本發(fā)明涉及生物工程和生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種使用無(wú)毒誘導(dǎo)物來(lái)誘導(dǎo)改良石斑魚(yú)抗菌肽pisl9k22wk在粉紅畢赤酵母(pichiapink)高效表達(dá)的方法。

背景技術(shù)：

抗菌肽(amp)是生物體內(nèi)帶正電荷、富含陽(yáng)離子和具有兩親性結(jié)構(gòu)的小分子多肽，主要特點(diǎn)如下：抗菌活性高，抗菌譜廣，種類(lèi)多，對(duì)細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)入機(jī)體后代謝速度快，不易在機(jī)體產(chǎn)生有害殘留，而且對(duì)真菌、病毒、原生動(dòng)物甚至腫瘤都具有殺傷作用或抑制作用。由于其突出的生物學(xué)特性，最有潛力作為型新安全無(wú)害抗生素替代品，從而備受科學(xué)界關(guān)注，但是抗菌肽的天然提取或者化學(xué)合成的成本過(guò)高，造成抗菌肽產(chǎn)品的價(jià)格昂貴，無(wú)法在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。

pisl9k22wk是以馬拉巴石斑魚(yú)多肽piscidin為基礎(chǔ)的改良抗菌肽(如申請(qǐng)201410545484.8中公開(kāi))，相比于改造前，pisl9k22wk的溶血活性降低，細(xì)胞毒性減少，而抗菌活性基本保持不變，具有更優(yōu)良的臨床應(yīng)用價(jià)值，是一種最具潛力的臨床的抗生素替代藥物。

利用畢赤酵母生產(chǎn)抗菌肽是降低抗菌肽產(chǎn)品成本的重要途徑，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有其它表達(dá)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，如畢赤酵母基因操作簡(jiǎn)單；外源蛋白表達(dá)量高，既可以胞內(nèi)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)；外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，另外，作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

粉紅畢赤酵母(pichiapink)表達(dá)系統(tǒng)是基于巴斯德畢赤酵母的真核生物蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可用于外源蛋白的高產(chǎn)量及大規(guī)模生產(chǎn)。該系統(tǒng)除了具有巴斯德畢赤酵母的優(yōu)點(diǎn)外，還有以下特點(diǎn)：ade2基因缺失型標(biāo)記利于表達(dá)克隆的篩選，只有整合ade2基因標(biāo)記的多克隆拷貝的轉(zhuǎn)化子才能在缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化子的顏色與目的基因的表達(dá)量直接相關(guān)；

但是目前的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在發(fā)酵放大過(guò)程中面臨諸多的問(wèn)題：誘導(dǎo)外源重組蛋白表達(dá)時(shí)需使用甲醇作為碳源，甲醇有毒，不適于用于食品或者添加劑的生產(chǎn)，并且易燃易爆易揮發(fā)，在工業(yè)化生產(chǎn)中車(chē)間需進(jìn)行防暴設(shè)計(jì)，導(dǎo)致成本增大；甲醇發(fā)酵強(qiáng)耗氧，一般靠增大空氣的通氣量和提高轉(zhuǎn)速很難滿(mǎn)足氧氣的需求，因此需要通很多純氧，給工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)不便，另外消耗的甲醇越多所產(chǎn)的熱量也越大，所需設(shè)備的冷卻能力要求越高；畢赤酵母aox1啟動(dòng)子的高效轉(zhuǎn)錄離不開(kāi)甲醇，在其它碳源中遭受碳源阻遏作用。

這些問(wèn)題導(dǎo)致抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)效果差，更重要的是利用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽產(chǎn)品中存留甲醇，甲醇毒性使這種抗菌肽產(chǎn)品無(wú)法在食品、飼料和醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用。因此，通過(guò)基因工程手段，開(kāi)發(fā)一種非甲醇誘導(dǎo)生產(chǎn)抗菌肽的方法有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能利用氯化膽堿誘導(dǎo)的改良石斑魚(yú)抗菌肽pisl9k22wk的酵母表達(dá)載體及工程菌構(gòu)建方法，抗菌肽發(fā)酵制備pisl9k22wk方法及應(yīng)用，本發(fā)明的酵母菌及表達(dá)產(chǎn)物可以用于表達(dá)醫(yī)藥與食品級(jí)抗菌肽，安全環(huán)保，操作簡(jiǎn)單，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

首先，構(gòu)建改良石斑魚(yú)抗菌肽pisl9k22wk的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體，包括如下步驟：

1)克隆畢赤酵母fld1啟動(dòng)子基因；

提取畢赤酵母全基因組，以全基因組為模板，以seqidno.4和seqidno.5為引物對(duì)fld1啟動(dòng)子基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得seqidno.1；

2)克隆石斑魚(yú)抗菌肽基因pisl9k22wk；

將seqidno.1連接t載體，得到fld-t，以fld-t為模板，以seqidno.4和seqidno.6為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將得到的pcr產(chǎn)物作為模板，以seqidno.4和seqidno.7為引物再次進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得fldpis如seqidno.9所示。編碼抗菌肽pisl9k22wk的氨基酸序列如seqidno.2所示。編碼抗菌肽pisl9k22wk的dna序列是按照酵母所偏愛(ài)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化的序列，具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；

3)將畢赤酵母表達(dá)載體ppinklc采用bglii和kpni雙酶切去除醇氧化酶啟動(dòng)子，與seqidno.9采用bglii和kpni雙酶切后的片段連接，獲得表達(dá)載體fplc。

改良石斑魚(yú)抗菌肽pisl9k22wk的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體的應(yīng)用，構(gòu)建所述抗菌肽pisl9k22wk工程菌包括以下步驟：

1)采用spei酶酶切表達(dá)載體fplc，獲得線性化載體；

2)通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法將線性化載體轉(zhuǎn)入粉紅畢赤酵母(pichiapink)中，電轉(zhuǎn)化的參數(shù)為1000-2000v，3-6ms；進(jìn)一步電轉(zhuǎn)化的參數(shù)優(yōu)選為1500v，5ms；

3)通過(guò)缺腺嘌呤的pad培養(yǎng)基篩選粉紅畢赤酵母(pichiapink)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過(guò)3-7天培養(yǎng)后從白色的轉(zhuǎn)化子中進(jìn)一步篩選出表達(dá)pisl9k22wk基因的工程菌。

本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為畢赤酵母，更優(yōu)選為pichiapink酵母。

本發(fā)明還提供培養(yǎng)上述抗菌肽pisl9k22wk工程菌的方法，包括以下步驟：

1)種子液的制備：從ypd平板挑取抗菌肽pisl9k22wk工程菌單菌落，接種于5-10mlypd液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rmp，搖床培養(yǎng)18-24h，獲得發(fā)酵種子液；

2)發(fā)酵培養(yǎng)：以1％-5％(v/v)接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，24-28℃，200-250rmp，進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，250rpm(轉(zhuǎn)/分)，搖床培養(yǎng)24h-48h，待發(fā)酵液od600的吸光度在2.0左右；

3)山梨醇/氯化膽堿補(bǔ)加：每24h，補(bǔ)加誘導(dǎo)物氯化膽堿1％-5％(w/v)和碳源山梨醇0.5％-5％(w/v)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在畢赤酵母中表達(dá)抗菌肽pisl9k22wk的方法，其是利用上述表達(dá)載體fplc轉(zhuǎn)化pichiapink酵母，獲得抗菌肽pisl9k22wk工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)后胞內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽pisl9k22wk。

本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化抗菌肽pisl9k22wk基因序列，構(gòu)建特異表達(dá)載體，首次實(shí)現(xiàn)了抗菌肽pisl9k22wk在pichiapink酵母中的高效表達(dá)，克服了大規(guī)模生產(chǎn)中產(chǎn)量過(guò)低或化學(xué)合成成本過(guò)高的問(wèn)題。本發(fā)明得到的表達(dá)系統(tǒng)，能通過(guò)在誘導(dǎo)過(guò)程中添加氯化膽堿和山梨醇，有效誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，且目標(biāo)蛋白表達(dá)量與表達(dá)活性方面比采用甲醇誘導(dǎo)更好。

本發(fā)明有效避免通常采用甲醇帶來(lái)的一系列問(wèn)題，如甲醇易燃易爆易揮發(fā)的特性，使得誘導(dǎo)過(guò)程中難于控制其濃度，且存在巨大的安全隱患，特別是以甲醇誘導(dǎo)生產(chǎn)的藥品與食品據(jù)美國(guó)fda標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是不安全的。本發(fā)明表達(dá)的抗菌肽可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，可應(yīng)用于抗菌藥物開(kāi)發(fā)，飼料添加劑開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)例1中pcr法擴(kuò)增fld1啟動(dòng)子的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)果；

圖2所示為pcr產(chǎn)物經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果；

圖3為實(shí)例2中大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果；

圖4為實(shí)例3中表達(dá)載體fplc經(jīng)spei酶切線性化的電泳結(jié)果；

圖5為實(shí)例3中重組酵母轉(zhuǎn)化子的pcr鑒定結(jié)果；

圖6為實(shí)例4中重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清的瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法抑菌結(jié)果；

圖7為實(shí)例5中不同濃度氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌搖瓶水平發(fā)酵96h后，收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清的od抑菌法第24h抑菌結(jié)果；

圖8為實(shí)例5中空載體畢赤酵母菌株和重組酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清經(jīng)過(guò)70℃分別處理5min、25min和45min后離心得到的上清od法抑菌第8h結(jié)果；

圖9為實(shí)例5中為空載體畢赤酵母菌株和重組酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清經(jīng)過(guò)100℃分別處理5min、25min和45min后離心得到的上清od法抑菌第8h結(jié)果；

圖10為實(shí)例6中抗菌肽pisl9k22wk工程菌搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清od法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖11為實(shí)例6中重組酵母菌株96h誘導(dǎo)搖瓶水平發(fā)酵后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清tricine-sds-page電泳檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍，若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件。

以下實(shí)施例中使用的酶和試劑：限制性?xún)?nèi)切酶spei、限制性?xún)?nèi)切酶stui、bglii、kpni、t4dna連接酶等分別購(gòu)自takara、invitrogen和北京全式金生物技術(shù)(transgenbiotech)有限公司。

小分子量蛋白預(yù)染marker：spectratmmulticolorlowrangeproteinladder(#sm1861)，購(gòu)自fermentas生物技術(shù)有限公司。

10×tris-tticine緩沖液、丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(29:1)、丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(19:1)、temed、購(gòu)自上海生工生物有限公司；其它常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

以下實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基配方：

lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/l，酵母浸提取物5g/l，nacl10g/l；固體lb培養(yǎng)基則加入1.5％(w/v)的瓊脂粉。

pad培養(yǎng)基(/l)：8g粉狀pad培養(yǎng)基，950ml去離子水，用naoh調(diào)ph至6.0-6.5左右，加入20g瓊脂粉，高壓滅菌后再加入50ml40％無(wú)菌葡萄糖。ypd培養(yǎng)基：蛋白胨20g/l，酵母浸提取物10g/l，葡萄糖20g/l；固體ypd培養(yǎng)基則加入2％(w/v)瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1％-5％(w/v)酵母提取物，1％-10％(w/v)蛋白胨，100-500mm磷酸鉀緩沖液(ph6.0)，0.5％-5％(w/v)ynb，4×10^-5生物素，0.5％-5％山梨醇。

優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基：1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，100mm磷酸鉀緩沖液(ph6.0)，1.34％(w/v)ynb，4×10^-5生物素，1％(w/v)山梨醇。

有關(guān)lb培養(yǎng)基、pad、ypd等培養(yǎng)基的使用參照invitrogen畢赤酵母操作手冊(cè)。

以下實(shí)施例中涉及的基因擴(kuò)增及轉(zhuǎn)化子鑒定方法為pcr法及dna測(cè)序法。

以下實(shí)施例中涉及的蛋白檢測(cè)方法為tricine-sds-page。

以下實(shí)施例中涉及的菌種和質(zhì)粒概述于表1：

表1供試菌種和質(zhì)粒：

實(shí)例1fld1啟動(dòng)子的擴(kuò)增和pisl9k22wk基因表達(dá)框的構(gòu)建

根據(jù)抗菌肽pisl9k22wk的aa序列，設(shè)計(jì)抗菌肽pisl9k22wk編碼基因，通過(guò)密碼子優(yōu)化后dna序列如下：

atgttcttcttccacatcatcaagggtaagttccacgctggtagaatgatccacggtttggtctggaagtaa(seqidno.3)

pcr擴(kuò)增fld1啟動(dòng)子和pisl9k22wk基因表達(dá)框

fld5bz(seqidno.4)：5′-gcgagatctgcatgcaggaatctctgg-3′；

fld3hz(seqidno.5)：5′-gcggaattctgtgaatatcaagaattgtatgaacaagc-3′；

pis3r(seqidno.6)：

5′-ccagcgtggaatttgcctttgattatatgaaagaagaacataggccttgtgaatatcaa-3′；

pis3r-pis(seqidno.7)：5′-aatagtggtacctcattatttccagaccaaaccatgaatcatcctaccagcgtggaatttgcct-3′；

以酵母基因組為模板，反應(yīng)體系如下：

pcr反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件如下：

將得到的pcr產(chǎn)物連接t載體，得到fld-t，以fld-t為模板，以seqidno.4和seqidno.6為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增：

反應(yīng)條件如下：

將得到的pcr產(chǎn)物，以seqidno.4和seqidno.7為引物再次進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

反應(yīng)條件如下：

pcr產(chǎn)物經(jīng)2.5％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到fld1啟動(dòng)子和pisl9k22wk基因表達(dá)框，連接t-vector，得到fldpis-t，轉(zhuǎn)化e.colidh5α。

圖1為實(shí)例1中pcr法擴(kuò)增fld1啟動(dòng)子的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)果；其中，m：5000bpdnamarker，上樣量為5μl；1：以fld5bz(seqidno.4)、fld3hz(seqidno.5)為引物，畢赤酵母全基因組為模板的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，上樣量為50μl；

圖2為實(shí)例1中pcr法擴(kuò)增得到seqidno.9的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)果；其中，m：5000bpdnamarker，上樣量為5μl；1：以fld5bz(seqidno.4)、pis3r-pis(seqidno.7)為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，上樣量為50μl。

實(shí)施例2抗菌肽pisl9k22wk的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1將實(shí)施例1獲得fldpis-t，經(jīng)bglii和kpni核酸內(nèi)切酶雙酶切。同時(shí)，用bglii和kpni雙酶切ppinklc載體(購(gòu)自invitrogen)。

雙酶切體系如下：

酶切條件：37℃水浴1h。

酶切產(chǎn)物用切膠回收試劑盒回收(購(gòu)自takara)，-20℃保存?zhèn)溆?，fldpis-t和ppinklc載體均經(jīng)過(guò)bglii和kpni雙酶切0后，用t4dna連接酶進(jìn)行連接。

連接體系如下：

連接條件：22℃，1h；16℃，1h；4℃過(guò)夜。

2.2將獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中：取出-80℃冷凍保存大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞100μl，立即置于冰上，加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min，迅速置于42℃水浴鍋熱激90s，快速置于冰上冰浴2min。向每個(gè)離心管中加入500μllb培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻，37℃，200rpm培養(yǎng)1h。4000rpm離心1min，去掉部分上清，留下約100μllb培養(yǎng)基，重懸菌體，將重懸后的菌液涂布在含有amp的lb固體平板上，37℃，倒置培養(yǎng)，16h。

2.3大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子鑒定

挑取在lb平板上長(zhǎng)出的單菌落，通過(guò)菌落pcr鑒定大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取經(jīng)引物fld5bz(seqidno.4)和引物pis3r-pis(seqidno.7)驗(yàn)證的大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于5mllb液體培養(yǎng)基中(含5μlamp)，37℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，與設(shè)計(jì)基因序列進(jìn)行比對(duì)，從dna水平上驗(yàn)證外源基因插入是否完全正確。

2.3.1引物檢測(cè)

fld5bz(seqidno.4)：5′-gcgagatctgcatgcaggaatctctgg-3′

pis3r-pis(seqidno.7)：5′-aatagtggtacctcattatttccagaccaaaccatgaatcatcctaccagcgtggaatttgcct-3′

菌落pcr反應(yīng)體系如下：

pcr反應(yīng)條件如下：

pcr產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶(圖3)，圖3為實(shí)例2中大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果：其中轉(zhuǎn)化子pcr產(chǎn)物點(diǎn)樣量為10μl；m：5000bpdnamarker；測(cè)序結(jié)果表明，pisl9k22wk基因片段插入位點(diǎn)、方向及序列完全正確，與設(shè)計(jì)相符。成功得到抗菌肽pisl9k22wk的畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體fplc。

2.3.2表達(dá)載體fplc的提取:挑取鑒定正確的大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種于10ml含10μlamp抗生素的lb液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)。采用質(zhì)粒提取試劑盒提取大腸桿菌dh5α陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中的表達(dá)載體fplc。

實(shí)施例3pisl9k22wk工程菌的構(gòu)建

3.1表達(dá)載體fplc的線性化

將實(shí)施例2中獲得的表達(dá)載體fplc用spei核酸內(nèi)切酶線性化后用于pichiapink酵母轉(zhuǎn)化。

線性化體系如下：

反應(yīng)條件：37℃，14h。

圖4為實(shí)例3中表達(dá)載體fplc經(jīng)spei酶切線性化的電泳結(jié)果：其中，m：1kbdnamarker，點(diǎn)樣量為5μl；1：沒(méi)有被線性化的表達(dá)載體fplc，點(diǎn)樣量為10μl；2：線性化的表達(dá)載體fplc，上樣量為10μl；電泳結(jié)果(圖4)顯示：抗菌肽pisl9k22wk的表達(dá)載體fplc完全線性化。

3.2pichiapink酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取pichiapink酵母(購(gòu)自invitrogen)單菌落接種至10mlypd培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rmp，搖床培養(yǎng)過(guò)夜，1％-5％(v/v)的接種量接種pichiapink酵母過(guò)夜培養(yǎng)物至50mlypd培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rmp，搖床培養(yǎng)至od600nm＝1.2-1.5，4℃，5000xg，離心5min，去上清液，50ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗2次，10ml冰預(yù)冷的1m山梨醇洗一次，4℃，5000xg，離心5min，去上清液，加200-400μl冰預(yù)冷的1m山梨醇重懸菌體，分裝80μl/管用于電轉(zhuǎn)化。

3.3電轉(zhuǎn)化

向80μlpichiapink酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入5-10μg線性化的質(zhì)粒溶于10μlddh2o，輕輕混勻，轉(zhuǎn)至冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5min，電轉(zhuǎn)化，參數(shù)為1000-2000v，3-6ms。電轉(zhuǎn)后立即加入1ml冰預(yù)冷的1m山梨醇溶液，混勻后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，30℃，溫育2-4h，4000xg，離心1min，去掉部分上清，留下約100μl上清重懸菌體，將重懸后的菌液涂布在pad平板上，30℃倒置培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單菌落。

3.4含有pisl9k22wk基因的重組酵母轉(zhuǎn)化子鑒定

pcr方法鑒定重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子：挑取白色的重組酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，以白色的重組酵母轉(zhuǎn)化子基因組作為模板，以引物：fld5bz(seqidno.4)：5′-gcgagatctgcatgcaggaatctctgg-3′；引物cyc13rrr(seqidno.8)：gcataggctagtgaagagtcaagtcgc進(jìn)行pcr鑒定；

pcr反應(yīng)體系如下：

pcr反應(yīng)條件如下：

圖5為實(shí)例3中重組酵母轉(zhuǎn)化子的pcr鑒定結(jié)果；其中，m：2000bpdnamarker；1：陽(yáng)性對(duì)照，2-14：重組酵母轉(zhuǎn)化子；pcr鑒定結(jié)果(圖5)表明：在1000bp處出現(xiàn)條帶，與設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度相符，故得到多個(gè)重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，可用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)。

實(shí)施例4搖瓶發(fā)酵篩選高效表達(dá)抗菌肽pisl9k22wk的工程菌

挑取實(shí)施例3中鑒定得到的重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rpm培養(yǎng)18-24h，篩選出在搖瓶中呈現(xiàn)白色的重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，以1％-5％(v/v)接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，24-28℃，200-250rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，250rpm，搖床培養(yǎng)至od600nm約2.0，此時(shí)計(jì)為初始誘導(dǎo)0h，隨后，每24h加甲醇至終濃度1％，誘導(dǎo)96h，12000rpm離心10min，棄上清液，收集沉淀，1xpbs洗2次，50mlpbs重懸沉淀，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，12000rpm離心10min收集破碎液上清，沉淀存于﹣80℃。

使用抑菌圈法來(lái)檢測(cè)重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的總蛋白抑菌活性。s.aureusatcc25923作為受試菌。挑取s.aureusatcc25923單菌落接種于10mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接至20ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，37℃200rpm，培養(yǎng)至od600nm＝0.6,取培養(yǎng)液按1:1000的比例加入到未凝固的含1％瓊脂的培養(yǎng)基中(大約5×10⁵cfu/ml)，搖勻，傾倒至空平板上。待平板凝固后，用無(wú)菌槍頭在平板中央打孔。向平板中央上樣孔內(nèi)加入總量約為100μg重組酵母總蛋白，對(duì)照組則加入2.5μg氨芐青霉素。上樣后，平板于4℃水平放置30min，隨后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9-12h。

圖6為實(shí)例4中重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清的瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法抑菌結(jié)果；其中，s.aureusatcc25923作為受試菌。1：空載體破碎液上清100μl上樣量；2-7：重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子破碎液上清100μl上樣量(約100μg)；8：20μl的氨芐青霉素(約2.5μg)；

抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明：重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子均有抑菌活性，而對(duì)照空載體沒(méi)有抑菌活性，陽(yáng)性對(duì)照(8)amp有抗菌活性。將pisl9k22wk表達(dá)量高的重組酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子作為抗菌肽pisl9k22wk工程菌。

實(shí)施例5氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌的誘導(dǎo)條件優(yōu)化。

5.1抗菌肽pisl9k22wk的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

5.1.11％(w/v)氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌發(fā)酵

挑取抗菌肽pisl9k22wk工程菌接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rpm培養(yǎng)18-24h，以1％-5％(v/v)接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，24-28℃，200-250rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，250rpm，搖床培養(yǎng)至od600的吸光度在2.0左右，此時(shí)計(jì)為初始誘導(dǎo)0h，隨后從第24h開(kāi)始每24h補(bǔ)加氯化膽堿和山梨醇，山梨醇補(bǔ)加量為1.89％(w/v)，氯化膽堿補(bǔ)加量為1％(w/v)，誘導(dǎo)96h。

使用od抑菌法檢測(cè)抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白抑菌活性。e.colitop10作為受試菌。挑取e.colitop10單菌落接種于20mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接至20ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，37℃200rpm，培養(yǎng)至od600nm＝0.3，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到5×10⁷cfu/ml，取菌液30μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶cfu/ml，取菌液(1×10⁶cfu/ml)150μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×105cfu/ml，取菌液(1×10⁵cfu/ml)100μl加入96孔板，將100μl抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h測(cè)量od600。

圖7為實(shí)例5中不同濃度氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌搖瓶水平發(fā)酵96h后，收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清的od抑菌法第24h抑菌結(jié)果；如圖7所示，結(jié)果表明氯化膽堿補(bǔ)加量為1％(w/v)時(shí)，有良好的抑菌效果。

圖8為實(shí)例5中空載體畢赤酵母菌株和重組酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清經(jīng)過(guò)70℃分別處理5min、25min和45min后離心得到的上清od法抑菌第8h結(jié)果，其中s.aureusatcc25923作為受試菌。

圖9為實(shí)例5中為空載體畢赤酵母菌株和重組酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清經(jīng)過(guò)100℃分別處理5min、25min和45min后離心得到的上清od法抑菌第8h結(jié)果，其中s.aureusatcc25923作為受試菌；

5.1.22％(w/v)氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌發(fā)酵

挑取抗菌肽pisl9k22wk工程菌接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rpm培養(yǎng)18-24h，以1％-5％(v/v)接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，24-28℃，200-250rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，250rpm，搖床培養(yǎng)至od600的吸光度在2.0左右，此時(shí)計(jì)為初始誘導(dǎo)0h，隨后從第24h開(kāi)始每24h補(bǔ)加氯化膽堿和山梨醇，山梨醇補(bǔ)加量為1.89％(w/v)，氯化膽堿補(bǔ)加量為2％(w/v)，誘導(dǎo)96h。

使用od抑菌法檢測(cè)抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白抑菌活性。e.colitop10作為受試菌。挑取e.colitop10單菌落接種于20mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接至20ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，37℃200rpm，培養(yǎng)至od600nm＝0.3，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到5×10⁷cfu/ml，取菌液30μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶cfu/ml，取菌液(1×10⁶cfu/ml)150μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁵cfu/ml，取菌液(1×10⁵cfu/ml)100μl加入96孔板，將100μl抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h測(cè)量od600。

第24hod抑菌法結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明氯化膽堿補(bǔ)加量為2％(w/v)時(shí)，有良好的抑菌效果。

5.1.35％(w/v)氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌發(fā)酵

挑取抗菌肽pisl9k22wk工程菌接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rpm培養(yǎng)18-24h，以1％-5％(v/v)接種量接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，24-28℃，200-250rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，250rpm，搖床培養(yǎng)至od600的吸光度在2.0左右，此時(shí)計(jì)為初始誘導(dǎo)0h，隨后從第24h開(kāi)始每24h補(bǔ)加氯化膽堿和山梨醇，山梨醇補(bǔ)加量為1.89％(w/v)，氯化膽堿補(bǔ)加量為5％(w/v)，誘導(dǎo)96h。

使用od抑菌法檢測(cè)抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白抑菌活性。e.colitop10作為受試菌。挑取e.colitop10單菌落接種于20mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接至20ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，37℃200rpm，培養(yǎng)至od600nm＝0.3，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到5×10⁷cfu/ml，取菌液30μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶cfu/ml，取菌液(1×10⁶cfu/ml)150μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁵cfu/ml，取菌液(1×10⁵cfu/ml)100μl加入96孔板，將100μl抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h測(cè)量od600。

第24hod抑菌法結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明氯化膽堿補(bǔ)加量為5％(w/v)時(shí)，有微弱抑菌效果。

不同濃度氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌發(fā)酵96h后，od抑菌法第24h抑菌結(jié)果顯示，氯化膽堿補(bǔ)加量為1％(w/v)和2％(w/v)時(shí)均有良好的抑菌效果，且氯化膽堿補(bǔ)加量為2％(w/v)時(shí)抑菌效果最好，故氯化膽堿的最佳誘導(dǎo)濃度為2％(w/v)。

5.2抗菌肽pisl9k22wk初步提純

分別采用70℃和100℃處理氯化膽堿誘導(dǎo)抗菌肽pisl9k22wk工程菌發(fā)酵96h后的總蛋白5min、25min和45min，在冰上放置10min。12000rpm，4℃，離心20min，收集上清，采用od抑菌法檢測(cè)上清抑制金黃色葡萄球菌的活性。

od抑菌法第8h抑菌結(jié)果顯示，70℃處理25min和45min后的蛋白液上清抑菌效果明顯優(yōu)于70℃處理5min，且70℃處理25min抑菌效果優(yōu)于70℃處理45min。圖9顯示100℃處理5min后的蛋白液上清依舊有抑菌活性，且抑菌效果優(yōu)于100℃處理25min和45min，隨著100℃處理時(shí)間的增加，抑菌活性減弱。70℃處理25min抑菌效果優(yōu)于100℃處理5min，故70℃處理25min為最佳處理?xiàng)l件。

實(shí)例6抗菌肽pisl9k22wk工程菌的抑菌活性檢測(cè)及蛋白水平檢測(cè)

6.1抗菌肽pisl9k22wk工程菌的抑菌活性檢測(cè)

取抗菌肽pisl9k22wk工程菌單克隆接種于10mlypd液體培養(yǎng)基中，28-30℃，200-250rpm培養(yǎng)18-24h，以1％-5％(v/v)的接種量將菌液接種于100ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，24-28℃，200-250rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為25℃，250rpm，搖床培養(yǎng)至od600的吸光度在2.0左右，此時(shí)計(jì)為初始誘導(dǎo)0h，隨后從24h開(kāi)始每24h補(bǔ)加氯化膽堿，氯化膽堿補(bǔ)加量為2％(w/v)，誘導(dǎo)96h。

使用od抑菌法檢測(cè)抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白抑菌活性。e.colitop10作為受試菌。挑取e.colitop10單菌落接種于20mllb培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，取200μl過(guò)夜培養(yǎng)物接至20ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，37℃200rpm，培養(yǎng)至od600nm＝0.3，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到5×10⁷cfu/ml，取菌液30μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁶cfu/ml，取菌液(1×10⁶cfu/ml)150μl加入1.5ml無(wú)菌lb培養(yǎng)基中，此時(shí)菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁵cfu/ml，取菌液(1×10⁵cfu/ml)100μl加入96孔板，將抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白用70℃處理25min后離心取上清100μl(20μg)加入含有100μl菌液的96孔板。每隔2h、4h、8h、12h、20h、24h測(cè)量od600。

圖10為實(shí)例6中抗菌肽pisl9k22wk工程菌搖瓶水平發(fā)酵96h后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清od法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中，受試菌為大腸桿菌top10?？咕膒isl9k22wk工程菌破碎液上清100μl；空載體：空載體畢赤酵母菌株破碎液上清100μl上樣量；結(jié)果顯示(圖10)抗菌肽pisl9k22wk工程菌具有明顯抑菌效果，其od600值遠(yuǎn)低于空載體對(duì)照，顯著的抑制了菌的生長(zhǎng)，在24h后抑菌率仍然達(dá)到45.5％。

6.2抗菌肽pisl9k22wk工程菌的蛋白水平檢測(cè)

對(duì)6.1中獲得的高活性的抗菌肽pisl9k22wk工程菌進(jìn)一步采用tricine-sds-page分析重組pisl9k22wk表達(dá)水平。

圖11為實(shí)例6中重組酵母菌株96h誘導(dǎo)搖瓶水平發(fā)酵后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清tricine-sds-page電泳檢測(cè)結(jié)果；其中，6和7分別為抗菌肽pisl9k22wk工程菌和空載體畢赤酵母菌株96h搖瓶水平誘導(dǎo)發(fā)酵后收集細(xì)胞經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)破碎，破碎液上清30μl上樣量；m為超低分子量蛋白marker。結(jié)果圖11可見(jiàn)，從蛋白電泳圖譜來(lái)看，抗菌肽pisl9k22wk工程菌總蛋白在1.7kd與4.2kd之間有目的條帶,而空載體對(duì)照在此大小區(qū)間無(wú)條帶。

本發(fā)明成功優(yōu)化了編碼抗菌肽pisl9k22wk基因，并構(gòu)建了表達(dá)載體fplc，經(jīng)spei酶酶切線性化后成功轉(zhuǎn)化到pichiapink酵母中獲得表達(dá)水平較高的抗菌肽pisl9k22wk工程菌，抗菌肽pisl9k22wk在pichiapink酵母中實(shí)現(xiàn)了高水平的胞內(nèi)表達(dá)。將抗菌肽pisl9k22wk工程菌進(jìn)行氯化膽堿誘導(dǎo)發(fā)酵后，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的抗菌肽pisl9k22wk進(jìn)行了抗菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明有明顯抑菌效果。通過(guò)熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，抗菌肽pisl9k22wk熱穩(wěn)定性好，70℃加熱45min活性沒(méi)有損失，100℃加熱處理5min活性也沒(méi)有損失。另外，通過(guò)時(shí)間–抑菌曲線結(jié)果反應(yīng)抗菌肽pisl9k22wk在低濃度下24h后抑菌率仍然達(dá)到45.5％。

sequencelisting

<110>深圳大學(xué)

<120>一種非甲醇誘導(dǎo)生產(chǎn)抗菌肽的方法

<130>20170323

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>609

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agatctgcatgcaggaatctctggcacggtgctaatggtagttatccaacggagctgagg60

tagtcgatatatctggatatgccgcctataggataaaaacaggagagggtgaaccttgct120

tatggctactagattgttcttgtactctgaattctcattatgggaaactaaactaatctc180

atctgtgtgttgcagtactattgaatcgttgtagtatctacctggagggcattccatgaa240

ttagtgagataacagagttgggtaactagagagaataatagacgtatgcatgattactac300

acaacggatgtcgcactctttccttagttaaaactatcatccaatcacaagatgcgggct360

ggaaagacttgctcccgaaggataatcttctgcttctatctcccttcctcatatggtttc420

gcagggctcatgccccttcttccttcgaactgcccgatgaggaagtccttagcctatcaa480

agaattcgggaccatcatcgatttttagagccttacctgatcgcaatcaggatttcacta540

ctcatataaatacatcgctcaaagctccaactttgcttgttcatacaattcttgatattc600

acaaggcct609

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<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metphephephehisileilelysglylysphehisalaglyargmet

151015

ilehisglyleuvaltrplys

20

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<212>dna

<213>人工序列

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atgttcttcttccacatcatcaagggtaagttccacgctggtagaatgatccacggtttg60

gtctggaagtaa72

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<212>dna

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gcgagatctgcatgcaggaatctctgg27

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gcct64

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<213>人工序列

<400>9

agatctgcatgcaggaatctctggcacggtgctaatggtagttatccaacggagctgagg60

tagtcgatatatctggatatgccgcctataggataaaaacaggagagggtgaaccttgct120

tatggctactagattgttcttgtactctgaattctcattatgggaaactaaactaatctc180

atctgtgtgttgcagtactattgaatcgttgtagtatctacctggagggcattccatgaa240

ttagtgagataacagagttgggtaactagagagaataatagacgtatgcatgattactac300

acaacggatgtcgcactctttccttagttaaaactatcatccaatcacaagatgcgggct360

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catggtttggtctggaaataatgaggtacc690