本發(fā)明涉及分子生物學檢測
技術領域：
的檢測方法，具體涉及一種塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr檢測特異性引物、探針及檢測方法。
背景技術：
：塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)為單股正鏈rna病毒，屬于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)senecavirus病毒屬。svv最初是2002年在per.c6細胞培養(yǎng)物中被發(fā)現(xiàn)，2007年認定svv為導致美國一批屠宰場中的豬群出現(xiàn)水皰癥狀的致病原，直到2015年才出現(xiàn)新的報道，巴西和美國均爆發(fā)了多起svv疫情，多個階段的豬只均能感染，鼻鏡、唇部和蹄部等部位出現(xiàn)水皰，并導致小天齡仔豬死亡，造成較大的損失。隨后有報道顯示國內也出現(xiàn)了塞尼卡谷病毒，由于之前國內從來沒有出現(xiàn)過，因而沒有現(xiàn)成的檢測方法，直至目前國內仍少見塞尼卡谷病毒的檢測方法，主要原因是該病為新病，相關研究較少，已有的rt-pcr檢測方法只能進行定性檢測不能做精確定量分析，且擴增后需要經過電泳判斷結果，每次檢測的樣品數量較少、對低含量的樣品分辨率不足等缺點。由此可見，現(xiàn)有技術還有待改進。技術實現(xiàn)要素：鑒于此，有必要針對上述問題提供一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測引物、探針及檢測方法，具有實時、快速、靈敏度高、特異性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點，有利于較大規(guī)模的定量檢測分析。本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測引物，其核苷酸序列為：上游引物：5’-ttatagaatttggaagccatgct-3’(seqidno:1)下游引物：5’-atcagaatgcagcttctcgagtag-3’(seqidno:2)。一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測探針，其核苷酸序列為：5’-cctacttcaaaccaggaac-3’(seqidno:3)。進一步的，所述探針的5’端標記熒光報告基團(fam)；所述探針的3’端標記小溝結合物(mgb)和熒光淬滅基團(nfq)。一種塞尼卡谷病毒的taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法：(1)制定塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標準曲線；(2)提取樣品中的病毒rna，-20℃～-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?3)將(2)中的樣品病毒rna進行逆轉錄，所得逆轉錄cdna產物-20℃～-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?4)將(3)所得的樣本cdna產物作為模板進行taqman-mgb熒光定量pcr反應；(5)結合步驟(1)中的標準曲線，判讀檢測結果。進一步的，所述taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法步驟(1)中，塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標準曲線制定步驟是：(1)在上述引物(seqidno:1和seqidno:2)兩側的基因組序列上，設計一對新的克隆引物psv1u和psv1d，其擴增片段長度為371bp，涵蓋了熒光定量引物擴增片段(69bp)的全部，該對克隆引物的引物序列如下：psv1u：5’-atcgccaacggtgacga-3’(seqidno:4)；psv1d：5’-tgctggtactcgtgactc-3’(seqidno:5)，(2)以塞尼卡谷病毒陽性樣品rna(即命名為ch-01-2015株(kt321458)的病毒病料)為模板，利用(1)中所得引物，進行一步法rt-pcr擴增，獲得用于構建標準質粒的目的dna片段；其中50μl反應體系為：primescript1stepenzymemix：2μl，2×onestepbuffer：25μl，seqidno:4(10μm)：2μl，seqidno:5(10μm)：2μl，模板rna：1μl，無核酸酶蒸餾水：補足至50μl。反應程序為：50℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30個循環(huán)；72℃，10min；4℃降溫；(3)將(2)中所得dna片段與pmd19-t載體連接，轉化大腸桿菌jm109感受態(tài)，挑取陽性克隆，進行測序鑒定后將重組菌擴大培養(yǎng)并抽提重組質粒；將提取的重組質粒按1010～101拷貝數/μl的濃度梯度稀釋成標準質粒樣品，分裝成小管后-20℃～-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫?4)將(3)所得的樣本標準質粒作為模板，各濃度梯度樣品分別進行taqman-mgb熒光定量pcr反應；(5)根據步驟(4)的反應結果繪制塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標準曲線。進一步的，所述taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法步驟(3)中，10μl逆轉錄體系為：5×primerrtmastermix:2μl，樣品rna:1～4μl，rnasefreedh2o:補足至10μl；逆轉錄程序為：37℃，15min；85℃，5s；4℃或16℃降溫。進一步的，所述taqman-mgb熒光定量pcr檢測方法步驟(4)或塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標準曲線制定方法步驟(4)中的taqman-mgb熒光定量pcr反應，20μl反應體系為：組分用量(μl)2×premixextaq(probeqpcr)10上游引物seqidno:1(10μm)1.2下游引物seqidno:2(10μm)1.6mgb探針seqidno:3(10μm)0.650×roxreferencedyeii0.4標準質粒樣品或樣品cdna模板1.0無核酸酶蒸餾水補足至20μl上表所述模板為樣本rna逆轉錄所得的cdna產物或各濃度梯度的標準質粒；反應程序為：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40個循環(huán)。本發(fā)明有益效果：taqman-mgb探針法熒光定量pcr技術相比于目前的普通rt-pcr技術，具有簡單快速、易操作、結果直觀、靈敏度高、穩(wěn)定性好、實時定量等優(yōu)點，與sybr等染料法熒光定量pcr技術相比，具有更好的特異性，并能縮短反應時間，而與taqman-tamra探針法熒光定量pcr技術相比，由于本發(fā)明引物序列在現(xiàn)有已報道的塞尼卡谷病毒中保守性好，與其它物種基因相似性低，特異性好,擴增片段長度短，擴增速度快；且使用了mgb，能提高tm值，從而縮短探針長度，有利于探針設計，且提高了配對與非配對模板間的tm值差異，使實驗結果更穩(wěn)定和精確。附圖說明圖1塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標準曲線：從左至右分別對應濃度103～108copies/μl的標準質粒樣品。圖2塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法特異性實驗結果：圖中s曲線為svv陽性樣品的擴增曲線。圖3塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法敏感性實驗：從左至右的8條曲線分別對應濃度108～101copies/μl的標準質粒樣品。具體實施方式為了更好地說明本發(fā)明所解決的問題、所采用的技術方案和所達到的效果，現(xiàn)結合具體實施例和相關資料進一步闡述。需要說明的是，本
發(fā)明內容包含但不限于以下實施例及其組合實施方式。實施例一1.引物和taqman-mgb探針設計從genbank中檢索獲得塞尼卡谷病毒全基因組序列(genbank登錄號為nc_011349，kc667560和kt321458)，通過dnastar軟件進行序列比對，找出塞尼卡谷病毒基因組特異性的保守序列，然后blast進一步確定其保守性。通過oligo6.0引物設計軟件對該保守序列進行引物設計，得到一對特異性引物和一條mgb探針，引物和探針位于單一orf的3’端附近(7021～7089位)，目的擴增片段為69bp。上游引物：5’-ttatagaatttggaagccatgct-3’(seqidno:1)下游引物：5’-atcagaatgcagcttctcgagtag-3’(seqidno:2)探針：fam-5’-cctacttcaaaccaggaac-3’-mgb-nfq(seqidno:3)2.定量標準質粒的構建和制備在上述引物(seqidno:1和seqidno:2)兩側的基因組序列上，設計一對新的克隆引物psv1u和psv1d，其擴增片段長度為371bp，涵蓋了熒光定量引物擴增片段(69bp)的全部，該對克隆引物的引物序列如下：psv1u：5’-atcgccaacggtgacga-3’(seqidno:4)psv1d：5’-tgctggtactcgtgactc-3’(seqidno:5)；以本實驗室檢測陽性并經測序鑒定過的塞尼卡谷病毒陽性樣品(即命名為ch-01-2015株(kt321458)的病毒病料)rna為模板，利用上述引物(seqidno:4和seqidno:5)，按照takara公司primescripttmonesteprt-pcrkitver.2試劑盒說明書進行一步法rt-pcr擴增，其中50μl反應體系為：primescript1stepenzymemix：2μl，2×onestepbuffer：25μl，seqidno:4(10μm)：2μl，seqidno:5(10μm)：2μl，模板rna：1μl，無核酸酶蒸餾水：補足至50μl。反應程序為：50℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30個循環(huán)；72℃，10min；4℃降溫。產物進行瓊脂糖凝膠電泳后進一步進行膠回收，獲得用于構建標準質粒的目的dna片段。將此dna片段與pmd19-t載體(購自takara公司)連接，轉化大腸桿菌jm109感受態(tài)(購自takara公司)，挑取陽性克隆，并進行測序鑒定，鑒定后將重組菌擴大培養(yǎng)并抽提重組質粒。鑒定好的重組質粒用核酸濃度測定儀測定質粒濃度，并換算為質?？截悢?。質粒拷貝數(copies/μl)＝[質粒濃度(ng/μl)×6.02×1023]/[質粒分子量(g/mol)×109]。將重組質粒稀釋成1010～101copies/μl的標準質粒濃度梯度，分裝成小管后-70℃凍存?zhèn)溆谩?.樣品中病毒rna的提取使用axygen的dna/rna小量提取試劑盒，按照使用說明書提取樣品病毒rna，-70℃保存。4.樣品中病毒rna的逆轉錄按照takara公司primescripttmrtmastermix試劑盒說明書逆轉錄合成cdna，10μl逆轉錄體系如下：5×primerrtmastermix:2μl，rnasefreedh2o:4μl，樣品rna:4μl。將各試劑混合均勻，置pcr儀中按以下程序進行：37℃15min，85℃5sec，4℃降溫結束，反應結束后的cdna產物-20℃保存用于熒光定量pcr檢測。5.taqman-mgb熒光定量pcr反應條件的優(yōu)化參照takarapremixextaqtm(probeqpcr)試劑盒使用說明書，通過對反應體系中不同的引物濃度、mgb探針濃度、退火溫度等實驗條件進行比較，選擇反應靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型s型擴增熒光信號曲線、擴增效率接近1的反應條件。經優(yōu)化后的20μl反應體系如下表：組分用量(μl)2×premixextaq(probeqpcr)10上游引物(10μm)1.2下游引物(10μm)1.6mgb探針(10μm)0.650×roxreferencedyeii0.4標準質粒樣品或樣品cdna模板1.0rnasefreedh2o5.2優(yōu)化后的反應條件為：95℃30s；(95℃5s，60℃34s)40個循環(huán)。實時觀察記錄標準質粒樣品或樣品cdna模板的試驗結果。將各濃度梯度的標準質粒樣品分別經上述taqman-mgb熒光定量pcr反應，根據其結果繪制塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr標準曲線，如圖1所示，得到的標準曲線線性關系良好，相關系數r2＝1.000，擴增效率為100.5％。6.檢測結果的判定經檢測，若待檢樣品中含有塞尼卡谷病毒基因則顯示陽性擴增曲線，若待檢樣品中不含有塞尼卡谷病毒基因則無擴增信號。陽性樣品中的塞尼卡谷病毒基因濃度可以通過標準曲線進行定量，即在標準曲線上找到某個樣品所對應的ct值，就能對應得到該樣品的具體濃度。實施例二塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法特異性實驗分別以svv陽性樣品、prv陽性樣品、pcv2陽性樣品、prrsv陽性樣品、fmdv陽性樣品、pedv陽性樣品、rv陽性樣品、csfv陽性樣品、pdcov陽性樣品為模板，以蒸餾水為陰性對照按實施例一中taqman-mgb熒光定量pcr反應的操作方法分別進行反應，實時觀察并記錄各樣品反應結果，如圖2所示，只有svv陽性樣品出現(xiàn)良好的s型曲線，其余樣品均未出現(xiàn)擴增曲線，說明該方法特異性良好。實施例三塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr方法敏感性實驗以實施例一中制備的濃度梯度為101～108copies/μl的標準質粒樣品作為模板，分別按照實施例一中taqman-mgb熒光定量pcr反應的操作方法分別進行反應，實時觀察并記錄各樣品反應結果，如圖3所示，所有濃度的樣品均表現(xiàn)出良好的擴增曲線，說明該方法靈敏度好。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。<110>廣東溫氏食品集團股份有限公司<120>塞尼卡谷病毒taqman-mgb熒光定量pcr檢測引物、探針及檢測方法<160>5<170>oligo6.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ttatagaatttggaagccatgct23<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<400>2atcagaatgcagcttctcgagtag24<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3cctacttcaaaccaggaac19<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4atcgccaacggtgacga17<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5tgctggtactcgtgactc18當前第1頁12