè)兔出血癥抗體試劑盒的操作方法，包括1)加入血清樣品被檢血清用血清稀釋液作1:100倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用血清稀釋液作1:200倍稀釋后，按酶標(biāo)板樣品添加模式于每孔中加入100nL，于37。C下作用60min后，棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用200jiL的洗滌液充分清洗35次，每次持續(xù)5min，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體甩掉，最后一次甩掉洗滌液后，在紙巾上拍干，除去殘留的液體；2)每個(gè)反應(yīng)孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液，100ul/孔，37。C孵育90分鐘，取出洗滌35次，每次5分鐘；3)每個(gè)反應(yīng)孔中加入顯色底物100nL，37'C避光作用10min;4)終止反應(yīng)向每孔中加入5(HiL終止液2M的硫酸終止反應(yīng)；5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值；6)以標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陽(yáng)性血清為參照計(jì)算樣品與陽(yáng)性血清的比值P/N的公式即待檢樣品血清孔或陽(yáng)性血清OD450值P/N=_50份陰性血清孔OD45o平均值7)結(jié)果判定①陽(yáng)性血清的OD450》0.321，且P/N》2.1，試驗(yàn)結(jié)果才有效；②如果血清樣品OD45o值《0.269，說(shuō)明該血清樣品為抗兔出血癥病毒抗體陰性；③如果血清樣品OD45o值》0.321，且P/N^2.1,方可判血清樣品為抗兔出血癥病毒抗體陽(yáng)性；④如果血清樣品1.5《P/N<2.1，判定該血清樣品為可疑。有益效果1安全性好國(guó)際獸醫(yī)局將由兔出血癥病毒引起的傳染病列為B類傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部96號(hào)令頒布為二類疫病。以兔出血癥病毒作為包被抗原建立的RHDV抗體檢測(cè)的ELISA，存在潛在散毒的危險(xiǎn)。本發(fā)明應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白為包被抗原建立了間接ELISA方法。研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒作為基因表達(dá)載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)①對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞安全無(wú)毒。②由于桿狀病毒具有高度的宿主特異性，桿狀病毒僅感染無(wú)脊椎動(dòng)物，使得桿狀病毒DNA游離存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而不與宿主細(xì)胞的基因發(fā)生整合，也不與細(xì)胞內(nèi)存在的具有潛在缺陷的哺乳動(dòng)物病毒基因進(jìn)行重組，也不能"幫助"人體內(nèi)的潛伏病毒，如腺病毒等進(jìn)行復(fù)制。此外，桿狀病毒也不會(huì)引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。因此，對(duì)人類及其他畜禽均具有良好的生物安全性。2敏感性高、特異性好本發(fā)明應(yīng)用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組VP60蛋白具有與天然RHDV—樣優(yōu)良的抗原性，以此重組蛋白作為包被抗原，在材料選擇上具有新意。通過(guò)Western-blotting試驗(yàn)，證實(shí)重組VP60蛋白具有良好的反應(yīng)原性，保證了檢測(cè)試劑盒的高度敏感性。特異性試驗(yàn)證明，該試劑盒能特異性地檢測(cè)免疫家兔血清中的抗朋DV抗體，而與兔大腸桿菌抗體、兔多殺性巴氏桿菌抗體和兔支氣管敗血波氏桿菌抗體反應(yīng)均呈陰性，從而表明該ELISA方法具有良好的特異性。應(yīng)用重組VP60蛋白為包被抗原建立檢測(cè)RHDV抗體的間接ELISA方法對(duì)臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與HI進(jìn)行比較，試驗(yàn)證明，ELISA與HI檢測(cè)兔血清的RHDV抗體陽(yáng)性率分別為84.7%和76.0%，ELISA與HI的符合率為95.7%。說(shuō)明本試劑盒在實(shí)際應(yīng)用中具有良好的特異性和敏感性。3檢測(cè)試劑盒可大量生產(chǎn)目前，在檢測(cè)RHDV抗體方面，應(yīng)用較為廣泛的是血凝抑制試驗(yàn)和全病毒RHDV作為包被抗原建立的ELISA方法。本發(fā)明使用的包被抗原為桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組VP60蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒作為基因表達(dá)載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)①表達(dá)效率高，與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒系統(tǒng)可以高效地表達(dá)外源基因，表達(dá)量最高可達(dá)所感染細(xì)胞總蛋白量的5W。②表達(dá)產(chǎn)物具有活性，昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工的方式與哺乳動(dòng)物細(xì)胞接近，能識(shí)別并正確地進(jìn)行信號(hào)肽的切除及磷酸化、糖基化等反應(yīng)，表達(dá)產(chǎn)物具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似。因此重組VP60蛋白易于穩(wěn)定、大量獲得，重組VP60蛋白的批間質(zhì)量易于控制、包被濃度易于確定，從而為RHDV抗體檢測(cè)試劑盒的大量、穩(wěn)定生產(chǎn)提供有力保證。四具體實(shí)施例方式1包被抗原的制備和鑒定1)用重組病毒rAcV-Bac-VP60(公知公用，參見(jiàn)"兔出血癥病毒衣殼蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)家兔的免疫保護(hù)效果".畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39(10)，1382~1387.)，感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(購(gòu)買(mǎi)于Invitrogen公司)，感染后7天收集細(xì)胞及培養(yǎng)液；2)將上述收集物于-2(TC反復(fù)凍融三次，以10000rpm/min，離心10min，收集上清，將上清液用0.45pm濾膜過(guò)濾后，用血凝試驗(yàn)(HA)檢測(cè)上清液中重組VP60蛋白的血凝效價(jià)為13log2，測(cè)得蛋白濃度為591mg/L，分裝后于-20。C保存?zhèn)溆茫?)應(yīng)用蛋白電泳和Western-blotting鑒定重組VP60蛋白。重組VP60蛋白的分子量約為60kD，對(duì)RHDV陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)陰性血清檢測(cè)呈陰性反應(yīng)；與兔大腸桿菌抗體、兔多殺性巴氏桿菌抗體和兔支氣管敗血波氏桿菌抗體無(wú)反應(yīng)。2標(biāo)準(zhǔn)朋DV陽(yáng)性血清與標(biāo)準(zhǔn)RHDV陰性血清的制備和鑒定1)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的制備取3月齡以上健康非免兔，用RHDV肝臟組織甲醛滅活疫苗通過(guò)肌肉注射接種2mL，21天后，同法免疫一次，再間隔14天，同法免疫一次，再間隔7天，同法免疫一次，最后一次免疫后6天采集兔耳緣靜脈血，分離血清，并用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)其血凝抑制效價(jià)^8(log2)，次日無(wú)菌心臟采血，分離血清，并加萬(wàn)分之一的硫柳汞防腐。W0.5mL量分裝于無(wú)菌玻璃瓶中，加塞密封，-20°(:保存。2)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的制備取經(jīng)檢驗(yàn)合格的SPF兔，心臟采血，分離血清，并加萬(wàn)分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml量分裝于無(wú)菌玻璃瓶中，加塞密封，-2(TC保存。3檢測(cè)兔出血癥病毒抗體間接ELISA的建立及其標(biāo)準(zhǔn)化本發(fā)明所建立的以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RHDVVP60蛋白為包被抗原的檢測(cè)RHDV抗體間接ELISA方法(VP60-ELISA)通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)3.1方陣試驗(yàn)確定抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)采用方陣滴定法(丘德新等.間接ELISA檢測(cè)豬偽狂犬病血清抗體[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，22(3):149151.)確定包被抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的最佳工作濃度。取96孔ELISA板2塊，將重組VP60蛋白(血凝效價(jià)為13log2)用0.05mol/LPH9.6的碳酸鹽緩沖液進(jìn)行倍比稀釋至1:212，自左向右依次分別加入112列，每個(gè)稀釋度6個(gè)重復(fù)，每孔100nL，同時(shí)設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照孔，每孔加100wL的包被液，置4'C包被過(guò)夜。取出后用PBST洗滌三次，每次持續(xù)5分鐘。用以2%明膠封閉每孔，200uL/孔，37'C放置2h，洗滌同前。將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用PBST做1:100、1:200、1:400，自上而下分別AF的反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度12個(gè)重復(fù)，每孔lOOpL，空白對(duì)照孔每孔加100pLPBST,37。C作用1.5h，再用洗滌液洗板3次，每次5min。接著每孔中加入100piLl:2000稀釋的HRP酶標(biāo)羊抗兔IgG(KPL公司產(chǎn)品)，37'C作用lh，再用洗滌液洗板5次，每次5min。繼而向每孔中加入100pL新鮮配制的TMBS(Amersco公司產(chǎn)品)-H202底物顯色液，37。C避光顯色1015min，最后加入50[iL2MH2S04終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD45o值。以陽(yáng)性血清OD45o值接近1.0，陽(yáng)性血清OD45o/陰性血清OD45o(P/N)的比值最大，且陰性血清OD45Q值在0.1左右所在孔的抗原濃度和血清稀釋液作為最佳抗原工作濃度和血清稀釋度。確定最佳抗原工作濃度為4.62ng/mL,而血清最佳稀釋倍數(shù)為1:200(表1)。3.2封閉液分別用PBST稀釋的1%BSA和2%明膠作為封閉液，每個(gè)封閉液做兩個(gè)重復(fù)，37°C作用2h，加1:200標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、1:2000酶標(biāo)羊抗兔IgG，結(jié)果表明，封閉液選用2%明膠效果最好(表2)。3.3抗原抗體最佳作用時(shí)間用pH7.4PBST將已知的陰、陽(yáng)性血清做1:200稀釋至最佳稀釋倍數(shù)后，分別于37'C下作用30min、60min、90min和120min，在其它條件及操作方法相同的情況下，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，觀察OD45o值及P/N變化，以陽(yáng)性血清OD值接近l.O，P/N值最大時(shí)為抗原抗體的最佳作用時(shí)間。結(jié)果表明抗原抗體的最佳作用時(shí)間為60min。3.4酶標(biāo)羊抗兔IgG的最佳稀釋度和作用時(shí)間應(yīng)用抗原包被板對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，在其它條件及操作方法相同的情況下，將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG用pH7.4PBST從1:2000開(kāi)始倍比稀釋至l:16000，每個(gè)稀釋度加4孔。按ELISA操作程序進(jìn)行，比較其0045()值差異；結(jié)果表明羊抗兔IgG最佳稀釋度為l:4000(表3)。將酶標(biāo)二抗做最佳稀釋后，分別將作用時(shí)間調(diào)整為30min、60min、90min和120min進(jìn)行ELISA測(cè)定，以陽(yáng)性血清OD值接近l.O，P/N值最大時(shí)為酶標(biāo)二抗的最佳作用時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果顯示作用90min時(shí)效果最好。3.5底物作用時(shí)間以上述經(jīng)過(guò)確定的反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA，加入底物后分別在37'C作用5min、10min、15min和20min終止反應(yīng)，比較其0045()值差異。結(jié)果表明以37'C作用10min為最佳顯色時(shí)間。3.6間接ELISA操作程序按以上各項(xiàng)所確定的優(yōu)化條件進(jìn)行操作，即得到本發(fā)明的最佳操作程序取出已包被抗原并封閉好的ELISA板條，用稀釋液將被檢血清用血清稀釋液作1:100倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用血清稀釋液作1:200倍稀釋后，按酶標(biāo)板樣品添加模式于每孔中加入100nL，于37'C下作用60min后，棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用20(HiL的洗漆液充分清洗35次，每次持續(xù)5min，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體甩掉，最后一次甩掉洗滌液后，在紙巾上拍干，除去殘留的液體；每個(gè)反應(yīng)孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液，100pL/孔，37°C孵育90分鐘，取出洗滌35次，每次5分鐘；每個(gè)反應(yīng)孔中加入顯色底物10(HiL，37'C避光作用10min;向每孔中加入50jiL終止液2M的硫酸終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值，讀值并計(jì)算和判定結(jié)果。4ELISA檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒(VP60-ELISA)對(duì)150份經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定、已知陰、陽(yáng)性的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陽(yáng)性血清為參照計(jì)算P/N值，對(duì)這些血清數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到OD45c平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差S。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，OD45o值》X+3S時(shí)，判為陽(yáng)性。OD45o值《X+2S者判為陰性，介于二者之間者判為可疑。根據(jù)分析結(jié)果得出VP60-ELISA進(jìn)行RHDV抗體檢測(cè)的判定標(biāo)準(zhǔn)①陽(yáng)性血清的OD45oX).321，且P/N》2.1，試驗(yàn)結(jié)果才有效。否則，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。②如果血清樣品OD4M)值《0.269,說(shuō)明該血清樣品為抗兔出血癥病毒抗體陰性；③如果血清樣品OD45o值》0.321，且P/N》2.1，方可判血清樣品為抗兔出血癥病毒抗體陽(yáng)性。④如果血清樣品1.5《P/N<2.1，判定該血清樣品為可疑。5檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的間接ELISA試劑盒組裝1)ELISA板條每個(gè)試劑盒裝有2塊錫箔真空包裝的ELISA板，每塊ELISA板含可拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板條，包被抗原為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白，規(guī)格為8孔xl2條；2)洗滌液和血清稀釋液10倍濃度的pH7.4PBST溶液150mL;3)酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液l瓶，25mL/瓶；4)底物顯色液A:濃度為O.lmol/L，pH為6.0的磷酸緩沖液(PB)100mL，加入1mLTMBS(10mg/mL)配制而成；B:3%H2O210mL;A和B均需4。C密封、避光、保存；每10mL顯色液A加B3%H20250混勻即用；5)終止液2mol/L的H2S04溶液lOOmL;6)標(biāo)準(zhǔn)RHDV陽(yáng)性血清0.5mL;7)標(biāo)準(zhǔn)RHDV陰性血清0.5mL。6阻斷試驗(yàn)取RHDV陽(yáng)性血清作1:200倍比稀釋至1:6400，與等量重組VP60蛋白抗原(4.62pg/mL)混合，37。C作用24h，10000rpm/min離心10min，取上清，與未經(jīng)抗原處理的陰、陽(yáng)性血清一起，應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒作ELISA檢測(cè)。計(jì)算(N-P)/N值，若此值大于0.5,則判為阻斷陽(yáng)性。(N-P)/N=(未阻斷孔OD值-阻斷孔OD值)/未阻斷孔OD值。結(jié)果表明，陽(yáng)性血清稀釋度在1:2001:3200范圍內(nèi)，重組VP60蛋白抗原處理血清的阻斷抑制率為76.6。/096.9。/。，當(dāng)血清稀釋度在1:6400時(shí)，其抑制率為100%(表4)，證明重組VP60蛋白抗原對(duì)血清抗體與包被抗原的結(jié)合有很強(qiáng)的抑制作用；包被抗原與血清抗體的結(jié)合是特異的。7特異性試驗(yàn)用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒，分別加入兔出血癥病毒陽(yáng)性抗體、大腸桿菌抗體、巴氏桿菌抗體和兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)抗體進(jìn)行檢測(cè)，比較其OD45o^值，以O(shè)D值》0.321，P/N》2.1判為陽(yáng)性(+)、以P/N〈2.1判為陰性(一)，試驗(yàn)結(jié)果顯示特異性好(表5)。8敏感性試驗(yàn)取RHDV肝臟甲醛滅活疫苗免疫血清10份，1:200倍比稀釋至1:819200，用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒作ELISA測(cè)定。以O(shè)D值>0.321，且P/N》2.1作終點(diǎn)判定。試驗(yàn)結(jié)果顯示血清的ELISA幾何平均效價(jià)為1:204800(表6)。9重復(fù)性試驗(yàn)應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒取6份陽(yáng)性血清在不同時(shí)間相同條件下，重復(fù)檢測(cè)6次，觀察OD值的變化。6次結(jié)果OD值變化較小，以O(shè)D值》0.321，P/N》2.1判為陽(yáng)性(+)，檢測(cè)結(jié)果完全相同(表7)。10臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒分別對(duì)江蘇南京地區(qū)四家實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)和江蘇鹽城兔場(chǎng)的1127份臨床血清樣品用本研究建立的檢測(cè)RHDV抗體的ELISA試劑盒和HI進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性率和符合率。試驗(yàn)結(jié)果，ELISA與HI檢測(cè)兔血清的RHDV抗體陽(yáng)性率分別為84.7%(955/U27)和76.0%(857/1127)，ELISA與HI的符合率為95.7%(表8)。表l抗原和血清最適稀釋度選擇結(jié)果抗原濃度項(xiàng)目血清稀釋度空白1:1001:2001:400對(duì)照P0.4680.3960,3240.001295.5N0.1430.1160.1000.001P/N3.273.413.24P0.4840.4450.384o細(xì)147.7N0.1450.1200.1100.001P/N3.333.713.49P0.4920.4660.3880.00173.9N0.1460.1200.105o扁P/N3.373.883.69P0.5300.4920.380o細(xì)36.9N0.1470.1270.1000.001P/N3.613.873.80P0.5970.5110.386o扁18.5N0.1490.1230.1010.001P/N4.014.153.829.234P0.5830.5000.394o扁N0.1370.0980.079o扁<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>P/N2.562.802.23注P為RHDV陽(yáng)性血清2個(gè)平行孔的OD45o平均值；N為RHDV陰性血清2個(gè)平行孔的OD4sn平均值。表2不同封閉液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3羊抗兔lgG最佳稀釋度的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注P為RHDV陽(yáng)性血清4個(gè)平行孔的OD45o平均值;N為RHDV陰性血清4個(gè)平行孔的OD45t)平均值。表4ELISA阻斷試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注N:未處理，T:處理，以上值為OD,表5間接ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果兔出血兔源大兔源多殺性兔支氣管敗陰性對(duì)照血清癥病毒腸桿菌巴氏桿菌血波氏桿菌P/N5.9721.3511.4091.1121.000判定+結(jié)果感性試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)_兔血清編號(hào)_血清幾-何平均方法12345678910效價(jià)免疫血清效價(jià)(l:x)ELIS人2048002048004096002048001042002048001042002048800409600409900104200表7間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果血清重復(fù)次數(shù)平均標(biāo)準(zhǔn)差編號(hào)123456值10.5870.5390.5180.5790.5680.5800.5620.02520.4570.4690.4780.4760.4670.4580.4680細(xì)30.6100.6140.5980.5960.6020.5850.6010扁40.5870.5320.5780.5480.5220.5120.5480.02650.6010.5180.5900.5810.6020.5270.5700.03460.4970.4600.4210.4710.4520.4170.4530.028表8間接ELISA與HI檢測(cè)結(jié)果的比較檢測(cè)方法樣品數(shù)量陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率符合率ELISA112795584.7%95.7%HI112785776.0%權(quán)利要求1.檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的間接ELISA試劑盒，包括，1)ELISA板條每個(gè)試劑盒裝有2塊錫箔真空包裝的ELISA板，每塊ELISA板含可拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板條，包被抗原為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白，規(guī)格為8孔×12條；2)洗滌液和血清稀釋液10倍濃度的pH7.4PBST溶液150mL；3)酶標(biāo)二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液1瓶，25mL/瓶；4)底物顯色液A濃度為0.1mol/L，pH為6.0的磷酸緩沖液PB100mL，加入1mLTMBS10mg/mL配制而成；B體積比3％H2O210mL；A和B均需4℃密封、避光保存；每10mL顯色液A加B3％H2O250μL混勻即用；5)終止液2mol/L的H2SO4溶液100mL；6)標(biāo)準(zhǔn)RHDV陽(yáng)性血清0.5mL；7)標(biāo)準(zhǔn)RHDV陰性血清0.5mL。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)兔出血癥病毒抗體間接ELISA試劑盒，其特征在于，包被抗原桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP60蛋白的制備方法為1)用重組病毒rAcV-Bac-VP60，感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，感染后7天收集細(xì)胞及培養(yǎng)液；2)將上述收集物于-20。C反復(fù)凍融三次，以10000rpm/min，離心10min，收集上清，將上清液用0.45nm濾膜過(guò)濾后，用血凝試驗(yàn)HA檢測(cè)上清液的血凝效價(jià)，分裝后于-20'C保存?zhèn)溆谩?.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述檢測(cè)兔出血癥病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，ELISA微孔板條的包被抗原劑量和包被方法為1)將血凝效價(jià)為13log2的重組VP60蛋白用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液進(jìn)行1:27稀釋；2)按100uL/孔將稀釋的重組VP60蛋白包被96孔微孔板，置4'C包被過(guò)夜；3)將包被了抗原的微孔板用PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以質(zhì)量比2%明膠封閉每孔，200uL/孔，37。C放置2h;4)將封閉好的微孔板用PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干，室溫晾干，真空包裝，置4'C保存。4.權(quán)利要求13之一所述試劑盒用于檢測(cè)兔出血癥抗體試劑盒的操作方法，包括1)加入血清樣品被檢血清用血清稀釋液作1:IOO倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清用血清稀釋液作1:200倍稀釋后，按酶標(biāo)板樣品添加模式于每孔中加入100nL，于37'C下作用60min后，棄去反應(yīng)孔中的液體；將每個(gè)孔用20(HiL的洗滌液充分清洗35次，每次持續(xù)5min，在每次洗滌后將反應(yīng)孔中的液體甩掉，最后一次甩掉洗滌液后，在紙巾上拍干，除去殘留的液體；2)每個(gè)反應(yīng)孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG使用液，100ul/孔，37'C孵育90分鐘，取出洗滌35次，每次5分鐘；3)每個(gè)反應(yīng)孔中加入顯色底物lOO[iL，37。C避光作用10min;4)終止反應(yīng)向每孔中加入50nL終止液2M的硫酸終止反應(yīng)；5)用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度OD值；6)以標(biāo)準(zhǔn)RHDV抗體陽(yáng)性血清為參照計(jì)算樣品與陽(yáng)性血清的比值P/N的公式即待檢樣品血清孔或陽(yáng)性血清OD450值P/N-_50份陰性血清孔OD4so平均值7)結(jié)果判定①陽(yáng)性血清的0D45。^0.321，且P/N^2.1，試驗(yàn)結(jié)果才有效；②如果血清樣品0D45。值《0.269，說(shuō)明該血清樣品為抗兔出血癥病毒抗體陰性；③如果血清樣品0D45。值》0.321，且P/N》2.1，方可判血清樣品為抗兔出血癥病毒抗體陽(yáng)性；④如果血清樣品1.5《P/N<2.1，判定該血清樣品為可疑。全文摘要本發(fā)明檢測(cè)兔出血癥病毒(RHDV)抗體的ELISA試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。試劑盒采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VP60衣殼蛋白作為包被抗原，依據(jù)間接ELISA原理檢測(cè)家兔血清中兔出血癥病毒的抗體，用于兔群中兔出血癥疫苗免疫的血清學(xué)檢測(cè)。試劑盒的核心物質(zhì)包被抗原為桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VP60衣殼蛋白，其具有與天然RHDV一樣優(yōu)良的抗原性，卻沒(méi)有RHDV潛在散毒的危險(xiǎn)。應(yīng)用本試劑盒檢測(cè)血清樣品，具有背景反應(yīng)低，陰、陽(yáng)性血清顯色OD值對(duì)比明顯的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明試劑盒生產(chǎn)成本低廉、可大量檢測(cè)樣品，而且特異性強(qiáng)、敏感性高，在兔出血癥免疫監(jiān)測(cè)等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)G01N33/569GK101533016SQ200910030739公開(kāi)日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年4月15日優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日發(fā)明者何孔旺,張則斌,徐為中,芳王,波胡,蘇國(guó)清,范志宇,蔡少平,薛家兵申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院