【
技術領域：
】本發(fā)明涉及est-ssr標記
技術領域：
，特別涉及一種甘蔗est-ssr標記的制備方法及應用。
背景技術：
：甘蔗是主要的糖料經(jīng)濟作物，產(chǎn)糖量占世界的三分之二，其雜種后代染色體的高度雜合性、異源多倍性和非整倍性為甘蔗雜交育種工作增加了許多不可控因素，育成一個甘蔗新品種往往需要長達10年或更長時間也成為甘蔗育種程序的主要不利因素，而隨著分子生物學的發(fā)展，分子遺傳標記已成為研究復雜基因組物種的重要工具，利用分子標記技術對復雜基因組進行遺傳分析，能快速找出甘蔗育種工作的父本、母本，同時能科學、合理的對子代性狀進行預測，有效提高了育種工作的效率。目前，常使用ssr分子標記對甘蔗分子標記分析，例如：中國專利cn103911435a公布的利用ssr標記與毛細管電泳鑒定甘蔗雜交種子純度的方法；中國專利cn10401759a公布的一種基于ssr與毛細管電泳技術鑒定甘蔗種質(zhì)資源的方法，上述兩種方法都是利用ssr(simplesequencrepeat)標記方法來對甘蔗的種質(zhì)資源進行分析驗證的，ssr標記方法是利用在染色體上呈隨機分布的重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)序列來設計引物，但是，ssr標記的引物開發(fā)首先是要從該物種中獲取重復序列兩側的序列信息并設計引物，而后才能被利用；而且甘蔗的dna序列數(shù)據(jù)有限，目前僅開發(fā)了幾千條ssr引物，與其它禾本科植物相比較而言，甘蔗基因組較大，目前開發(fā)的甘蔗ssr引物數(shù)量還遠遠不夠。而est-ssr分子標記方法，是通過從互補dna(cdna)分子中測序得到表達序列標簽(expressedsequencetag，est)，然后再從轉錄出來的標簽序列中篩選鑒別ssr位點，通過ssr位點設計引物，再用pcr進行驗證。隨著各種作物est的迅速發(fā)展及數(shù)據(jù)庫中est序列的不斷增加，通過數(shù)據(jù)庫搜尋法獲得est-ssr標記的報道越來越多，如棉花、大麥、玉米、水稻、黑麥、高粱、小麥、大豆、葡萄、松樹、牧草、向日葵和柑橘等中已見報道。但是，目前，還未見甘蔗est-ssr開發(fā)和應用的相關報道。技術實現(xiàn)要素：鑒于上述內(nèi)容，有必要提供一種甘蔗est-ssr標記的制備方法及應用，能有效提高甘蔗種質(zhì)資源多態(tài)性分析的效率。為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種甘蔗est-ssr標記的制備方法，所述方法包括利用甘蔗轉錄組序列通過篩選鑒別相應種質(zhì)的ssr位點，然后利用ssr位點兩側的核苷酸序列設計引物得到est-ssr標記引物，再將est-ssr標記引物對相應的種質(zhì)dna進行標記，利用毛細管凝膠電泳驗證標記結果。進一步的，所述est-ssr標記引物為序列表中est1-2～est4-21引物中的任意1對。進一步的，所述est-ssr標記引物應用于甘蔗和/或甘蔗近緣種屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。進一步的，所述est-ssr標記引物應用于甘蔗種質(zhì)資源的可轉移性分析和聚類分析。進一步的，所述甘蔗種質(zhì)資源優(yōu)選為桂糖35號。。本發(fā)明具有如下有益效果：1、雖然在應用上est-ssr和gssr都有著相同的用途，但由于est-ssr來自于轉錄區(qū)，與位置不確定的gssr相比具有更高的應用價值：與gssr相比，雖然由于est-ssr的保守性限制了標記的多態(tài)性，但est-ssr高質(zhì)量標記的比率要比gssr高；est-ssr具有更好的通用性，這在親緣物種之間校正基因組連鎖圖譜和比較作圖方面有很高的利用價值；該標記從轉錄區(qū)域產(chǎn)生，通常都代表著某種功能，這種功能可以通過序列同源性比對獲得，還能為功能基因提供“絕對”標記，能對重要性狀的等位基因進行直接鑒定，更有利于連鎖基因的研究工作；當est-ssr用于種質(zhì)資源評價時，它表現(xiàn)的是轉錄區(qū)的差異，因而能夠反映出“真實的遺傳多樣性”；在應用于分子標記輔助選擇時，est-ssr位于控制目標性狀的基因內(nèi)部，可以進行直接的等位基因選擇。2、本申請利用不斷更新的甘蔗dbest數(shù)據(jù)庫和本單位開展的甘蔗轉錄組測序調(diào)查項目所獲得的數(shù)據(jù)庫開發(fā)出新的est-ssr，能快速、簡便的對甘蔗及其近緣種屬進行遺傳多樣性分析檢測其多態(tài)性，再選擇多態(tài)性高的遺傳標記對本單位近年來所育新材料與系譜親本間的遺傳關系進行分析，可為甘蔗遺傳多樣性和遺傳關系的應用研究提供更多有效的ssr標記，從而為甘蔗在遺傳育種中的研究諸如qtl分析、親緣關系鑒定、遺傳多樣性研究及雜種優(yōu)勢預測等方面提供有價值的遺傳工具，并通過系譜親本間遺傳關系的研究為甘蔗育種親本的合理選配及甘蔗種質(zhì)的創(chuàng)新利用提供參考依據(jù)?！靖綀D說明】圖1是引物est1-9在guitang12(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖2是引物est1-9在guitang15(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖3是引物est1-9在guitang18(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖4是引物est1-9在guitang21(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖5是引物est1-9在guitang28(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖6是引物est1-9在guitang29(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖7是引物est1-9在guitang32(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖8是引物est1-9在guitang35(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖9是引物est1-9在guitang37(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖10是引物est1-9在guitang43(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖11是引物est1-9在guifu98-296(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖12是引物est1-9在roc16(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖13是引物est1-9在roc25(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖14是引物est1-9在yunzhe06-281(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖15是引物est1-9在yunzhe05-250(saccharumsp.)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖16是引物est1-9在badila(s.officinarum)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖17是引物est1-9在gxs85-30(s.spontaneum)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖18是引物est1-9在57ng208(s.robustum)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖19是引物est1-9在nagans(s.bareri)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖20是引物est1-9在guangxibamboocane(s.sinense)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖21是引物est1-9在gxb87-36(erianthusarundinaceus)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖22是引物est1-9在gxn1(narengaporphyrocoma)種質(zhì)的擴增毛細管電泳圖；圖23是甘蔗材料的upgma聚類分析樹狀圖?！揪唧w實施方式】為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。實施例：一種甘蔗est-ssr標記的制備方法，所述方法包括：(1)利用本單位開展的甘蔗轉錄組測序調(diào)查項目所獲得的數(shù)據(jù)庫開發(fā)出新的est-ssr引物，再將est-ssr標記引物對相應的種質(zhì)dna進行標記，利用毛細管凝膠電泳驗證標記結果；(2)上述est-ssr標記引物應用于甘蔗和/或甘蔗近緣種屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析；(3)上述est-ssr標記引物還應用于甘蔗種質(zhì)資源的可轉移性分析和聚類分析。具體研究方法為：1、實驗材料：甘蔗屬及其近緣屬(河八王屬和蔗茅屬)材料；2、分析方法：對品種為桂糖35號(guitang35)的甘蔗品種進行轉錄組測序，將所獲得的序列與ncbi的甘蔗dbest數(shù)據(jù)庫進行比對，在比對結果中針對測序所獲得的新序列篩查ssr位點并設計引物，則所設計引物的ssr位點均為新位點。應用桂糖35號(guitang35)作為模板進行驗證，經(jīng)驗證，共有50對est-ssr標記引物(見表1)符合要求，將50對est-ssr標記引物分別對22個不同親本的甘蔗栽培種材料進行標記，并利用毛細管凝膠電泳驗證標記結果，繪制聚類分析樹狀圖。表1對上述的est-ssr標記引物進行多態(tài)性分析，結果顯示(表2)：表2：由上表可知，上述est-ssr標記引物的多態(tài)性信息含量(pic)為0.76(est1-7)～0.95(est1-9等)，平均值為0.92，表現(xiàn)出高多態(tài)性；對開發(fā)的est-ssr標記在甘蔗近緣屬間可轉移性進行分析，表明，在蔗茅屬(erianthusmichanx)和河八王屬(narengabor)間的可轉移性不高(平均值分別為24.0％和33.8％)，然而在河八王屬中的可轉移性明顯優(yōu)于蔗茅屬。應用開發(fā)的50對est-ssr標記引物對22個不同種屬的甘蔗材料(表3)進行毛細管電泳擴增，(本申請僅列舉est1-9引物對不同種屬的甘蔗材料進行擴增的電泳圖，結果如圖1-圖22所示)，根據(jù)顯示的結果進行聚類分析得到如圖23所示的甘蔗材料upgma聚類分析樹狀圖。表3樣品編號名稱親本1guitang12(saccharumsp.)印度419×川者57-4162guitang15(saccharumsp.)華南56-12×內(nèi)江59-7823guitang18(saccharumsp.)cp65-357×f1724guitang21(saccharumsp.)贛蔗76-65×崖城71-3745guitang28(saccharumsp.)cp80-1018×cp89-14756guitang29(saccharumsp.)崖城94-46×roc227guitang32(saccharumsp.)粵糖91-976×roc18guitang35(saccharumsp.)roc23×cp84-11989guitang37(saccharumsp.)湛蔗92-126×cp72-208610guitang43(saccharumsp.)粵糖85-177×gt92-6611guifu98-296(saccharumsp.)guitang91-131經(jīng)coγ射線輻照誘變選育而成12roc16(saccharumsp.)f171×74-57513roc25(saccharumsp.)79-6048×69-46314yunzhe06-281(saccharumsp.)德蔗93-88×云瑞99-15515yunzhe05-250(saccharumsp.)粵農(nóng)73-204×cp72-121016badila(s.officinarum)17gxs85-30(s.spontaneum)1857ng208(s.robustum)19nagans(s.bareri)20guangxibamboocane(s.sinense)21gxb87-36(erianthusarundinaceus)22gxn1(narengaporphyrocoma)根據(jù)圖23的甘蔗材料upgma聚類分析樹狀圖表明：供試22份材料的遺傳相似系數(shù)為0.390～0.733，變幅較大，平均值為0.591，其中guitang29與斑茅gxb87-36的相似系數(shù)最小，guitang32與guitang35的相似系數(shù)最大；蔗茅屬中的斑茅gxb87-36(erianthusarundinaceus)在聚類圖中形成單獨的分支，作為甘蔗的近緣屬，表現(xiàn)出與其它資源較遠的親緣關系；在相似系數(shù)0.46處的21份材料聚成兩個類群，第1類群的20個材料均屬于甘蔗屬，第2類群的gxn1(narengaporphyrocoma)為河八王屬；在相似系數(shù)0.49處，又將21份甘蔗屬材料聚成兩個小類群，第1小類群的20份材料包含了所有的栽培種、熱帶種中的拔地拉(badila)、大莖野生種(57ng208)、印度種(nagans)與中國種(guangxibamboocane)，第2小類群為割手密(gxs85-30)，與預期的親緣關系密切程度相一致。最終將結果繪制成聚類分析樹狀圖(圖11)：綜上所述，使用本發(fā)明的est-ssr標記方法和本申請人設計的50對est-ssr標記引物能有效提高標記的效率，對甘蔗屬種質(zhì)進行親緣分析。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制。序列表<110>廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所<120>一種甘蔗est-ssr標記的制備方法及應用<130>2010<160>100<170>patentinversion3.5<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-2上游引物<400>1accctccagccaccctt17<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-2下游引物<400>2gcatacaccatccatccct19<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-5上游引物<400>3aggcgggaccgaacaa16<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-5下游引物<400>4gacctcatctgccggactg19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est1-6上游引物<400>5attagtggctctgccgttat20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est1-6下游引物<400>6caatggtagagtgaaagtggg21<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-7上游引物<400>7tctgcccaagacggtaa17<210>8<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-7下游引物<400>8gctgcctgagttgctga17<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est1-9上游引物<400>9aaccttccttccgctccc18<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-9下游引物<400>10gaatcttgaccgcctttgg19<210>11<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-12上游引物<400>11tgcgagctgcgatgga16<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-12下游引物<400>12ggttgggacctgggttg17<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-15上游引物<400>13ttattcagacctccgctac19<210>14<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-15下游引物<400>14acgacggctcaggaat16<210>15<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-16上游引物<400>15ccaaacccaaggctca16<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est1-16下游引物<400>16atgcgactaaaggttgaaga20<210>17<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-17上游引物<400>17ggaatccaagccaacg16<210>18<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-17下游引物<400>18ccacggctgctcttct16<210>19<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-18上游引物<400>19ccttcacctggaatcgt17<210>20<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-18下游引物<400>20caagcccaactcctcaa17<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-19上游引物<400>21cataaccacttggaccacc19<210>22<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est1-19下游引物<400>22ccgttgacctgcgaat16<210>23<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-21上游引物<400>23gaagttgatgccagatggg19<210>24<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est1-21下游引物<400>24tcccttcctgccaactct18<210>25<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est1-22上游引物<400>25ctcggcgtcaccgtcat17<210>26<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est1-22下游引物<400>26gagggcttctcatcatcactag22<210>27<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-23上游引物<400>27aatccgccagcacctaccc19<210>28<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-23下游引物<400>28gatctcgtcgggcaggtcc19<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est1-24上游引物<400>29attcacttcactgcccaagc20<210>30<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est1-24下游引物<400>30tagggacggagggagtagg19<210>31<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est1-26上游引物<400>31atggaggaggcaaagaga18<210>32<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est1-26下游引物<400>32aatgcgaacaaacagacg18<210>33<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-1上游引物<400>33aggcaagaaccccaagc17<210>34<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est2-1下游引物<400>34attccacaaccaaaaccc18<210>35<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-2上游引物<400>35aaccgaacctgaactcc17<210>36<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-2下游引物<400>36agatgccgacgacctg16<210>37<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-4上游引物<400>37tcatccaacgccaccg16<210>38<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-4下游引物<400>38actgcccgcaccacatc17<210>39<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est2-7上游引物<400>39gcagctttctcgattccc18<210>40<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est2-7下游引物<400>40ctccaccaaaccctccct18<210>41<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est2-8上游引物<400>41cattgctactcgcattcacc20<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est2-8下游引物<400>42accaccaacagccttctcat20<210>43<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-9上游引物<400>43atccgggaccatgaatc17<210>44<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-9下游引物<400>44ttgccaaacgaacacg16<210>45<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est2-10上游引物<400>45gaaccacatcaccctatacca21<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est2-10下游引物<400>46cagcagcttccagtcatcaa20<210>47<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-11上游引物<400>47caggactcgcttctccg17<210>48<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-11下游引物<400>48catcatcttcttcggcaac19<210>49<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-13上游引物<400>49taatctgctctgcgtctcc19<210>50<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-13下游引物<400>50ggtgatccagggcgtgt17<210>51<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-14上游引物<400>51aagcataatcaggcaaagg19<210>52<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-14下游引物<400>52gccaactccgtctccac17<210>53<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est2-15上游引物<400>53acgagtaggagtaggacgacg21<210>54<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-15下游引物<400>54cccatagcctgcctgatag19<210>55<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est2-18上游引物<400>55ctgagaacgaaatgggtg18<210>56<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-18下游引物<400>56ccaccttgcttgggac16<210>57<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-19上游引物<400>57cgtgctggaaccgtaa16<210>58<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-19下游引物<400>58gccgcagaaacaatca16<210>59<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est2-20上游引物<400>59ataagatccgtggtagggtaa21<210>60<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-20下游引物<400>60agggacgaagggagtgc17<210>61<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est2-21上游引物<400>61gcggaggagggaggacaa18<210>62<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est2-21下游引物<400>62atgagtagcgactgtgcgagtg22<210>63<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est2-22上游引物<400>63gtcatttgaagcatcagcattg22<210>64<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-22下游引物<400>64tgagggtgggaaagagcag19<210>65<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est2-23上游引物<400>65caccaaccctagatccaccc20<210>66<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-23下游引物<400>66acggcccgaggcaagt16<210>67<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-27上游引物<400>67gccgcaaaccatgctgaac19<210>68<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est2-27下游引物<400>68gagcatcatccctccattcaca22<210>69<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-28上游引物<400>69gccagcaaatctcccac17<210>70<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est2-28下游引物<400>70aaggctgagttaataagatgca22<210>71<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-32上游引物<400>71gcgtaacatcttcttgctg19<210>72<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-32下游引物<400>72cgttgtcgtccccact16<210>73<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est2-34上游引物<400>73gccgcacatccgttgg16<210>74<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est2-34下游引物<400>74gaggaagaggagttcgaggg20<210>75<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est2-35上游引物<400>75ggtgatggtgtcgcttgtg19<210>76<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est2-35下游引物<400>76accgtgctgtccctgct17<210>77<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est3-3上游引物<400>77accgagtggagtagtaggc19<210>78<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est3-3下游引物<400>78gggttggaaggaggaag17<210>79<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est4-2上游引物<400>79tccttccccgactcttctcc20<210>80<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est4-2下游引物<400>80gcatgagctggccacgc17<210>81<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est4-3上游引物<400>81ggcttccagatttcctctactt22<210>82<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est4-3下游引物<400>82gcaacgcagcatttcca17<210>83<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est4-5上游引物<400>83ggtcgttgctcttcagttgc20<210>84<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est4-5下游引物<400>84cctcttccgattctttccttt21<210>85<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est4-6上游引物<400>85cgaatggcaggaacga16<210>86<211>16<212>dna<213>人工序列<223>est4-6下游引物<400>86cgccagttgagggaga16<210>87<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est4-8上游引物<400>87tgttcagcttggctactgc19<210>88<211>18<212>dna<213>人工序列<223>est4-8下游引物<400>88tcctgattccttccgttg18<210>89<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est4-9上游引物<400>89ctggatgaccgccgtat17<210>90<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est4-9下游引物<400>90agaacaagtggcaacaagc19<210>91<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est4-12上游引物<400>91agtcgttctcggagctgtcg20<210>92<211>17<212>dna<213>人工序列<223>est4-12下游引物<400>92ccctggcggcagttgtt17<210>93<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est4-14上游引物<400>93cagtagcagcaacagtagtaac22<210>94<211>19<212>dna<213>人工序列<223>est4-14下游引物<400>94tgctactaccaacctcgtc19<210>95<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est4-17上游引物<400>95ccctcgaactcctcttcctc20<210>96<211>22<212>dna<213>人工序列<223>est4-17下游引物<400>96aggggttagaatagaacccatg22<210>97<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est4-19上游引物<400>97cagcctcttctttccgttca20<210>98<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est4-19下游引物<400>98tcaaacaggagcagcagaaag21<210>99<211>20<212>dna<213>人工序列<223>est4-21上游引物<400>99ctggctaacaaacaagggac20<210>100<211>21<212>dna<213>人工序列<223>est4-21下游引物<400>100caccgtcattgagaccagata21當前第1頁12