本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種乳液中進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法。

背景技術(shù)：

乳液pcr的原理簡單來說是通過單鏈dna模板與捕獲磁珠結(jié)合后，pcr反應(yīng)試劑與油相混合形成乳液，得到一系列皮升大小的小液滴-小而獨立的反應(yīng)室。在這個微小的反應(yīng)室中進行擴增反應(yīng)，擴增后的產(chǎn)物富集在磁珠上，通過離心和磁分離收集磁珠，洗脫后對磁珠上的pcr產(chǎn)物進行測序。該技術(shù)可將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應(yīng)，最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

然而，目前數(shù)字pcr技術(shù)的由于pcr反應(yīng)在乳液中的擴增效率不高，導(dǎo)致磁珠捕獲擴增產(chǎn)物進行熒光標記后信號放大效果有限，通常需要對信號進行二次放大等步驟，需要使用更為精密的儀器以及較昂貴的控溫設(shè)備，這在一定程度上制約了其在核酸數(shù)字定量上的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明旨在提出一種乳液中進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法，該方法較于乳液pcr有更高的核酸擴增效率和信號放大效果，而且本發(fā)明待測的mirna樣本無需預(yù)先進行pcr擴增，在擴增反應(yīng)后直接破乳即可上樣分析。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

一種用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法的乳液，包括水相和油相：

所述水相由生物素標記的引物與親和素標記的磁珠復(fù)合物、目標mirna介導(dǎo)的連接dna模板、熒光標記的引物、反應(yīng)緩沖溶液、bst聚合酶按體積比(3～6)：(0.5～2)：(2～6)：(8～13)：(3～8)混合均勻；

所述油相由dc5225c、dc749、ar20按質(zhì)量比(3～5)：(2～4)：(2～4)混合均勻；

將所述水相和油相按體積比1:2～1:3加入反應(yīng)管中研磨，得到穩(wěn)定乳液。

進一步的，乳液在環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法中的應(yīng)用。

進一步的，所述的乳液進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法包括如下步驟：

(1)制備引物標記的磁珠；

(2)以目標mirna為模板設(shè)計兩條dna發(fā)夾探針h1和h2；

(3)在目標存在的情況下，目標mirna與h1和h2退火雜交，用連接酶將h1和h2連接形成雙啞鈴dna結(jié)構(gòu)；

(4)配制乳液；

(5)將反應(yīng)管放入恒溫水浴槽中，在55℃～65℃下反應(yīng)4～6小時，得到磁性顆粒-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物-熒光標記引物的復(fù)合物；

(6)在反應(yīng)管中加入1毫升異丙醇，破乳洗滌兩次，離心后棄去上清收集磁珠；

(7)將步驟(4)得到的磁珠進行顯微鏡檢測，對產(chǎn)生熒光信號的磁珠進行計數(shù)；

(8)將步驟(4)得到的磁珠進行流式檢測，對產(chǎn)生熒光信號的磁珠進行計數(shù)。

進一步的，步驟(1)所述制備引物標記的磁珠是通過如下步驟制備的：

在離心管中用tes緩沖液洗滌鏈霉親和素包被的直徑為0.5～2μm的磁珠，洗滌兩次后，向磁珠中加入7～15μm生物素標記的引物，室溫下孵育15～30分鐘，得到制備生物素標記的引物與親和素標記的磁珠復(fù)合物；

進一步的，所述水相由生物素標記的引物與親和素標記的磁珠復(fù)合物、目標mirna介導(dǎo)的連接dna模板、熒光標記的引物、反應(yīng)緩沖溶液、bst聚合酶按體積比3：1：4：10：6混合均勻。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的一種乳液中進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明所述的一種乳液中進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法，該方法較于乳液pcr有更高的mirna擴增效率和信號放大效果，而且mirna樣本無需預(yù)先進行pcr擴增，并在擴增反應(yīng)后直接破乳即可上樣分析。

(2)本發(fā)明所述的一種乳液中進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法，此方法對目標序列沒有依賴性，只要進行配套的引物設(shè)計即可開展目標mirna的數(shù)字分析

(3)本發(fā)明所述的一種乳液中進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字mirna分析方法，該方法不需要復(fù)雜的芯片、溫控設(shè)備等成本較高的設(shè)備即可完成對mirna的數(shù)字分析，簡化了實驗步驟，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的優(yōu)勢縮短了時間、提高了效率，為基因診斷和基因治療等研究提供了一種工藝簡單、信號穩(wěn)定、具有較高的靈敏度與準確性的數(shù)字mirna分析手段。

附圖說明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1中為整個分析方法的流程圖；

圖2為磁珠在乳液中的反應(yīng)原理圖；

圖3為乳液的顯微鏡成像圖，白色箭頭標記為引物標記的磁珠；

圖4為破乳收收集磁珠的顯微鏡成像圖；

圖5為流式細胞計數(shù)圖；

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖來詳細說明本發(fā)明。

實施例1基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的數(shù)字分析方法檢測mirna

(1)引物設(shè)計：針對mirna設(shè)計環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物。序列如下：

(2)制備引物標記的磁珠：

在1.5毫升微量離心管中，用100μltes緩沖液(20mmtris-hcl，ph值7.5；1mnacl)洗滌100μl(7-12×10⁸)鏈霉親和素包被的直徑1μm磁珠。每次洗滌后，將管放在磁鐵上1分鐘以濃縮珠子然后用吸管除去上清液，洗滌2次后重新懸浮在100μltes緩沖液中。取10μm生物素標記的引物加入磁珠中，室溫下孵育15～30分鐘。反應(yīng)后的磁珠用100μltes緩沖液洗滌三次，備用。

(2)以目標mirna為模板設(shè)計兩條dna發(fā)夾探針h1和h2；

(3)在目標存在的情況下，目標mirna與h1和h2退火雜交，用連接酶將h1和h2連接形成雙啞鈴dna結(jié)構(gòu)；

(4)制備乳液：a、水相制備：將生物素標記的引物(fip)-鏈霉親和素磁珠復(fù)合物3μl，目標mirna介導(dǎo)的連接dna模版(5μm)、bp(5μm)各4μl，熒光標記的引物bip(40μm)4μl,thermopol(10x)緩沖溶液10μl，目標mirna1μl、mgso4(10mm)4μl，dntp(10mm)14μl，bsa(1mg/ml)1μl，bst2.0warmstart聚合酶6μl，混合均勻，加滅菌超純水至100μl。b、油相制備：將dc5225c、dc749、ar20以質(zhì)量比為40％、30％、30％混合均勻。c、形成乳液：將一個直徑3毫米鋼珠加入2毫升的反應(yīng)管中，加入100μ水相反應(yīng)液和200μl油相，調(diào)整組織研磨器的頻率28hz,研磨時間1min，使其形成水相液滴直徑約為3-10μm的穩(wěn)定乳液，圖3中白色箭頭標記為引物標記的磁珠。

(5)lamp反應(yīng)：將反應(yīng)管放入恒溫水浴中，在63℃下反應(yīng)1小時，

圖4中黑色點為陰性磁珠，說明該磁珠所在的液滴未發(fā)生環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

反應(yīng)，不存在目標mirna。白色點為陽性磁珠，說明該磁珠所在的液滴

發(fā)生了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)，存在目標mirna。

(6)破乳收集磁珠：在反應(yīng)管中加入1毫升異丙醇，破乳洗滌兩次，離心后棄去上清收集磁珠。用100μltes緩沖液(20mmtris-hcl，ph值7.5；100mmnacl)洗滌磁珠三次，待測；

(7)顯微鏡檢測：調(diào)整熒光顯微鏡參數(shù)，在與熒光標記的內(nèi)引物匹配的640熒光通道下可以拍攝到產(chǎn)生cy5熒光信號的磁珠，即為陽性磁珠，得到陽性磁珠的數(shù)量與目標mirna的加入量成正比；

(8)流式檢測：調(diào)整流式細胞儀參數(shù)，對產(chǎn)生cy5熒光信號的磁珠進行計數(shù)，得到陽性磁珠的數(shù)量與目標mirna的加入量成正比，圖5中，左峰為陰性磁珠計數(shù)，右峰為陽性磁珠計數(shù)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。