本發(fā)明涉及一種具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽的制備方法，屬于生物活性肽的制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

食品腐敗菌、致病菌引起的食品腐敗變質(zhì)和食品成分的氧化變質(zhì)可影響食品品質(zhì)及食品安全。這兩種食品變質(zhì)不僅會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失，甚至危害公眾健康，給食品安全帶來巨大壓力。如何防治食品微生物變質(zhì)和氧化變質(zhì)是食品工業(yè)要解決的重要問題。目前通過食品加工或添加防腐劑、抗氧化劑是預(yù)防食品微生物變質(zhì)和食品氧化變質(zhì)的主要措施。但是加工過程對(duì)食品營養(yǎng)的影響、非食品成分的添加，以及化學(xué)防腐劑和抗氧化劑對(duì)食品感官品質(zhì)的影響、在食品體系中的使用范圍窄、化學(xué)添加劑自身毒副作用以及化學(xué)添加劑攝入后在體內(nèi)殘留等缺點(diǎn)是不容忽視的。隨著人們消費(fèi)方式的改變和對(duì)食品安全及自身健康的關(guān)注，追求更天然、更少化學(xué)殘留和更少加工過程的健康食品是食品工業(yè)發(fā)展的一個(gè)新方向，這就需要更天然、更有效、更安全的生物防腐劑和抗氧化劑來防控食品的微生物及氧化變質(zhì)。

生物活性肽是蛋白中具有一種或多種特定活性如抗氧化、抗微生物、抗高血壓等，長度在2~20個(gè)氨基酸的序列，因其低毒、高活性的特點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。抗菌肽是一類具有抗微生物活性的生物活性肽，屬于抗生素家族。它們除了對(duì)細(xì)菌、真菌有抑菌活性以外，有的抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞、病毒等也具有毒性?？咕脑隗w內(nèi)最終酶解為氨基酸，無殘留毒性?？寡趸氖蔷哂幸种浦|(zhì)過氧化和清除自由基功能的一類生物活性肽。與傳統(tǒng)的化學(xué)抗氧化劑相比，抗氧化肽對(duì)人體潛在危害更小，因此越來越多的抗氧化肽被發(fā)現(xiàn)，特別是蛋白酶解肽。因此，以天然具有抗菌和抗氧化活性的活性肽為基礎(chǔ)解決食品變質(zhì)問題具有重要意義。

獲得天然活性肽的化學(xué)法和酶解法存在程序繁瑣、化學(xué)試劑殘留、費(fèi)用高等缺點(diǎn)；微生物液態(tài)發(fā)酵法的培養(yǎng)基組成復(fù)雜、發(fā)酵產(chǎn)物濃度低、能耗高。固態(tài)發(fā)酵法則有培養(yǎng)基簡單、產(chǎn)率高、能耗低、環(huán)境污染較少等優(yōu)點(diǎn)。目前固態(tài)發(fā)酵法制備活性肽主要集中在對(duì)抗氧化肽的研究，而固態(tài)發(fā)酵制備抗菌肽的研究甚少。

中國專利cn103333937a一種利用枯草芽孢桿菌制備抗菌肽的工藝方法采用分批補(bǔ)料深層液體發(fā)酵方式，培養(yǎng)基成分復(fù)雜、設(shè)備投資大、操作工藝繁瑣。中國專利cn101381757a公開了抗菌肽的固態(tài)發(fā)酵制備方法，這種方法前期需要將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入真菌并馴化真菌菌種的復(fù)雜工藝，且制備抗菌肽的培養(yǎng)基還需加入尿素、鉀鹽和生物素這些化學(xué)物質(zhì)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜。

我國蕎麥資源豐富，是特色糧食作物苦蕎的起源中心之一。苦蕎是一種糧藥兼用的糧食經(jīng)濟(jì)作物，苦蕎的蛋白質(zhì)含量約為10～15%，且50%以上是清蛋白和球蛋白。但目前苦蕎利用率不高、產(chǎn)品附加值低。以資源豐富的苦蕎為原料，固態(tài)發(fā)酵制備抗菌及抗氧化雙活性肽對(duì)活性肽的簡單、大量制備及苦蕎的深加工和高值化利用有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽的制備方法，該苦蕎活性肽可應(yīng)用于食品、飼料和化妝品行業(yè)中。包括如下步驟：

（1）將真菌孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，28～30℃，相對(duì)濕度70～90%，培養(yǎng)5～7天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為1×10⁶～1×10⁸個(gè)/ml，得到真菌孢子懸液；

（2）取苦蕎粉80～200g、蒸餾水40～100ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌20～30min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的真菌孢子懸液20～50ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于28～30℃、相對(duì)濕度70～90%下培養(yǎng)2～4天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入300～800ml蒸餾水，溫度10～20℃，功率150～300w超聲提取30～60min，置于離心機(jī)4℃、10000r/min離心10～20min，收集上清液，在沸水中煮沸5～10min滅酶，10000r/min離心10～20min，上清液即為苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析18～36h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

步驟（1）中所采用的真菌為黑曲霉、黃曲霉、總狀毛霉中的任意一種。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明提供了一種利用絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵苦蕎制備活性肽的方法，直接以苦蕎和水為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，采用對(duì)人無危害的絲狀真菌黑曲霉、黃曲霉和總狀毛霉作為發(fā)酵用真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵制備活性肽；制備方法工藝設(shè)備簡單，原料價(jià)廉易得，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品得率高，過程無化學(xué)物質(zhì)添加，適合大規(guī)模生產(chǎn)活性肽；

2、本發(fā)明制備的活性肽對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑制作用，且具有清除自由基的活性，制備的活性肽產(chǎn)品活性好、無殘留、無污染、成本低，可直接應(yīng)用于食品防腐保鮮、飼料及化妝品添加劑等。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。

實(shí)施例1

（1）用無菌接種環(huán)挑取斜面總狀毛霉（cicc40241）孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，29℃，相對(duì)濕度85%，培養(yǎng)5天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為2×10⁷個(gè)/ml，得到總狀毛霉孢子懸液；

（2）取苦蕎粉200g、蒸餾水70ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌20min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的總狀毛霉孢子懸液20ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于30℃、相對(duì)濕度70%下培養(yǎng)2天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入300ml蒸餾水，溫度10℃，功率230w超聲提取45min，置于離心機(jī)4℃、10000r/min離心15min，收集上清液，在沸水中煮沸5min滅酶，10000r/min離心15min，收集上清液得到苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析18h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

本實(shí)施例制得的苦蕎活性肽得率為15.6%，大腸桿菌抑菌率54%，金黃色葡萄球菌抑菌率72%，羥自由基清除率56%。

肽得率檢測方法如下：取固態(tài)發(fā)酵液，加入10vt%的三氯乙酸，渦漩震蕩后靜置20min，10000r/min離心10min，取1ml上清液，加入5ml堿性銅溶液，混勻，室溫放置10min，加入0.5ml福林-酚試劑并迅速搖勻，30℃水浴孵育30min后測定650nm處吸光值。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出可溶性肽含量。按如下公式計(jì)算肽得率：

肽得率（%）=發(fā)酵液中多肽含量/固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中苦蕎蛋白含量×100%

細(xì)菌抑制率檢測方法如下：將100μl經(jīng)0.22μm水系微孔濾膜過濾的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液加入96孔酶標(biāo)板中，再加入等體積1×10⁶cfu/ml的菌懸液作為試驗(yàn)組；以100μl無菌生理鹽水代替等體積苦蕎固態(tài)發(fā)酵液作為對(duì)照組；用100μl無菌生理鹽水代替等體積的菌懸液用于扣除樣品顏色；37℃培養(yǎng)12h后用酶標(biāo)儀測定620nm下吸光值；按如下公式計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)物液的抑菌率：

抑菌率（%）=[對(duì)照組od值-（試驗(yàn)組od值-樣品顏色od值）]/對(duì)照組od值×100%

羥自由基清除率檢測方法如下：向離心管中加入9mmol/lfeso4溶液、9mmol/l水楊酸-乙醇溶液、發(fā)酵液各1ml，混勻后加入6mmol/lh2o21ml混勻，37℃水浴30min，取出10000r/min離心2min；取上清液測定510nm吸光值記為a1；空白和對(duì)照分別用1ml蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液和發(fā)酵液，測定吸光值分別記為a0和a2；以蒸餾水調(diào)零，按如下公式計(jì)算羥自由基清除率：

羥自由基清除率（%）=[1-(a1-a0)/a2]×100%。

實(shí)施例2

（1）用無菌接種環(huán)挑取斜面黃曲霉（cicc41470）孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，30℃，相對(duì)濕度70%，培養(yǎng)6天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為1×10⁸個(gè)/ml，得到黃曲霉孢子懸液；

（2）取苦蕎粉80g、蒸餾水40ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌25min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的黃曲霉孢子懸液30ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于29℃、相對(duì)濕度85%下培養(yǎng)4天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入400ml蒸餾水，溫度18℃，功率300w超聲提取30min，置于離心機(jī)4℃、10000r/min離心10min，收集上清液，在沸水中煮沸8min滅酶，10000r/min離心20min，收集上清液得到苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析24h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

本實(shí)施例制得的苦蕎活性肽得率為23%，大腸桿菌抑菌率78%，金黃色葡萄球菌抑菌率84%，羥自由基清除率46%。

實(shí)施例3

（1）用無菌接種環(huán)挑取斜面黑曲霉（cicc2377）孢子接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，28℃，相對(duì)濕度90%，培養(yǎng)7天后用無菌生理鹽水沖洗下真菌孢子，調(diào)整孢子懸液濃度為1×10⁶個(gè)/ml，得到黑曲霉孢子懸液；

（2）取苦蕎粉160g、蒸餾水100ml置于發(fā)酵瓶中，蓋上封口膜，121℃滅菌30min，即得苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；

（3）將步驟（1）制得的黑曲霉孢子懸液50ml接入苦蕎固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌混勻后于28℃、相對(duì)濕度90%下培養(yǎng)3天；

（4）向苦蕎發(fā)酵瓶中加入800ml蒸餾水，溫度20℃，功率150w超聲提取60min，置于離心機(jī)4℃、10000r/min離心20min，收集上清液，在沸水中煮沸10min滅酶，10000r/min離心10min，收集上清液得到苦蕎固態(tài)發(fā)酵液；

（5）將步驟（4）得到的苦蕎固態(tài)發(fā)酵液用截留分子量為5000da的濾膜過濾，濾液用截留分子量為1000da的透析袋透析36h即得到具有抗菌和抗氧化雙活性的苦蕎活性肽。

本實(shí)施例制得的苦蕎活性肽得率為17%，大腸桿菌抑菌率67%，金黃色葡萄球菌抑菌率79%，羥自由基清除率71%。