本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用磁性納米粒子底物固定化催化合成糖苷化合物的方法。

背景技術(shù)：

在生物催化反應(yīng)中，酚類物質(zhì)作為反應(yīng)底物會影響菌體的活性，造成催化劑的活性下降甚至使催化劑喪失催化作用。消除底物對菌體的毒害作用成為生物催化工業(yè)的一個瓶頸，嚴(yán)重阻礙了生物催化工業(yè)的發(fā)展，抑制了目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。

固定化技術(shù)是利用化學(xué)或物理手段將物體定位于限定空間區(qū)域的一門新興技術(shù)，經(jīng)過固定化的底物可以慢慢從載體中釋放出來，使反應(yīng)體系中的底物濃度處于菌體耐受度以內(nèi)，不會影響酶的活性和微生物的新陳代謝，從而較好地催化合成產(chǎn)物，有效提高產(chǎn)物產(chǎn)量。

磁性納米粒子因具有尺寸小、超順磁性和低毒性等特點，已經(jīng)引起了生物化工行業(yè)的廣泛關(guān)注。但是磁性納米粒子之間強烈的磁性偶極-偶極之間的吸引力導(dǎo)致磁性粒子容易發(fā)生聚集。因此，常用一些表面活性劑、氧化物、金屬納米粒子或帶有一些特殊官能團的聚合物來修飾磁性納米粒子，在提高磁性納米粒子穩(wěn)定性的同時還能使其吸附一些特定物質(zhì)，大大拓寬了磁性納米粒子在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。

xiaolizhao等采用二氧化硅/四氧化三鐵磁性納米粒子對環(huán)境水中的酚類物質(zhì)進行富集并分析成分（zhaox.preparationofsilica-magnetitenanoparticlemixedhemimicellesorbentsforextractionofseveraltypicalphenoliccompoundsfromenvironmentalwatersamples.[j].journalofchromatographya,2008,1188(2):140-147.）。李曉飛等用殼聚糖/znfe2o4磁性納米粒子吸附并處理了苯酚工業(yè)廢水（李曉飛,黃紹潔.殼聚糖包縛草酸鐵處理含酚廢水研究[j].環(huán)境科技,2007,20(3):26-28.）。以上文獻中均探究了磁性納米粒子對酚類物質(zhì)的吸附和富集，但是對于吸附后的利用沒有做進一步的研究。中國專利“cn1279163”公布了一種發(fā)酵生產(chǎn)糖苷類化合物的方法，該方法直接通過野油菜黃單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)α-熊果苷。中國專利“cn100478451”中合成糖苷類化合物的方法則是通過游離細胞或固定化細胞催化合成4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷。以上兩個專利中涉及到的方法都不能避免有毒底物對于細胞的毒害作用,從而導(dǎo)致底物添加量受到限制。中國專利“cn103805657”公布了一種通過固定化底物提高產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，該方法用大孔吸附樹脂固定化有毒底物，用游離細胞在緩沖溶液系統(tǒng)中催化有毒底物與雙糖合成糖苷類化合物。該方法雖然能夠避免有毒底物對細胞的毒害，但是底物固定化的量難以突破，且后期分離成本高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，用磁性納米粒子對有毒底物酚類進行固定化，然后用固定化酚類替代傳統(tǒng)的游離底物在最佳反應(yīng)條件下進行催化反應(yīng)生產(chǎn)目的產(chǎn)物，在目前的研究基礎(chǔ)上將產(chǎn)物產(chǎn)量提高三至五倍。該方法可增強反應(yīng)體系對有害底物的耐受度，提高底物添加量，簡化產(chǎn)物后續(xù)分離純化工藝及減少有毒廢水排放，降低了目的產(chǎn)物生產(chǎn)成本，為大規(guī)模低成本生產(chǎn)目的產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：利用磁性納米粒子固定化酚類底物，然后用固定化底物替代傳統(tǒng)的游離底物與糖類進行催化反應(yīng)，該方法由下列工藝步驟組成：

（1）固定化底物的制備，其中包括固定化載體的制備和底物酚類的固定化；

（2）野油菜黃單胞菌（xanthomonascampestris）cgmccno.1243菌體的培養(yǎng)，其中包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)；

（3）加入固定化底物進行催化反應(yīng)；

（4）產(chǎn)物的分離純化；

（5）固定化載體的重復(fù)使用。

本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件是：

步驟（1）中固定化底物的制備：

先制得質(zhì)量百分比濃度為1-10％的酚類水溶液；向100ml酚類水溶液加入5-15g磁性納米粒子進行吸附；吸附結(jié)束后磁性分離，去離子水多次清洗以除去殘留的酚類物質(zhì)。制得吸附量為0.05-3g酚類物質(zhì)/g磁性納米粒子的固定化底物。

步驟（2）中種子液和發(fā)酵液由下列重量份組分組成：

糖20-60份、蛋白胨1-20份、酵母粉1-5份、硫酸鎂0.5-1份、磷酸氫二鉀1-5份、氯化鈉1-5份和水1000份；

種子液培養(yǎng)的工藝條件為培養(yǎng)溫度為20-40℃，ph值為5.0-8.0，搖床轉(zhuǎn)速為50-200r/min，發(fā)酵時間為5-24h；發(fā)酵液培養(yǎng)的工藝條件為種子液接種量為1%-15%，培養(yǎng)溫度為20-40℃，通風(fēng)量為0.1-2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為50-1000r/min，發(fā)酵時間為12-100h。

步驟（3）中催化反應(yīng)：

往發(fā)酵罐中加入固定了酚類的磁性納米粒子和糖，其中磁性納米粒子的質(zhì)量百分比濃度為1-100g/l，糖類化合物的質(zhì)量百分比濃度為1-1000g/l，在反應(yīng)溫度為20-50℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50-1000r/min的條件下反應(yīng)12-100h。

步驟（4）中的產(chǎn)物分離純化：

采用固定化底物替代傳統(tǒng)的游離底物進行催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)產(chǎn)物理化性質(zhì)及狀態(tài)采用洗脫、萃取、離交或蒸餾的方式進行產(chǎn)物分離純化。

步驟（5）中固定化載體的回收及循環(huán)使用：

在固定化底物催化反應(yīng)結(jié)束后，進行磁性分離即可把固定化載體進行回收，回收的載體進入步驟（1）進行底物固定化，并再次作為底物投入催化反應(yīng)體系中進行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，固定化載體的使用壽命可達1-1000個周期。

步驟（1）中所述的酚類物質(zhì)為：苯酚、對甲苯酚、間甲苯酚、對苯二酚、均苯三酚、鄰苯二酚、間苯二酚、連苯三酚、α-萘酚、β-萘酚、氨基酚、硝基酚、氯酚中的1種。

步驟（1）中所述的磁性納米粒子為鐵氧體磁性納米粒子、鎳納米粒子、鈷納米粒子、合金磁性納米粒子、非晶態(tài)合金磁性納米粒子、磁性復(fù)合納米粒子中的1種。

步驟（3）中所述的糖類化合物為葡萄糖、果糖、半乳糖、低聚半乳糖、乳酮糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、甘露寡糖、低聚殼聚糖、帕拉金糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖、淀粉、纖維素、殼多糖、菊糖中的1種。

本發(fā)明所取得的技術(shù)進步在于：

本發(fā)明是通過以磁性納米粒子固定化底物作為野油菜黃單胞菌（xanthomonascampestris）cgmccno.1243催化合成糖苷化合物的反應(yīng)物，解決了直接用游離底物作為反應(yīng)物所存在的對菌體的毒害作用，導(dǎo)致目的產(chǎn)物產(chǎn)量無法提高，產(chǎn)物后續(xù)分離工藝復(fù)雜，含有毒底物廢水導(dǎo)致的環(huán)境污染等問題。利用本發(fā)明生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法具有如下優(yōu)點：

（1）將磁性納米粒子作為底物固定化載體，提高了載體的底物負載量，降低了底物細胞毒性對反應(yīng)體系的影響，避免了生物催化劑酶活的下降并延長其使用壽命。

（2）利用固定化底物提高菌體對酚類物質(zhì)的耐受度，提高單位體積反應(yīng)液中底物濃度，進而提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，降低目的產(chǎn)物的生產(chǎn)成本，使大規(guī)模生產(chǎn)目的產(chǎn)物成為了可能；

（3）在反應(yīng)結(jié)束后，未反應(yīng)的有毒底物依然固定在載體上，反應(yīng)液中沒有有毒底物的存在，從而減少有毒廢水的排放，對環(huán)境不造成任何污染。

采用本發(fā)明進行催化反應(yīng)具有目的產(chǎn)量高，工藝步驟簡單，生產(chǎn)成本低，環(huán)境友好等優(yōu)點，具有重大工業(yè)化意義。

本發(fā)明的方法涉及的固定化載體既可用公知的方法合成也可以是市場銷售產(chǎn)品，固定化方法即可用現(xiàn)有的固定化方法也可根據(jù)經(jīng)驗采用的改良的方法。下面所列舉的實施例只是為了更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受它們的任何限定。

具體實施方式

實施例1：以殼聚糖包四氧化三鐵磁性納米粒子為底物固定化載體，發(fā)酵生產(chǎn)4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷。

（1）固定化底物的制備：

在4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷催化合成過程中，底物對苯二酚對菌體有毒害作用，因此采用本發(fā)明方法將其固定在磁性納米粒子上，既增加了底物負載量，又消除了底物對反應(yīng)體系的毒害作用，具體操作步驟如下：

根據(jù)底物對苯二酚的理化性質(zhì)，選擇殼聚糖包四氧化三鐵磁性納米粒子fe3o4@cts作為底物固定化載體。首先制得質(zhì)量百分比為10％的對苯二酚水溶液；然后在100ml對苯二酚水溶液中加入10gfe3o4@cts磁性納米粒子，在溫度為10-40℃、轉(zhuǎn)速為100-200r/min的搖床中固定2-40h；固定化結(jié)束后進行磁性分離，去離子水清洗磁性納米粒子以除去表面殘留。即制得0.05-3g對苯二酚/g磁性納米粒子的固定化底物對苯二酚。

（2）4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的催化反應(yīng)：

①發(fā)酵液的制備

在4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷合成反應(yīng)中，使用的菌種為野油菜黃單胞菌（xanthomonascampestris）cgmccno.1243；挑取1環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為20-40℃，轉(zhuǎn)速為50-200r/min，搖床中培養(yǎng),5-24h后即制得菌體發(fā)酵液。

種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成：

糖20-60份、蛋白胨1-20份、酵母粉1-5份、硫酸鎂0.5-1份、磷酸氫二鉀1-5份、氯化鈉1-5份和水1000份。

②催化合成反應(yīng)

往250ml錐形瓶中加入固定了對苯二酚的fe3o4@cts磁性納米粒子和蔗糖，其中磁性納米粒子的質(zhì)量濃度為1-100g/l發(fā)酵液，蔗糖物質(zhì)量濃度為1-1000g/l；在反應(yīng)溫度為20-50℃，轉(zhuǎn)速為50-1000r/min條件下反應(yīng)12-100h。在此反應(yīng)條件下，固定化底物對苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達80-99％，4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的產(chǎn)量為10-200g/l。

（3）4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的分離純化：

①將反應(yīng)結(jié)束后的發(fā)酵液進行磁性分離，超純水清洗磁性納米粒子數(shù)次；

②將經(jīng)過①步驟的磁性納米粒子用體積百分比濃度為1-90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液。磁性納米粒子烘干待下次使用；

③把經(jīng)過②步驟的洗脫液進行真空濃縮，在濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時，放入溫度為0-4℃條件下進行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5％以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50℃，結(jié)晶時間為12h。

（4）固定化載體的回收及循環(huán)使用：

在經(jīng)過步驟（3）的磁性納米粒子用去離子水洗滌2-3次，洗凈殘留的乙醇溶液，然后用于底物對苯二酚的固定化，并再次作為底物投入催化反應(yīng)體系中進行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，磁性納米粒子的使用壽命可達1-1000個周期。

實施例2：以二氧化硅包四氧化三鐵磁性納米粒子為底物固定化載體，發(fā)酵生產(chǎn)4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷。

（1）固定化底物的制備：

首先制得質(zhì)量百分比為10％的對苯二酚水溶液；然后在100ml對苯二酚水溶液中加入10gfe3o4@sio2磁性納米粒子，在溫度為10-40℃、轉(zhuǎn)速為100-200r/min的搖床中固定2-40h；固定化結(jié)束后進行磁性分離，去離子水清洗磁性納米粒子以除去表面殘留。即制得0.05-2g對苯二酚/g磁性納米粒子的固定化底物對苯二酚。

（2）4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的催化反應(yīng)：

①發(fā)酵液的制備

在4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷合成反應(yīng)中，使用的菌種為野油菜黃單胞菌（xanthomonascampestris）cgmccno.1243；挑取1環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為20-40℃，轉(zhuǎn)速為50-200r/min，搖床中培養(yǎng),5-24h后即制得菌體發(fā)酵液。

種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成：

糖20-60份、蛋白胨1-20份、酵母粉1-5份、硫酸鎂0.5-1份、磷酸氫二鉀1-5份、氯化鈉1-5份和水1000份。

②催化合成反應(yīng)

往250ml錐形瓶中加入固定了對苯二酚的fe3o4@sio2磁性納米粒子和蔗糖，其中磁性納米粒子的質(zhì)量濃度為1-100g/l發(fā)酵液，蔗糖物質(zhì)量濃度為1-1000g/l；在反應(yīng)溫度為20-50℃，轉(zhuǎn)速為50-1000r/min條件下反應(yīng)12-100h。在此反應(yīng)條件下，固定化底物對苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達80-95％，4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的產(chǎn)量為10-150g/l。

（3）4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的分離純化：

①將反應(yīng)結(jié)束后的發(fā)酵液進行磁性分離，超純水清洗磁性納米粒子數(shù)次；

②將經(jīng)過①步驟的磁性納米粒子用體積百分比濃度為1-90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液。磁性納米粒子烘干待下次使用；

③把經(jīng)過②步驟的洗脫液進行真空濃縮，在濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時，放入溫度為0-4℃條件下進行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5％以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50℃，結(jié)晶時間為12h。

（4）固定化載體的回收及循環(huán)使用：

在經(jīng)過步驟（3）的磁性納米粒子用去離子水洗滌2-3次，洗凈殘留的乙醇溶液，然后用于底物對苯二酚的固定化，并再次作為底物投入催化反應(yīng)體系中進行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，磁性納米粒子的使用壽命可達1-1000個周期。

實施例3：以碳包三氧化二鐵磁性納米粒子為底物固定化載體，游離細胞催化合成4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷。

（1）固定化底物的制備：

首先制得質(zhì)量百分比為10％的對苯二酚水溶液；然后在100ml對苯二酚水溶液中加入10gfe2o3@c磁性納米粒子，在溫度為10-40℃、轉(zhuǎn)速為100-200r/min的搖床中固定2-24h；固定化結(jié)束后進行磁性分離，去離子水清洗磁性納米粒子以除去表面殘留。即制得0.1-2g對苯二酚/g磁性納米粒子的固定化底物對苯二酚。

（2）4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的催化反應(yīng)：

①細胞懸濁液的制備

挑取1環(huán)斜面保存的野油菜黃單胞菌，加入到體積為250ml的液體培養(yǎng)基中，在溫度為20-40℃，轉(zhuǎn)速為50-200r/min，搖床中培養(yǎng)5-24h后即制得菌體發(fā)酵液。再將菌體發(fā)酵液在4000-5000r/min的條件下離心20分鐘，生理鹽水清洗兩遍，震蕩溶解于磷酸鹽緩沖溶液中。配制成為質(zhì)量比為1:20的細胞懸濁液。

種子液及發(fā)酵罐培養(yǎng)基由下列重量份組分組成：

糖20-60份、蛋白胨1-20份、酵母粉1-5份、硫酸鎂0.5-1份、磷酸氫二鉀1-5份、氯化鈉1-5份和水1000份。

②催化合成反應(yīng)

往100ml細胞懸濁液中加入固定了對苯二酚的fe2o3@c磁性納米粒子和蔗糖，其中磁性納米粒子的質(zhì)量濃度為1-80g/l發(fā)酵液，蔗糖物質(zhì)量濃度為1-500g/l；在反應(yīng)溫度為20-50℃，轉(zhuǎn)速為50-1000r/min條件下反應(yīng)12-100h。在此反應(yīng)條件下，固定化底物對苯二酚轉(zhuǎn)化為α-熊果苷的轉(zhuǎn)化率達80-90％，4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的產(chǎn)量為10-150g/l。

（3）4-羥苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷的分離純化：

①將反應(yīng)結(jié)束后的細胞懸濁液進行磁性分離，超純水清洗磁性納米粒子數(shù)次；

②將經(jīng)過①步驟的磁性納米粒子用體積百分比濃度為1-90%的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液。磁性納米粒子烘干待下次使用；

③把經(jīng)過②步驟的洗脫液進行真空濃縮，在濃縮到產(chǎn)品處于飽和狀態(tài)時，放入溫度為0-4℃條件下進行結(jié)晶，晶體經(jīng)干燥后得到純度為99.5％以上的α-熊果苷產(chǎn)品；真空濃縮溫度為50℃，結(jié)晶時間為12h。

（4）固定化載體的回收及循環(huán)使用：

在經(jīng)過步驟（3）的磁性納米粒子用去離子水洗滌2-3次，洗凈殘留的乙醇溶液，然后用于底物對苯二酚的固定化，并再次作為底物投入催化反應(yīng)體系中進行反應(yīng)；如此重復(fù)循環(huán)，磁性納米粒子的使用壽命可達1-1000個周期。